Введение к работе
Актуальность проблемы, К настоящему времени накоплен значительный объём клинических данных, на основании которых можно утверждать, что изменения реологических характеристик крови, объединяемые под общим понятием синдром повышенной вязкости крови (СПВК) [Dintenfass L., 1971], являются важным звеном в цепи нарушений, развивающихся при сердечнососудистой патологии [Покалев Г.М., 1984; Ганнуппсина И.В. и соавт., 1987; Танашян М.М., 1991, Kwaan Н.С. et. al., 1999; Gomez E. et. al., 2000]. Более пристальное изучение гемореологических расстройств привело к изменению взглядов на механизмы внутрисосудистых нарушений кровоснабжения органов. Доказано активное участие реологических механизмов в нарушении кровообращения, реологическая окклюзия рассматривается в качестве инициирующего фактора "запуска" плазменных коагуляционных механизмов, приводящих к фибринообразованию и закупорке сосудов патологическими тромбо- и эритро-цитарными агрегатами [Люсов В.А. и соавт., 1988; Савенков М.П., 1988]. В микроциркуляторном русле, когда диаметр сосудов сопоставим или меньше диаметра эритроцитов, изменение формы и размера красных клеток крови, ухудшение их деформируемости приводит к ослаблению микроциркуляции, что в конечном итоге ведёт к уменьшению локального кровотока, гипоксии тканей и, как следствие этого, снижение их функциональной активности [Савенков МЛ., 1988, Cicco G. et. al., 1999].
В связи с этим не вызывает сомнения значимость изучения возможности фармакологического воздействия на синдром повышенной вязкости крови при патологических процессах в организме и поиск эффективных средств его коррекции. Вместе с тем, решение данной задачи затруднено вследствие многообразия и неоднозначной взаимосвязи факторов, определяющих вязкостные свойства крови на различных уровнях (макрореологический, клеточный, микрореологический) [Coull В.М. et. al., 1986].
Корригирующая терапия реологических свойств крови должна быть многокомпонентной и направленной на различные звенья патологического процесса, приводящего к повышению вязкости. Данные литературы о фармакологической коррекции СПВК немногочисленны, спектр лекарственных средств, влияющих на реологические свойства крови ограничен. Препараты, которым свойственна гемореологическая активность (пентоксифиллин, тиклопедин, та-накан) оказывают влияние лишь на отдельные компоненты синдрома повышенной вязкости крови [Hossman К.-А. et. al., 1981; Люсов В.А. и соавт., 1988; Coul В.М. et. al., 1991] либо недостаточно снижают тяжесть проявления СПВК в целом [Габриэлян Э.С. и соавт., 1985; Савенков М.П., 1988; Ветшал W. Jr. et. al., 1994]. Вместе с тем, на современном этапе надежды на принципиально новые методы фармакотерапии внутрисосудистых нарушений крови связывают с перспективами применения лекарственных средств, способных предотвращать или существенно уменьшать патологические сдвиги гемореологических параметров.
«И6ЛИОТЄКА І
С учетом сведений об антирадикальной и антиокислительной активности флавоноидов и их способности влиять на агрегацию эритроцитов [Лакин К.М. и соавт., 1976; Левтов В.А. и соавт., 1982] представляется перспективным исследовать гемореологические свойства индивидуальных биофлавоноидов и экстрактов ряда растений Сибири, содержащих различные классы флавоноидных соединений.
В качестве возможных источников перспективных гемореологических средств могут также выступать экстракты экдистероидсодержащих растений. Фитоэкдистероиды обладают широким спектром фармакологической активности, включающим анаболический, гиполипидемический, противовоспалительный, мембраностабилизирующий и другие эффекты [Сыров В.Н. и соавт., 1994].
Цель исследования.
Проведение поиска перспективных гемореологических средств среди экстрактов из флафоноид- и экдистероидсодержащих растений и разработка на их основе гемореологических препаратов.
Основные задачи исследования:
-
Разработать адекватные клиническим ситуациям модели синдрома повышенной вязкости крови in vitro и in vivo для отбора и углубленного изучения гемореологических средств.
-
Провести поиск перспективных гемореологических средств на основе экстрактов из флавоноид- и экдистероидсодержащих растений.
-
Осуществить углубленное изучение гемореологической активности экстрактов из флавоноид- и экдистероидсодержащих растений при курсовом введении на различных моделях сердечно-сосудистой патологии (ишемия мозга, инфаркт миокарда, артериальная гипертензия), сопровождающихся СПВК
-
Оценить влияние асковертина, экстрактов манжетки обыкновенной, левзей сафлоровидной и лихниса хальцедонского на форму эритроцитов при ишемии головного мозга, инфаркте миокарда и артериальной гипертензии.
5 Исследовать липидный состав мембран эритроцитов на моделях синдрома повышенной вязкости крови и в условиях его фармакологической коррекции асковертином, экстрактами манжетки обыкновенной, левзей сафлоровидной и лихниса хальцедонского.
