Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1 Патофизиология оксидативного стресса 13
1.1.1 Причины возникновения свободно-радикальных молекул и их основные типы 15
1.1.2 Последствия оксидативного стресса 21
1.2 Антиоксидантная система и внутриклеточный окислительно-восстановительный потенциал 23
1.3 Характеристика доксорубицин-индуцированного оксидативного стресса 30
1.4 Современные фармакологические подходы к снижению токсичности доксорубицина 37
Глава 2. Материалы и методы 46
2.1 Характеристика экспериментального материала 46
2.2 Методы исследования 46
Глава 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 52
3.1 Характеристика доксорубицин-индуцированного оксида тивного стресса 52
3.2 Влияние глицина иа доксорубицин-индуцированный окси-дативный стресс 59
3.3 Влияние мелатонина на доксорубицин-индуцированный оксидативный стресс 72
3.4 Влияние унитиола на доксорубицин-индуцированный оксидативный стресс 86
3.5 Влияние эритропоетина иа доксорубицин-индуцированный оксидативный стресс 99
3.6 Сравнительная характеристика влияния глицина, мелатонина, унитиола и эритропоетина на механизмы доксорубиции-индуцированного оксидативиого стресса , 115
Заключение 139
Выводы 145
Литература
- Причины возникновения свободно-радикальных молекул и их основные типы
- Характеристика доксорубицин-индуцированного оксидативного стресса
- Методы исследования
- Влияние мелатонина на доксорубицин-индуцированный оксидативный стресс
Введение к работе
Актуальность проблемы
Механизмы оксидативного стресса интенсивно изучаются с середины 60-х годов [165] и в наше время, актуальность и острота этой проблемы не только не снизилась, но и многократно возросла. В настоящий момент мало найдётся патологических состояний где-бы не было продемонстрировано сопутствующего развития оксидативного стресса. Одним из аспектов многогранной проблемы оксидативного стресса является изучение тканьспецифичных механизмов его течения [93].
Известно, что различные органы и ткани в разной степени подвержены действию агентов, вызывающих оксидативный стресс, и демонстрируют различную устойчивость в процессе реализации этого патологического состояния [4, 159]. По мнению ряда исследователей, это связано с различным уровнем экспрессии аитиоксидантных ферментов и особенностями метаболизма различных тканей [156, 39, 235]. Особенности метаболизма различных типов клеток связаны с устойчивостью к окислительному стрессу через внутриклеточный оксилительно-восстановительный потенциал (редокс-потенциал) [211], который является производным всех биохимических реакций клетки и вычисляется через отношение концентрации восстановленного глутатиона к концентрации оксиленного глу-татиона [116]. Редокс-потенциал напрямую связан с тяжестью оксидативного стресса, чем он ниже, тем интенсивнее процессы перекисиого оксиления биомолекул [217, 66]. От величины внутриклеточного редокс-потенциала и, в частности, от концентрации восстановленного глутатиона зависят также и такие процессы как, пролифереция, деление и программируемая клеточная смерть [74, 199]. Если интенсивное развитие оксидативыого стресса приводит к некрозу, то его медленное развитие запускает механизмы апоптоза [199]. В литературе имеется ряд противоречивых данных о зависимости между редокс-потенциалом, показателями перекисного окисления липидов и активностью антиоксидантних ферментов в различных тканях и типах клеток [4, 184, 211]. Понимание этих механизмов позволит целенаправленно воздействовать на внутриклеточные процессы путем активации тех или иных генов с целью смягчить последствия оксидативыого стресса и предотвратить его развитие по нежелательному сценарию, а именно воспрепятствовать запуску механизмов программируемой клеточной смерти [39, 169].
