Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы. Перспективы изучения василька шероховатого и создания на его основе гепатопротективного средства
1.1 Василек шероховатый: систематическое положение, ботаническая характеристика, ареал, местообитание, сырьевые ресурсы 10
1.2 Современное состояние исследований растений рода василек 12
1.3 Проблема свободнорадикального окисления при заболеваниях гепатобилиарной системы и поиска новых фитосредств 22
Глава 2 Материалы и методы исследования
2.1 Объект исследования 27
2.2 Методы и методики химического исследования 27
2.3 Методики анатомического исследования надземной части василька шероховатого 35
2.4 Методики товароведческого исследования 36
2.5 Статистическая обработка результатов 36
Глава 3 Исследование комплекса биологически активных веществ василька шероховатого 37
3.1 Изучение фенольного комплекса василька шероховатого 37
3.2 Выделение и исследование полисахаридного комплекса василька шероховатого 43
Глава 4 Исследование антноксидантной активности сухих экстрактов василька шероховатого 55
Глава 5 Химическое исследование сухого экстракта, полученного на 70% этаноле
5.1 Изучение химического состава фракций экстракта, полученного на 70% этаноле 62
5.2 Выделение индивидуальных соединений из этилацетатной фракции и установление их строения 67
Глава 6 Разработка проекта ФС «Василька шероховатого трава»
6.1 Результаты анатомического изучения надземной части василька шероховатого 92
6.2 Товароведческая характеристика надземной части василька шероховатого 94
6.3 Разработка методик определения подлинности надземной части василька шероховатого 97
6.4 Разработка методик определения количественного содержания флавоноидов и гидроксикоричных кислот в надземной части василька шероховатого 99
6.5 Изучение динамики накопления ФЛ и ГКК в различных органах, в зависимости от фазы развития и места сбора василька шероховатого 105
Глава 7 Разработка способа получения сухого экстракта василька шероховатого и оценка его качества 110
Выводы 118
Литература 120
- Современное состояние исследований растений рода василек
- Изучение фенольного комплекса василька шероховатого
- Изучение химического состава фракций экстракта, полученного на 70% этаноле
- Товароведческая характеристика надземной части василька шероховатого
Введение к работе
Актуальность. Препараты из лекарственных растений, содержащие целый комплекс биологически активных веществ, действуют на различные системы организма, в том числе и на систему антиоксидантной защиты. Это обеспечивает возможность их использования для профилактики и комплексной терапии свободно-радикальных патологий. Ухудшение экологической обстановки, повышенное содержание нежелательных примесей в пище, растущее потребление медикаментов, алкогольная интоксикация – эти и другие факторы привели к увеличению частоты токсических поражений печени, которая является основным органом синтеза и депонирования антиоксидантов и центром детоксикации прооксидантных веществ. Таким образом, подавление процессов активации свободно-радикального окисления, играющих ключевую роль в повреждении липидов мембран гепатоцитов в патогенезе заболеваний органов гепатобилиарной системы, является важным свойством гепатозащитных препаратов.
Среди веществ с гепатозащитными свойствами выделяют сравнительно небольшую группу гепатопротекторов, обладающих терапевтическим влиянием на печень (легалон, карсил, силимар, силибор, катерген, эссенциале и другие) (Оковитый С.В., 2006).
По популярности среди лекарственных средств растительного происхождения, применяемых per os, можно выделить группу препаратов расторопши (карсил, легалон, силибор и силимар), большинство из которых являются импортными. Важно отметить, что получение данных препаратов производится по трудоемкой технологии с использованием токсических и дорогих растворителей (хлороформ, тетрахлорметан и др.), что ведет к удорожанию продукции.
Поэтому актуальна проблема разработки новых отечественных гепатопротективных фитопрепаратов, обладающих антиоксидантным действием, на основе растений Сибири и Дальнего Востока. Перспективным в этом плане является василек шероховатый (Centaurea scabiosa (L.) Maxim., сем. Asteraceae), применяемый в народной медицине при болезнях печени.
Цель работы – на основании фармакогностического изучения обосновать возможность применения василька шероховатого в качестве источника гепатопротективного средства, обладающего антиоксидантным действием.
Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Провести фитохимический анализ надземной части василька шероховатого и изучить компонентный состав доминирующих групп биологически активных соединений.
-
На основании изучения антиоксидантной активности сухих экстрактов из надземной части василька шероховатого обосновать выбор экстракта для исследования гепатопротективной активности.
-
Выделить из фармакологически активного сухого экстракта индивидуальные компоненты и идентифицировать соединения с помощью химических, хроматографических и спектральных методов.
-
Разработать проект нормативной документации на предлагаемый новый вид лекарственного сырья – василька шероховатого траву (Centaurea scabiosa herba).
-
На основе проведенных исследований предложить способ получения сухого экстракта с гепатопротективной и антиоксидантной активностями и определить основные показатели его качества.
Научная новизна. Впервые проведен общий фитохимический анализ надземной части василька шероховатого и изучен компонентный состав доминирующих групп биологически активных соединений (фенольных соединений и полисахаридов). Хроматографией на бумаге в надземной части C. scabiosa L. идентифицировали кофейную, феруловую, коричную, п-кумаровую, галловую и салициловую кислоты, рутин, байкалеин, изокверцитрин.
Впервые из василька шероховатого выделены флавоноиды гиспидулин, апигенин, лютеолин, хризоэриол и сложные эфиры карбоновых кислот, а также выделены скутелляреин, кофейная кислота, b-ситостерол, ранее описанные для данного растения.
Разработаны методики качественного обнаружения и количественного определения в надземной части василька шероховатого флавоноидов и гидроксикоричных кислот.
Впервые экспериментально обоснована возможность использования василька шероховатого в качестве источника гепатопротекторного средства, обладающего антиоксидантным действием, и целесообразность его стандартизации по флавоноидам и гидроксикоричным кислотам. Изучена динамика накопления указанных групп биологически активных веществ.
Впервые проведено анатомическое исследование надземной части василька шероховатого и выявлены диагностические микроскопические признаки вида.
На основе проведенных исследований предложен способ получения сухого экстракта с гепатопротективной и антиоксидантной активностями и определены основные показатели его качества.
Практическая значимость. На основании проведенных фармакогностических исследований для медицинской практики предложен новый вид лекарственного растительного сырья в качестве гепатопротекторного средства, обладающего антиоксидантным действием.
Результаты микроскопических и фитохимических исследований использованы для разработки методик диагностики и определения качества надземной части василька шероховатого и заложены в проект Фармакопейной статьи (ФС) «Василька шероховатого трава».
Для углубленных фармакологических исследований в качестве гепатопротективного средства предложен сухой экстракт василька шероховатого, полученный на 70% этаноле.
Получено положительное решение о выдаче патента на изобретение по заявке №2009100195/15(000290) «Гепатопротективное средство, обладающее антиоксидантной активностью, и способ его получения» (18 января 2011 г).
Внедрение. Для студентов и аспирантов кафедр фармацевтической химии и фармакогнозии с курсами ботаники и экологии ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России, а также кафедры физиологии растений и биотехнологии Биологического института ГОУ ВПО «Томский государственный университет» разработаны методические рекомендации на тему «Методика последовательного количественного определения флавоноидов и гидроксикоричных кислот в лекарственном растительном сырье», в которых использованы материалы диссертации.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Результаты фитохимического изучения надземной части василька шероховатого.
-
Данные изучения антиоксидантной активности экстрактов и фракций василька шероховатого.
-
Результаты исследований гепатопротективной активности сухого экстракта василька шероховатого, полученного на 70% этаноле.
-
Результаты исследований по выделению, идентификации и установлению структуры соединений из василька шероховатого.
-
Методики стандартизации надземной части и сухого экстракта василька шероховатого, полученного на 70% этаноле.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на 63-й и 65-ой Международной студенческой научной конференции им Н.И. Пирогова (Томск, 2004, 2006), IV Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар, 2006), II Международной научной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений (Алматы, 2007), V Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Уфа, 2008), «Конгрессе молодых ученых» (Томск, 2008), IV Всероссийской научной конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2009).
Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (№ государственной регистрации 01200602076 от 14. 02. 2006 г.).
Публикации. По результатам работы опубликовано 15 печатных работ, в том числе 4 статьи в периодических изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Экспериментальные исследования по теме диссертации выполнены на кафедре фармацевтической химии СибГМУ (г. Томск), а также в сотрудничестве с коллективами следующих научных организаций: Центральная научно-исследовательская лаборатория (ЦНИЛ) СибГМУ (отделение биохимии), НИИ органической химии СО РАН (г. Новосибирск), НИИ Фармакологии ТНЦ СО РАМН (г. Томск), Томский политехнический университет (кафедра аналитической химии, г. Томск).
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 147 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, пяти глав экспериментальных исследований, выводов, списка литературы и приложений на 37 страницах. Работа иллюстрирована 30 таблицами, 31 рисунками. Библиографический указатель включает 267 источников литературы, из которых 85 зарубежных.
Современное состояние исследований растений рода василек
Василёк шероховатый {Centawea scabiosa L.), принадлежащий к семейству Asteraceae и рассматриваемый в данной работе, относится к роду Centawea, подроду Lopholoma, секцииLopholoma, ряду Scabiosiformes.
Centaurea scabiosa L. - представляет собой многолетнее травянистое растение с толстым вертикальным корнем, прямостоячим, ребристым, слегка паутинисто-пушистым, ветвистым стеблем 50 - 120 см высотой, при основании волокнистым. Листья немного волосистые или почти голые, 10 — 25 см длиной и 2 - 4 см шириной, перисто- реже дваждыперисторассечённые на продолговатые ланцетовидные или линейно-ланцетовидные, коротко заострённые, цельнокрайние, реже редкозубчатые доли, нижние -черешковые, иногда лировидно-перистые, редко цельные. Корзинки шаровидные в числе нескольких сидят поодиночке на конце стебля и ветвей, со слегка паутинной обвёрткой, 1 — 3 см в поперечнике; наружные листочки корзинки яйцевидно-треугольные, зелёные, иногда красноватые, те и другие с треугольным, черноватым гребенчато-бахромчатым придатком с бахромками 1 - 2 см длиной, по краям до половины окаймлённые черноватой, более коротко-бахромчатой каймой, внутренние — линейные, лишь на верхушке расширенные в продолговатый или почти круглый бахромчатый придаток. Бахромки на листочках обвёртки 1-2 мм длиной. Цветы лилово-пурпуровые, краевые - бесплодные, длиннее срединных, семянки тонко-пушистые, 4-5 мм длиной, беловатые, серовато- или черновато-коричневые с беловатой или сероватой летучкой (рис. 1).
Произрастает василёк шероховатый в Европейской части России, на Кавказе, Западной и Восточной Сибири, Приморском крае. За пределами России встречается в Северном Иране, в Западном Казахстане, странах Западной Европы, Малой Азии. Василёк шероховатый растёт в степной и лесной областях, по пойменным, суходольным лугам, залежам, окраинам полей, луговым склонам, разреженным лесам и их опушкам, по сосновым борам. Запасы Centaurea scabiosa L. в РФ довольно значительны [77, 132, 155, 156].
Важно отметить, что как фармакологически, так и химически василек шероховатый мало изучен. Поэтому для оценки перспектив и направления химико-фармакологического исследования этого вида явилось необходимым изучение и обобщение данных литературы о результатах исследований различных видов рода Centaurea.
Род Centaurea включает в себя свыше 800 видов, распространённых в Европе, Северной Африке, Южной и Северной Америке, значительной части Азии. На территории бывшего СССР встречаются 160 видов.
В литературе имеются краткие сведения об изучении многих представителей этого рода. Так А.А. Федоровым [132] описаны тридцать видов рода василек, произрастающих преимущественно на территориях России, Средней Азии и на Кавказе, и даны краткие сведения об изучении еще свыше пятидесяти видов. На территории Сибири и Дальнего Востока произрастают 16 видов василька, в том числе С. scabiosa L., из которых в некоторой степени изучены С. ruthenica L., С. jacea L. и С. sibirica L. [132]; данные о других видах (С. stenolepis L., С. Marschalliana L., С. KiyJoviana L., С. calva L., С. adpressa L. и др.) практически отсутствуют.