-
Изучить церебро- и кардиопротекторное действие исследуемых средств.
-
Оценить эффективность клинического применения асковертина при дисциркуляторной энцефалопатии и ишемической болезни сердца
Научная новизна. Разработаны модели СПВК in vitro и in vivo, воспроизводящие основные феномены, присущие гемореологическим расстройствам, развивающимся при сердечно-сосудистой патологии и позволяющие проводить быстрый и эффективный поиск и отбор средств, обладающих гемореологической активностью.
Исследованиями, проведенными на модели СПВК in vitro установлено, что кверцдг^йц и^кдистерону обладают гемореологической активностью и их
'; '" >ґіТ№,гЯ* \
влияние на вязкость крови, агрегацию и деформируемость эритроцитов носит дозозависимый характер; диквертин проявляет гемореологический эффект сопоставимый с танаканом, а смесь диквертина с аскорбиновой кислотой в соотношении 1:2 превосходит танакан по влиянию на деформируемость эритроцитов. Доказано, что флавоноид- и экдистероидсодержащие растения являются перспективным источником для поиска и разработки средств с гемореологиче-ской активностью.
Показано, что флавоноидсодержащие (асковертин, экстракты манжетки обыкновенной и горечавки крупнолистной) и экдистероидсодержащие (экстракты смолевки двудомной, смолевки татарской, лихниса хальцедонского и левзей сафлоровидной) средства при курсовом введении эффективно ограничивают развитие синдрома повышенной вязкости крови на моделях сердечнососудистой патологии за счет влияния как на клеточные, так и плазменные факторы, определяющие вязкостные свойства крови.
Проведенные исследования позволили установить, что асковертин, экстракты манжетки обыкновенной, левзей сафлоровидной и лихниса хальцедонского на моделях сердечно-сосудистой патологии ограничивают процессы деградации эритроцитов: повышается количество дискоцитов и снижается число эритроцитов с необратимо измененной формой. Доказано, что существенным компонентом механизма действия исследуемых средств является влияние на липидный состав эритроцитарных мембран: препараты ограничивают снижение как общего количества липидов, так и фосфолипидной фракции и препятствуют избыточному накоплению лизофосфолипидов.
Получены данные о том, что препараты с гемореологической активностью на моделях нарушения кровообращения проявляют церебро- и кардиопро-текторные свойства.
В клинико-лабораторных исследованиях асковертина установлено положительное действие на гемореологические показатели у больных с дисциркуля-торной энцефалопатией и ишемической болезнью сердца.
Научно-практическая ценность. Разработан новый оригинальный метод для оценки in vitro гемореологической активности препаратов (патент РФ №2110850). Получены данные, свидетельствующие о гемореологической активности экдистерона (патент РФ №2160592), диквертина (патент РФ №2141320), смеси диквертина и аскорбиновой кислоты (патент РФ №2150282), экстракта левзей сафлоровидной жидкого (патент РФ №2138285) и сухого (патент РФ №2191027), лихниса хальцедонского (патент РФ №2138284).
Результаты изучения гемореологической активности асковертина положены в основу материалов, по которым департамент государственного контроля качества, эффективности и безопасности лекарственных средств и медицинской техники МЗ РФ принял решение о проведении клинических исследований препарата (протокол № 198 от 19 февраля 2001). Завершившиеся клинические исследования асковертина показали его высокую эффективность и обосновывают целесообразность включения препарата в комплексную терапию сердечно-сосудистых заболеваний.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на 2-м съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1995), научной конференции, посвященной памяти ЛН. Березнеговской (Томск, 1996), 1-й Всероссийской конференции по ботаническому ресурсоведению (Санкт-Петербург, 1996), научной итоговой конференции НИИФ ТНЦ РАМН (Томск, 1996), международном совещании "Физиолого-биохимические аспекты изучения лекарственных растений" (Новосибирск, 1998), международном семинаре 'Традиционная медицина - теоретические и практические аспекты" (Улан-Удэ, 1998), международной конференции "Свободнорадикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты" (Санкт-Петербург, 1999), Ш международном съезде "Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения" (Санкт-Петербург-Пушкин, 1999), Ш Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1998), VI Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1999), конференции "Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии" (Санкт-Петербург, 1999), конференции "Актуальные проблемы фармакологии и поиска новых лекарственных препаратов" (Томск, 1999), I молодежной научной конференции Новосибирского центра СО РАМН (Новосибирск, 1999), конференции молодых ученых "Современные проблемы фундаментальной и клинической медицины" (Томск, 1999), международной научной конференции "Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств" (Томск, 2000), П Российской конференции молодых ученых России с международным участием (Москва, 2001), международной конференции по гемореоло-гии (Ярославль, 2001), международном съезде "Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения" (Санкт-Петербург, 2001), XXI международной конференции по полифенолам (Мара-кеш, Марокко, 2002).