Нами была использована модель доксорубицин-индуцированного ок-сидативного стресса. Доксорубицин относится к семейству антрацикли-новых антибиотиков и применяется в онкологии. Однако, наличие у доксорубицина серьёзных кардиотоксических [218, 42, 76, 63] и, в меньшей степени, нефротоксических свойств [168, 40] существенно ограничивает его использование в онкологической практике. Существует несколько объяснений цитотоксичности доксорубицина на клеточном уровне, среди них: генерирование с участием ДОК свободных радикалов [190, 82], ингибирование ферментов репликации ДНК [219], ингибирование клеточных ферментов доксорубицинолом (веществом образующемся в результате биохимических превращений ДОК в клетке) [ИЗ], влиянием доксорубицина на механизмы внутриклеточного гомеостаза железа [167]. Однако, по мнению большинства исследователей, в нормальных тканях доксорубицин-индуцированная цитотоксичность связана, преимущественно, с образованием в клетке супероксиданион радикалов в результате редокс-циклической активности доксорубицина, что в итоге приводит к внутриклеточному оксидативиому стрессу [167, 88, 142, 91] и далее к апоптозу [43, 92]. В связи с этим, понимание механизмов токсичности доксорубицина может прояснить, как органспецифичные механизмы доксорубицин-индуцированного оксидативного стресса, так и механизмы оксидативного стресса в целом [44].
Для более глубокого понимания особенностей течения оксидативного стресса в различных тканях важно не только изучить воздействие специфического индуктора на эти ткани и изучить их ответ, но ещё более важно проанализировать роль различных участников системного клеточного ответа на оксидативный стресс. Клеточный метаболизм регулируется, в основном, за счёт влияния на экспрессию генов тех или иных белков и ферментов. К настоящему времени накоплен достаточно богатый экспериментальный материал в этой области, который позволяет подобрать узко-специфичные регуляторы экспрессии целевых генов. Исходя из целей нашего исследования и анализа литературных данных нами были выбраны вещества, способные увеличивать экспрессию генов ряда ферментов антиоксидантной защиты, а именно глутатион редук-тазы, глутатион-Б-трансферазы и НАД(Ф)Н:хинон оксидоредуктазы 1. Это мелатонин [180], глицин [118], унитиол [68] и эритропоетин [106].
Вместе с решением чисто теоретической задачи - изучения специфических тканевых механизмов развития оксидативного стресса, важной практической задачей является поиск фармакологических препаратов, снижающих токсичность доксорубицина. Снижение токсичности доксо-рубицина может быть достигнуто несколькими путями [52]. В частности, снижение токсичности доксорубицина способствует применение совместно с доксорубицином хелатора железа - дексразоксана [41, 221]. Хотя дек-сразоксан достаточно эффективно снимает кардиотоксические эффекты доксорубицина [103, 132], он, как оказалось, существенно снижает и эффективность доксорубицина в отношении лечения рака [117, 95]. Одним из перспективных подходов к снижению токсичности антрациклигювых антибиотиков заключаются в поиске веществ препятствующих развитию доксорубицин-индуцированного оксидативного стресса [52]. Применение антиоксидантов - витамина Е, N-ацетилцистеина и пробукола хотя и демонстрировало обнадёживающие результаты в опытах на лабораторных животных [88, 191], но оказалось малоэффективным при их применении у людей [38, 44]. К препаратам, которые потенциально обладают способ
ностью препятствовать развитию оксидативного стресса, можно отнести глицин [216], мелатонин [178, 136, 107], унитиол [31, 25] и эритропоетин [87, 98].
Цель исследования. Целью настоящего исследования явилось изучение органоспецифичных механизмов оксидативного стресса, индуцированного доксорубицином, и возможностей его коррекции.
. Задачи исследования
1. Изучить параметры внутриклеточной антиоксидантной защиты и показатели перекисного окисления липидов в ткани почек, печени и сердца после однократного введения доксорубицина.
2. Оценить функциональное состояние почек, печени и сердца после однократного введения доксорубицина.
3. Рассмотреть влияние экзогенных индукторов антиоксидантных ферментов на состояние системы ПОЛ-антиоксидант в ткани почек, печени и сердца после однократного введения доксорубицина.
4. Изучить роль индукции ферментов антиоксидантной защиты в регуляции функционального состояния почек, печени и сердца, после однократного введения доксорубицина.
5. Оценить целесообразность применения глицина, мелатонина, уни-тиола и эритропоетина с целью снижения токсичности доксорубицина.