Большой интерес к изучению различных видов василька проявляют ученые Европы (Франции, Испании, Египта, Турции, Югославии и др.), стран Северной Африки (Марокко, Алжира), стран Южной Америки (Чили, Аргентина) и Казахстана. Такой интерес вызван тем, что род Centaurea, широко распространенный по всей территории Земного шара, издавна применяется в народной медицине и отличается разнообразным химическим составом. Характерным для большинства видов рода Centaurea, согласно данным народной медицины, является ярко выраженное диуретическое и гипотензивное действия [1, 132, 134, 155, 156]. Официнальным является Centaurea cyanus L., его цветки применяются в качестве мочегонного средства [53]. В странах Средней Азии многие виды васильков применяются в качестве вяжущих, желчегонных средств, при желтухе, депрессии, неврастении и заболеваниях глаз. С. transcaucasica Sons, ex Grossh. рекомендован для применения при функциональных расстройствах деятельности сердца и некоторых формах гипертонической болезни [81, 132]. Фармакологические исследования некоторых представителей рода василек показали, что экстракты, изучаемых видов, наряду с диуретическим и гипотензивным действиями, оказывают влияние на сердце, гладкую мускулатуру, проявляют гипогликемическое действие [36, 262, 263]. Широко известны антибактериальная и антифунгинальная активности большинства видов васильков (С. phrygia L., С. pseudophrygia Dobrocz., С. iberica Trev. Ex Spreng, С. jacea L., C. ruthenica Lam., C. maroccana, C. napifolia и др.) [13, 28, 33, 36, 58, 253]. Экстракт С. sibirica L. в эксперименте оказывает противовоспалительное, спазмолитическое и противосудорожное действия, не токсичен [106, 132]. При изучении С. depressa Bieb., произрастающего, главным образом, на юге Европейской части России, в Крыму и на Кавказе, было выяснено, что сумма флавоноидов обладает диуретическим, а сумма сесквитерпеновых лактонов - антибактериальным действиями [132]. Исследователями чилийского университета (г. Сантьяго) и института органической химии и биохимии в г. Бонне (Германия) высказано предположение, что стеролы и их гликозиды вносят вклад в гипогликемическое действие экстрактов из Centaurеа melitensis L. [261] Имеются сведения о возможности применения видов рода Centaurea в , качестве противоопухолевых препаратов [28, 87, 171].
Изучение фенольного комплекса василька шероховатого
Количественное определение суммы флавоноидов проводили методом дифференциальной спектрофотометрии [53, 65, 116, 139]. 2. Определение количественного содержания водорастворимых полисахаридов (ВРПС) и пектиновых веществ проводили гравиметрическим методом [53], а также содержание ВРПС общеизвестным спектрофотометрическим методом на основе реакции с антронсерным реактивом [140, 160]. 3. Количественное определение каротиноидов проводили с помощью спектрофотометрического метода при длине волны 450 нм после предварительной экстракции каротиноидов ацетоном и очистки от сопутствующих веществ [160, 175]. Количественное определение хлорофилла осуществляли также спектрофотометрическим методом [175]. 4. Количественное определение аскорбиновой кислоты проводили используя 1) титрование 2,6-дихлорфенолиндофенолятом натрия [53]; 2) метод йодатометрии [52]. 5. Дубильные вещества определяли перманганатометрически [53, 54]. Антиоксидантую активность экстрактов определяли двумя методами: 1. Волътамперометрический метод, в основе которого лежит модельная реакция электровосстановления кислорода, протекающая на электроде по механизму, аналогичному восстановлению кислорода в тканях и клетках организма. Методика эксперимента заключалась в съемке вольтамперограмм катодного восстановления кислорода с помощью вольтамперометрического анализатора ТА-2 («Техноаналит», г. Томск). В качестве индикаторного электрода использовали ртутно-пленочный электрод, электродом сравнения служил хлоридсеребряный электрод. Фоновым электролитом служил водный раствор (0,1 моль/л) NaC104.