Публикации. По теме диссертации опубликованы 58 печатных работ Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав с изложением результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы. Диссертация изложена на 341 странице машинописного текста, содержит 124 таблицы и 29 рисунков Указатель литературы включает 233 отечественных и 204 иностранных источника.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Эксперименты проведены на 550 крысах-самцах Вистар и ПО крысах-самцах линии SHR (spontaneously hypertensive rats) массой 200-250 г. Клинико-лабораторные исследования гемореологической активности асковертина были проведены на 128 добровольцах.
В экспериментах использовали субстанцию диквертина производства ООО "Флавир" г. Иркутск Диквертин является суммарным флавоноидным экстрактом из древесины лиственницы сиирской или даурской, который содержит не менее 90% флавоноида дигидрокверцитина. Сухие экстракты флавоне-
идсодержащих растений (манжетки обыкновенной, горечавки крупнолистной, володушки многожильчатой, полыни Сиверса) предоставлены профессором Г.И. Калинкиной, сухие экстракты растений рода смолевок, лихниса хальце-донского и экдистерон - к.б н. Л.Н Зибаревой, сухой экстракт левзей сафлоро-видной - профессором Е.А. Красновым. Лекарственный препарат "Асковертин таблетки" для клинических исследований был изготовлен на ОАО «Асфарма» и отвечал всем требованиям, предъявляемым к нему нормативной документацией. Каждая таблетка содержит 20 мг дигидрокверцетина и 50 мг аскорбиновой кислоты.
Экстракты вводили в 1% крахмальной слизи внутрижелудочно ежедневно (в течение 5-й дней на моделях ишемии мозга и инфаркта миокарда и 10-и дней на модели артериальной гипертензии). Контрольные животные получали экви-объемное количество 1% крахмальной слизи.
Исследовали следующие параметры, характеризующие реологические свойства крови: вязкость цельной крови, вязкость плазмы, гематокрит, спонтанную агрегацию эритроцитов, деформируемость эритроцитов и концентрацию фибриногена.
Относительную вязкость крови и плазмы измеряли методом капиллярной вискозиметрии на гемовискозиметре ВК-4, абсолютные значения вязкости (в сантипуазах) измеряли на ротационном вискозиметре АКР-2 Гематокрит определяли методом центрифугирования в стеклянных капиллярах на центрифуге МГЦ-8 и выражали в %. Количество фибриногена в плазме определяли на коа-гулометре KG-IV (Соппау) с использованием набора "Фибриноген-тест" фирмы "Технология-Стандарт" Исследование деформируемости эритроцитов проводили методом лазерной дифрактометрии, или эктапитометрии Конструкция установки для оценки деформируемости эритроцитов основана на эктацитометре, предложенном MBessis и N.Mohandas [1975]. Агрегацию эритроцитов исследовали силлектометрическим методом. Изучение морфологических особенностей эритроцитов осуществляли методом растровой электронной микроскопии [Ко-зинец Г.И. и соавт., 1984]. По форме эритроциты относили к различным типам в соответствии с классификациями предложенными Г.И. Козинцом и соавторами [1984] и Б В Поповым и соавторами [1981]
Тени эритроцитов, для изучения липидного состава мембран, получали по методу J.T. Dodge et al. [1963]. Количество белка в суспензии теней эритроцитов определяли микробиуретовым методом [Колб В.Г. и соавт., 1982]. Ли-пидный экстракт получали методом J Folch et al. [1957]. Уровень общих липи-дов в мембранах эритроцитов оценивали по цветной реакции с фосфорно-ванилиновым реактивом [Колб В.Г. и соавт., 1982]. Общее содержание фосфо-липидов определяли по реакции с ферротиоцианатом аммония [Пентюк А.А. и соавт., 1987] Содержание отдельных фракций липидов оценивали после разделения их методом одномерной восходящей хроматографии на пластинках «Silufol UV 254» [Финдлей Дж. и соавт., 1990].
Процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) в мембранах эритроцитов оценивали по содержанию в них диеновых коньюгатов и малонового ди-альдегида [Владимиров Ю.А. 1998].
Для оценки ЭЭГ применяли метод компрессированного спектрального анализа Регистрацию ЭЭГ проводили монополярным способом. Электрограммы записывали с помощью электроэнцефалографа "Эра-9" и магнитофафа "1296" фирмы "OTE-Biomedica". Фурье-анализ проводили на спектроанализа-торе той же фирмы.
В отдельной серии экспериментов методами световой [Боголепов И.И 1979, Жаботинский Ю М., 1965] и электронной микроскопии исследовали влияние препаратов на структурные изменения коры головного мозга крыс при ишемии.
Размер зоны инфаркта миокарда определяли по методике А X. Когана и соавторов [1984].
Системное артериальное давление у крыс определяли прямым методом
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета статистических профамм "Statistica for Windows 4.3".
![Фармакологическая коррекция нарушений энергетического обмена в печени при экспериментальной патологии [B]-окисления жирных кислот](/i/i/4397/408076.png "Фармакологическая коррекция нарушений энергетического обмена в печени при экспериментальной патологии [B]-окисления жирных кислот Тимофеев Максим Сергеевич")