Научная новизна исследования
Автором впервые установлено, что через 24 часа после введения доксорубицина (7,5 мг/кг) интенсивность оксидативного стресса наиболее выражена в тканях почек. В ткани печени признаки оксидативного стресса выражались только в снижение концентрации восстановленного
глутатиона. В ткани сердечной мышцы признаков оксидативного стресса не наблюдается.
Продемонстрирована связь между возникновением доксорубицин-индуцированного стресса и нарушением функций почек, что выражается в росте плазменных концентраций мочевины и креатинина.
Впервые показана возможность фармакологической коррекции доксорубицин-индуцированного оксидативного стресса глицином и эритропоетином. Впервые показано, что ключевым моментом нефропро-текторного действия глицина и эритропоетина является предотвращение ими доксорубицин-индуцированного снижения концентрации восстановленного глутатиона в тканях почек.
Продемонстрирована взаимосвязь между интенсивностью оксидативного стресса и активностью цитоплазматической глутатион редукта-зы. Показано, что увеличение активности глутатион-З-трансферазы и НАД(Ф)Н:хинон оксидоредуктазы 1 не приводит к снижению интенсивности доксорубицин-индуцированного оксидативного стресса
Основные положения выносимые на защиту
1. В сердечной мышце оксидативный стресс через 24 часа после введения доксорубицина не возникает.
2. Система ПО Л-антиоксидант печени и её функциональное состояние не изменяется при однократном введение доксорубицина.
3. В ткани почек на фоне однократного введения доксорубицина возникает оксидативный стресс и нарушается их функциональное состояние.
4. Применение глицина, мелатонина и эритропоетина предотвращает развитие оксидативного стресса, вызванного доксорубицином, в тканях почек и нормализует их функциональное состояние.
5. При развитии доксорубицин-индуцированного оксидативного стресса в тканях почек определяющую роль играет изменение величины
внутриклеточного редокс-потенциала, обеспечиваемого глутатион-редуктазой. Ингибирование редокс-циклических реакций доксору-бицина посредством НАД(Ф)Н:хинон оксидоредуктазы 1 и(или) увеличение конъюгации доксорубицина с глутатионом, катализируемое ферментом глутатион-Б-трансферазой, не предотвращает развитие оксидативного стресса в ткани почек.
6. Мелатонин, глицин и эритропоетин могут быть использованы с целью снижения доксорубицин-индуцированного оксидативного стресса.
Научно-практическая ценность работы
Показана взаимосвясь между интенсивностью оксидативного стресса и активностью цитоплазматической глутатион редуктазы в ткани почек. Установлена принципиальная возможность снижения доксорубицин-индуцированной токсичности глицином, мелатонином и эритропоетином. Полученные данные создают предпосылки для изучения возможности использования глицина, мелатонина и эритропоетина в онкологии с целью снижения токсичности антрациклиновых антибиотиков.
Апробация работы
Материалы, представленные в работе, докладывались на межкафедральных заседаниях сотрудников кафедр теоретического и терапевтического профиля медицинского факультета Ульяновского государственного университета, на ежегодных научно-практических межрегиональных конференциях врачей Ульяновской области (Ульяновск, 1999, 2000, 2004), международной конференции нефрологов (International society of Nephrology, Дрезден, 2004, участие в конференции поддержано грантом этого общества), XII международном конгрессе «Человек и лекарство», V-ежегодной конференции «Сердечная недостаточность 2004», международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Ялта-Гурзуф, 2005).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 7 статей ( в том числе 4 в центральных журналах) 5 тезисов (всероссийские и международные конференции и симпозиумы).
Объем и структура работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературных источников. Работа изложена на 168 страницах машинописного текста, включает 13 таблиц, 29 рисунков, 237 источников литературы.
Причины возникновения свободно-радикальных молекул и их основные типы
Более 50 лет назад свободные радикалы были обнаружены в тканях живых организмов [77]. Термин «оксидативный стресс» впервые был использован в 1966 г [165]. С тех пор проблема оксидативного стресса стала одной из центральных в биологии и медицине. В настоящее время под термином оксидативный стресс понимается остояние гомеостаза, характеризующееся увеличением содержания свободно-радикальных молекул и их продуктов [93].