Известно, что концентрация 02 подвержена колебаниям в зависимости от температуры и давления окружающей среды, поэтому в качестве сигнала использовали относительное изменение высоты катодного пика 02. Для устранения необходимости контроля кислорода в исследуемом растворе перед исследованием каждого экстракта раствор перемешивали в открытой ячейке до полного насыщения фонового раствора кислородом воздуха. При этом концентрация 02 остаётся неизменной от раствора к раствору и равна его растворимости в данном растворителе при нормальных условиях.
После успокоения раствора снимали катодную вольтамперограмм} тока электровосстановления (ЭВ) 02 в постоянно-токовом режиме. Рабочий диапазон потенциалов 0 - 0,6 В, скорость развертки потенциала W=20 мВ/с, время перемешивания раствора 10 с, время успокоения 20 с. Съемку катодной вольтамперограммы тока ЭВ 02 повторяли не менее пяти раз. В результате получали значение предельного тока ЭВ 02 в отсутствии вещества в растворе (/нач).
Для оценки влияния исследуемых веществ рассматривали зависимость предельного тока ЭВ 02 от времени взаимодействия вещества с активными кислородными радикалами. Отбор пробы осуществляли по следующему алгоритму: брали навеску 0,1 г и растворяли в 10 мл соответствующего водно-этанольного раствора до концентрации 0,01 г/мл. Из приготовленного раствора отбирали аликвоты 0,1 мл и 1,0 мл и доводили объём до 10 мл (получаемая рабочая концентрация 0,0001 г/мл и 0,001 г/мл соответственно).
Исследование проводили следующим образом: снимали вольтамперограмму тока ЭВ 02 в отсутствии исследуемого вещества (фоновая кривая), в ячейку добавляли исследуемое вещество с известной концентрацией, на индикаторный электрод подавали значение потенциала предельного тока ЭВ СЬ (для того, чтобы генерировать в растворе активные кислородные радикалы 02 и HCV) в течение 3 мин. Далее снимали катодную вольтамперограмму ЭВ 02 при тех же условиях, при которых получали фоновую кривую. Измерения повторяли не менее 5 раз через определенный промежуток времени и каждый раз оценивали значение предельного тока ЭВ Оз (Л). По полученным данным строили зависимость относительного изменения тока ЭВ 02 (1—L) от времени протекания реакции взаимодействия вещества с активными кислородными радикалами (t). АО А исследуемых препаратов оценивали по кинетическому критерию антиоксидантной активности К (мкмоль/л-мин), который отражает количество прореагировавших с образцом кислородных радикалов и рассчитывается на основе значений тангенса угла наклона полученных прямолинейных зависимостей [228]: где Со2 - концентрация кислорода в исходном растворе без вещества, (256 мкмоль/л); Ij — текущее значение предельного тока ЭВ СЬ, мкА; /нач - значение предельного тока ЭВ СЬ в отсутствие вещества в растворе, мкА; t - время протекания процесса, мин.
Расчет среднего кинетического критерия антиоксидантной активности проводили из 5 параллельных определений каждого образца. В качестве препаратов сравнения использовали дигидрокверцетин (Sigma) и аскорбиновую кислоту [114].
Спектрофотометрический метод определения антиоксидантной активности, основанный на определении спектрофотометрически реакционной способности исследуемых веществ со стабильным радикалом дифенилпикрилгидразилом (ДФПГ) [239]. Электронные спектры экстрактов и выбранных стандартных образцов в УФ и видимой областях спектра снимали на саморегистрирующем приборе Perkin-Elmer-402 (США), СФ-46 (Россия), "Specord иУ-УІ8"(Германия) в кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм. ИК-спектры получали на спектрофотометре UR-20 и UR-75 (Германия) в дисках из калия бромида, в гексановом и хлороформном растворе. Масс-спектры получали на приборах Finnigan МАТ 8200, LKB-2091 Bromma (Швеция) и MX-13 03 (Россия) с прямым вводом образца в ионный источник при ионизирующем напряжении 12 и 70 Эв и температуре 295-300С.
Хроматограммы и масс-спектры снимали на приборе хромато-масс-спектрометре Finnigan Trace DSQ (США) с использованием колонки TR5MS, тип фазы 5% фенилполифилфенилен-силоксан, длиной 30 м, диаметром 0,53мм/мкм, в качестве газа-носителя использовали гелий, растворитель -хлороформ; Т термостата от 30 до 350 С; скорость нагрева 10/мин; сканирование 33-650 а.е.м.
ВЭЖ хроматограммы снимали на приборе ВЭЖ хроматографе на колонке Gemini СІ8 (п=25см, d=4,6 мм, размер частиц — 5 мкм), элюирование проводили смесью: муравьиная кислота-метанол (91:9) с градиентом последнего, конечная система муравьиная кислота-метанол (9:91). Температура растворителей, образцов и колонки поддерживалась при 25 С; образцы растворяли в метаноле и наносили на колонку в количестве 10-15 \Л, после чего проводили разделение. УФ-спектры веществ в диапазоне длин волн 200-400 нм регистрировались непосредственно в момент проведения хроматографии с использованием оптического детектора с диодной линейкой (1200 DAD Detector (Agilent Technologies, США)).
Изучение химического состава фракций экстракта, полученного на 70% этаноле
Для выявления анатомических признаков сырья были приготовлены микроскопические препараты: поперечный срез стебля, плоскостные препараты листа, листочков обвёртки (соцветие — корзинка), лепестков венчика.
Стебель имеет пучковое строение, пучки открытые коллатеральные, расположены по кругу в один ряд (рис. 1В, приложение 4). Под эпидермисом видны участки склеренхимы в ребрах, кроме того склеренхима окружает флоэму и ксилему проводящего пучка. Ксилема состоит из 4 — 5 вертикальных рядов сосудов (рис. 1 А, 1Б, приложение 4). При рассмотрении листа с поверхности видны клетки эпидермиса слегка извилистые, многоугольной формы. Устьица, расположенные с двух сторон листа, многочисленные, широкораскрытые, окружены 3-4, реже 5-тью клетками эпидермиса (рис. ЗА, ЗБ, приложение 4). Основными диагностическими признаками являются 3 типа волосков: 1. Головчатые, очень мелкие, червеобразноизогнутые, имеющие маленькую шаровидную головку и ножку, состоящую из 3 - 4 клеток (рис. ЗА, ЗБ, приложение 4). 2. Простые волоски, состоящие из 3 - 5 клеток, с одноклеточным основанием (рис. 4А, приложение 4). 3. Простые волоски, состоящие из 5 — 8 клеток, с многоклеточным основанием (рис. 2Б, 4В, приложение 4). В местах прикрепления простых волосков клетки эпидермиса образуют розетку (рис. 4Б, приложение 4). Характерно чёткое расположение простых волосков по краю листа и беспорядочное по всей поверхности (рис. 2А, 2Б, приложение 4). В мезофилле листа имеются многочисленные включения округлой формы (рис. 2Б, ЗБ, приложение 4). Вдоль жилок расположены секреторные ходы с жёлто-бурым содержимым (рис. 2Б, приложение 4). Описание микроскопии лепестков венчика и листочков обвертки При рассмотрении лепестков с поверхности видны удлиненные клетки эпидермиса с четковидными утолщениями стенок (рис. 5Г, приложение 4). Кроме того характерно, как и для листа, расположение секреторных ходов с жёлто-бурым содержимым по жилкам лепестков (рис. 5А, приложение 4). Встречаются зерна пыльцы округлой формы (рис. 5Б, приложение 4). Эпидермис листочков обвёртки состоит из удлиненных клеток четырёхугольной формы (рис. 6Б, приложение 4). На поверхности листочка расположены многочисленные простые волоски, имеющие одноклеточное основание овальной формы (рис. 6А, 6Б, приложение 4). По краю и на поверхности щетинок листочков обвертки расположены простые тонкие вытянутые волоски (рис. 6В, приложение 4). Клетки основания щетинок заполнены бурым содержимым (рис. 6В, приложение 4). Цельное сырьё. Представляет собой цельные или частично измельченные стебли длиной до 50 см, диаметром до 5 мм с листьями и цветочными корзинками. Стебли прямые, ребристые, слегка