Свободные радикалы - это молекулы, или отдельные атомы, имеющие неспаренные валентные электроны. Радикалы могут быть нейтральными или несущими заряд (катион-радикал и анион-радикал), короткоживу-щими или долгоживущими, что и определяет их активность [205]. Время жизни радикала зависит от множества причин. Как правило наиболее короткоживущими являются атомы или небольшие молекулы, например, ОН - гидроксил-радикал (радикалы принято изображать соответствующей химической формулой с точкой),Oj - супероксид-аыиои радикал [110].
Короткоживущими могут быть и большие радикальные молекулы, несущие, так называемый, центрированный радикал, в котором неспа-ренный электрон локализован около какого-либо атома этой молекулы (углерод-центрированные радикалы R—0-СЫВ—0... или углерод-кислород-центрированные радикалы R-00 ) [144]. Свободные радикалы в норме присутствуют в организме в очень низких концентрациях (10 5 - 10 9 М).
Около 5% потребляемого тканями кислорода превращается в свободные радикалы. Долгоживущими или стабильными являются радикалы, в которых неспарепный электрон делокализован. Аскорбат-радикал, радикалы коэнзима Q (бензосемихиион) и токофероксил-радикал являются примерами стабильных радикалов.
Стабильность центрированного радикала зависит от положения окружающих его химических групп в молекуле. Так, например, некоторые нитроксильные радикалы хотя и имеют электрон локализованный у атома кислорода, но стабильны из-за присутствия СНз-групп. которые "экранируют"радикалы-1ый центр от контакта с другими молекулами [23]. Короткоживущие свободные радикалы, обладая высокой активностью, дают начало цепным радикальным реакциям. В процессе цепной химической реакции постоянно происходит генерация свободно-радикальных молекул. На одну исчезнувшую в ходе реакции радикальную молекулу обязательно генерируется одна или более новых радикальных молекул. Именно поэтому один радикал может вызвать химическое изменение многих других не радикальных молекул, вовлекая их в цепную реакцию.
В зависимости от числа вновь возникших свободных радикалов цепные радикальные реакции подразделяют на неразветвлённые, разветвлённые и цепные реакции с вырожденным разветвлением. В случае иеразветвлённых цепных реакций на один исчезнувший радикал генерируется один новый. Если цепная реакция относится к классу разветвлённых, то вместо одного исчезнувшего радикала возникает два и более новых свободных радикалов; этот класс реакций характерен для неживой природы. Цепные радикальные реакции с вырожденным разветвлением характеризуются тем, что на один исчезнувший радикал генерируется один новый, но в ходе реакции дополнительно образуются промежуточные продукты, которые могут распадаться и давать жизнь новым радикальным молекулам [26].
Сталкиваясь с органической молекулой, свободный радикал отрывает от неё атом водорода и превращается в валентно-насыщенную молекулу. Подвергшаяся атаке молекула сама превращается в свободный радикал. Вновь образовавшийся радикал, может оторвать атом водорода от другой молекулы, прореагировать с другим радикалом или молекулой кислорода. В последнем случае образуется пероксильный радикал R—00", который, в свою очередь, отрывая атом водорода от другой молекулы, превращается в органический пероксид ROOH. Такой тип вырожденных цепных реакций называется процессом автоокисления углеводородов или свободно-радикальным окислением биомолекул(СРО) [32]. В биологической литературе такой процесс также называется процессом перекисного окисления липидов [1, 115]. Увеличение количества свободно-радикальных молекул приводит к возникновению оксида-тивного стресса [3]. Второй причиной оксидативного стресса может быть снижение эффективности антиоксидантних систем организма. Оксидативный стресс может быть локальным (при местном воспалении) и генерализованным (например, при радиоактивном облучении), умеренным (разрушению и модификации подвергаются отдельные биомолекулы) и сильным (приводит к гибели клеток или даже групп клеток) [55].