паутинисто-пушистые. Листья немного волосистые или почти голые, перисто- реже дважды перисторассечённые на продолговатые ланцетовидные или линейно-ланцетовидные доли, нижние — черешковые. Корзинки шаровидные в числе нескольких сидят по одиночке на конце стебля и ветвей, наружные листочки корзинки яйцевидно треугольные, зелёные, иногда красноватые, по краям до половины окаймлённые черноватой, бахромчатой каймой. Цветы лилово-пурпуровые, семянки с сероватой летучкой. Цвет стеблей и листьев серовато-зеленый, запах слабый, вкус слегка вяжущий, горьковатый. Измельченное сырьё. Кусочки стеблей, листьев и соцветий различной формы, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 5 мм. Цвет кусочков стеблей и листьев серовато-зеленый, цветков — лилово-пурпуровый, запах слабый, вкус слегка вяжущий, горьковатый. Для оценки качества надземной части василька шероховатого нами определены ее основные числовые показатели по методикам Государственной фармакопеи XI [53]. Для составления ФС использовали 5 экспериментальных образцов сырья василька шероховатого, собранного из разных мест сбора в 2005 - 2006 г.г. Влажность исследуемого сырья определяли нагреванием навески растительного сырья в сушильном шкафу при температуре 100-105С по ГФ XI, Т. 1, с. 285-286. Потеря в массе сырья при высушивании колебалась от 6,50% до 8,5%. Поэтому предлагаем внести в нормативную документацию показатель влажности не более 9,0%. Для растительного сырья необходимо определять содержание золы общей, образующейся при его сжигании и показывающей накопление минеральных веществ в сырье, в том числе при его загрязнении. Кроме того, определяется содержание золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористово дор одной. При анализе образцов василька шероховатого показатель золы общей составлял 5,75 - 7,15%. В нормативном документе данный показатель не должен превышать 8%. Содержание золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной, определено в незначительных количествах 0,9 — 1,5%, поэтому в НД данный показатель не должен превышать 1,8%. Примеси. В качестве примесей в растительном сырье рассматриваются части того же растения, не являющиеся сырьем, части других неядовитых растений (органическая примесь) и минеральная примесь (песок, земля, камни).
В анализируемых образцах травы василька шероховатого практически отсутствовали органическая и минеральная примеси, но поскольку данные показатели являются важными для лекарственного растительного сырья, в проект ФС нами внесено их минимальное содержание: органической примеси не более 1%, минеральной - не более 0,5%.
Измельчённость сырья (результаты ситового анализа). Для этого использовали набор сит с диаметром отверстий от 0,5 до 7 мм. Как показывают результаты анализа (табл. 18), измельченное сырье василька шероховатого состоит из частиц размером 2-4 мм (85-90%); на сите с диаметром отверстий 6 мм остается 7—10% сырья, а через сито с диаметром отверстий 0,5 мм проходит 5-8% частиц. Таким образом, измельченное сырье василька шероховатого представляет собой практически однородное по размерам сырьё. В проекте ФС содержание измельченных частиц размером менее 0,5 мм составляет не более 9%, а частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 6 мм, не более 12%.
Товароведческая характеристика надземной части василька шероховатого
Температура также является значительным критерием, влияющим на процесс экстрагирования. Скорость экстрагирования при повышении температуры увеличивается. Однако различные БАВ требуют для своего извлечения разные температурные условия, следоательно, необходим избирательный подход. В нашем исследовании мы сочли целесообразным не использовать температуру более 8 5 С, поскольку фенольные соединения -термолабильные вещества.
Полученные экспериментальные данные (табл. 27) свидетельствуют о том, что максимальный выход ФЛ и ГКК достигается при температуре 75 80С. Таким образом, установленные в ходе работы оптимальные параметры экстракционного процесса позволили предложить способ получения средства, обладающего гепатопротекторным и антиоксидантным действиями, заключающийся в экстракции надземной части василька шероховатого, измельченной до размеров частиц 2-4 мм, 70% этанолом при температуре 75— 80С в течение 1 часа при соотношении сырье-экстрагент 1:20 — 1:25 и кратности экстракции 3 с последующим удалением экстрагента при пониженном давлении и высушиванием досуха полученного экстракта. Согласно требованиям ОСТ № 91500.05.001-00 и ГФ XI для сухого экстракта василька шероховатого были определены такие показатели, как подлинность, потеря в массе при высушивании, количественное содержание основных действующих групп БАВ (ФЛ и ГКК), сульфатная зола и содержание тяжелых металлов. Поскольку при стандартизации должен соблюдаться принцип системного подхода, заключающегося в унификации методик анализа в ряду лекарственное растительное сырьё — лекарственная субстанция -лекарственная форма [160] в основу стандартизации сухого экстракта положены методики определения подлинности и количественного содержания ФЛ и ГКК, описанные ранее для надземной части. Описание. Сухой экстракт василька шероховатого представляет собой тёмно-коричневый сыпучий порошок со слабым специфическим запахом. Умеренно растворим в 70% этаноле, мало растворим в этаноле, воде очищенной, ацетоне, этилацетате, очень мало растворим в хлороформе и практически не растворим в эфире и гексане. Потеря в массе при высушивании определена на 6 образцах по методу ГФ XI (вып.1, с. 176) - 1,0000 г (точная масса) сухого экстракта высушивают в сушильном шкафу при 100-105С до постоянной массы. Потеря в массе составляет 3,30±0,03%.
Определение сульфатной золы проведено по методике, описанной в ГФ XI (вып. 2, с. 25). В зольном остатке определяли присутствие тяжелых металлов по методике ГФ XI (вып. 1, с. 172). 1,0000 г (точная масса) сухого экстракта выдерживает испытания на тяжелые металлы (не более 0,01%).
Методика определения подлинности сухого экстракта василька шероховатого. Около 0,1500 г (точная масса) сухого экстракта растворяют при нагревании (60С) в 20 мл 70% этанола в мерной колбе вместимостью 100 мл и после охлаждения доводят объем 70% этанолом до метки - раствор А. 20 мкл раствора А микрошприцем наносят на линию старта пластинки «Сорбфил» размером 10 х 4 см. Рядом в качестве стандартного образца наносят 2 мкл 0,1% этанольного раствора ГСО рутина. Пластинку высушивают на воздухе в течение 5 мин, затем помещают вертикально в камеру с подобранной системой растворителей этилацетат - муравьиная кислота - вода (10:2:3) и хроматографируют восходящим способом в предварительно насыщенной в течение 30 мин камере. Когда фронт растворителя пройдет около 9 см от линии старта, пластинку вынимают из камеры, высушивают на воздухе в течение 10 мин, затем просматривают пластинку в фильтрованнном УФ-свете до и после обработки хроматограммы 10% этанольным раствором алюминия хлорида.
В УФ-свете на хроматограмме обнаруживается не менее трех пятен коричневого цвета, а также пятна голубого и фиолетового цвета. Коричневое пятно с Rf 0,55, принадлежит рутину. При проявлении хроматограммы 10% этанольным раствором алюминия хлорида и последующем нагревании в течение 2-3 мин при температуре 100 - 105С в сушильном шкафу, проявляется не менее трех пятен желтого цвета с Rf 0,45; 0,55 и 0,6.
Методика количественного определения суммы флавоноидов и гидроксикоричных кислот в сухом экстракте василька шероховатого.
Около 0,1500 г (точная масса) сухого экстракта растворяют при нагревании (60С) в 20 мл 70% этанола в мерной колбе вместимостью 100 мл (Vkj) и после охлаждения доводят объем 70%) этанолом до метки (раствор А). В мерную колбу вместимостью 25 мл (V ) помещают 2 мл раствора А, 4 мл 10% этанольного раствора алюминия хлорида и 0,1 мл кислоты хлористоводородной разведенной, оставляют на 20 мин, затем объём раствора доводят до метки 70% этанолом и измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 410 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют смесь из 2 мл раствора А и 0,1 мл кислоты хлористоводородной разведенной, доведенную 70% этанолом до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.