Характеристика доксорубицин-индуцированного оксидативного стресса
Нефропатия. хотя и не является причиной смертности при применении антрациклиновых антибиотиков, но может существенно влиять на развитие хронической формы антрациклиновой кардиомиопатии [41]. Применение доксорубицина у опытных животных на ранних стадиях гистологически характеризуется гломерулярными повреждениями, позднее развиваются канальцевые повреждения [63, 168], также отмечается протеиноурия, наблюдается повышение содержания креатинина и мочевины в плазме крови [40].
Токсичность антрациклиновых антибиотиков в отношении других органов проявляется менее сильно [41].
Механизм цитотоксичиости доксорубицина (ДОК) активно изучали в течении последних тридцати лет. Было предложено несколько гипотез, объясняющих хроническую и острую цитотоксичность ДОК, среди них: генерирование с участием ДОК свободных радикалов [82], ингиби-рование ферментов репликации ДНК [219]. нарушение экспрессии генов [148], нарушение функций и увеличение проницаемости митохондриаль-ной мембраны [29], активация высвобождения ионов Са2+ из саркоплазматического ретикулума [30, 210], интеркаляция в ядерную и митохон-дриальную ДНК [114], ингибирование клеточных ферментов доксору-бицинолом (веіцеством, которое образуется в результате биохимических превращений ДОК в клетке) [113]. Основным механизмом клеточной смерти при воздействии доксорубицина является апоптоз [44].
Доксорубицин вызывает гибель раковых клеток преимущественно через ингибирование ферментов репликации ДНК [18]. В результа те интеркаляции ДОК в спираль ДНК блокируется активность ДНК-топоизомеразы и, как следствие, нарушается клеточный цикл и запускается механизм программируемой клеточной смерти [44, 219]. Доксоруби-цин индуцирует апоптоз в нормальных и раковых клетках различными механизмами [92, 219, 113], что позволяет нам сделать предположение о возможности снижения токсического эффекта доксорубицина в отношении здоровых тканей без ущерба его антираковой активности.
В нормальных тканях ДОК-иидуцированная цитотоксичность связана преимущественно с образованием в клетке активных форм кислорода [82] и влиянием на механизмы внутриклеточного гомеостаза железа, что в итоге приводит к усугублению оксидативного стресса [167].
Доксорубицин, попадая в клетку, приводит к снижению концентрации восстановленного глутатиона, что в итоге приводит не только к интенсификации процессов перекисного окисления липидов, по и вызывает изменение внутриклеточного редокс-потенциала. Если активация перекисного окисления липидов происходит при достаточно сильном снижении редок-потенциала [184], то редокс-чувствительные сигнальные пути активизируются уже при небольших сдвигах в окислительно-восстановительном потенциале [143, 184]. Оксидативный стресс, влияя на редокс-чувствительные сигнальные механизмы может привести к запуску внутреннего механизма реализации апоптоза [199]. Впервые связь между апоптозом и оксидативным стрессом была обнаружена в середине 90-х годов в опытах на клеточных культурах. Добавление к культурам клеток диамида - вещества , которое окисляет SH-группы и приводит, тем самым, к снижению редокс-потенциала, вызывало значительное увеличение количества апоптозных клеток [228]. При этом важна не просто концентрация TSH, а именно соотношение rSIi/TSSr. Так, добавление к этим же клеткам L-бутионин сульфоксамина - ингибитора синтеза GSH, хотя и вызывало снижение концентрации ГЭН, но не приводило к апоптозу [228]. Дальнейшие исследования установили основных посредников, ответственных за связь между редокс-потенциалом и апоптозом, ими оказались белки семейства Всі-2 [122].
В зависимости от концентрации ДОК, цитотоксичность может реал изовываться либо через некроз, либо через апоптоз. При высоких концентрациях ДОК повреждение сердечной мышцы характеризуется разрушением митохондрий и саркоплазматического ретикулумма. Такой механизм цитотоксичности связан с повреждением мембран этих орга-нелл свободными радикалами, которые появляются в результате редокс-циклитеских реакций ДОК [44. 28]. В терапевтических дозах антрацик-лины не вызывают некроза, но могут привести к массированному апопто-зу клеток, что и наблюдается в сердечной мышце. Конкретный механизм запуска программы апоптоза пока не выяснен, но общие черты можно обрисовать. ДОК, генерируя дополнительное количество свободных радикалов, вызывает снижение внутриклеточного редокс-потенциала, что приводит к активации ряда сигнальных путей, основными из которых являются: проапоптотический - р53 [47] и антиапоптотические JAK/STAT и ERK1/2 [197]. Если активация р53-зависимых сигнальных путей будет преобладать, то запускается митохондриальный путь реализации программы апоптоза, что в итоге и вызывает клинически наблюдаемые признаки хронической кардиотоксичности антрациклииовых антибиотиков.
Одним из установленных механизмов генерации свободных радикалов с участием доксорубицииа является его окислительно-восстановительная активация. В результате такой активации ДОК (основная форма - хиной) превращается в семихинон (ДОК ), который может восстановить молекулу кислорода О2 до супероксид-анион радикала (0 р), превращаясь при этом опять в хинон [190]. В редокс-циклической активации доксорубицииа могут принимать участие некоторые флавопротеиновые редукта-зы [44], NO-синтетаза, цитохром Р450 редуктаза, НАДФИ-дегидрогеназы [82]. Для двух последних ферментов необходимо присутствие ионов Fe2+ для активации ДОК.
Методы исследования
Для приготовления общей дитоплазматической фракции почек печени и сердца органы растирали при 4 С в гомогенизаторе Поттера с буфером, содержавшим 0,1 М КС1. 1 ммоль ЭДТА, 20 ммоль Трис-HCl (рН=7,0), 1 ммоль фепилметилсульфонил фторида, далее экстракт центрифугировали при 10000 g в течении 5 минут, супернатант разливали по пробиркам V — 0,2 мл и хранили до использования при -20 С.
Кровь забирали из подключичной артерии в пластиковые пробирки и инкубировали в термостате при +37 С в течении 1 часа. Затем центрифугировали 1500 g 5 мин. Сыворотку разливали в пластиковые пробирки (V = 2,0 мл) и хранили до использования при -20 С. Для получения плазмы кровь забирали в пробирки, содержащие 1/4 объёма 3,8% цитрата натрия и центрифугировали при 3000 g в течении 10 мин. Плазму разливали в пластиковые пробирки (V — 2,0 мл) и хранили до использования при -20 С.
Активность глутатион редуктазы (ГР) в общей цитоплазматической фракции почек печени и сердца определяли спектрофотометрически при длине волны 340 нм и выражали через количество окисленного НАДФНгв мкмоль/мин на мг белка [70]. Реакционная смесь содержала: 1,0 ммоль глутатиона окисленного, 0,1 ммоль НАДФН, 0,5 ммоль ЭДТА, 0,1 М фосфатного буфера (рН—7,6). Определение проводилось при +25 С. Активность фермента выражалась в нмоль/мин/мг, для пересчета был использован коэффициент экстинции 6.22 ммоль ""1см
Активность глутатион-З-трансферазы общей цитоплазматической фракции почек печени и сердца определяли спектрофотометрически при 25 С, с 1-хлоро-2,4-динотробензеиом в качестве субстрата [124]. Реакционная смесь содержала 0,1 М фосфатный буфер рН — 6,5, 1мМ глутатиона восстановленного, 1 мМ субстрата. Определялось возрастание оптической плотности при 340 нм в течение 3-х минут. Из полученного результата для каждого определения вычитали скорость неферментативной реакции. Активность фермента выражалась в нмоль/мин/мг белка, для пересчёта был использован коэффициент экстинции 9,6 мМоль 1см.
Активность цитоплазматической НАД(Ф)Н:хинон оксидоредукта-зы 1 определялась общей цитоплазматической фракции почек печени и сердца в соответствии с методом Фишера [105]. с 2.6-дихлорофенолиндофегюлом в качестве субстрата. Реакционная смесь со держала в конечном объёме 3.0 мл: - 50мМ Трис-буфер (рН 7,5), 0,23 мг/мл бычий сывороточный альбумин, 0,08% Тритон Х-100, 100 мкМ субстрата, 300 мкМ НАДЩ. Определяли уменьшение оптической плотности при 600 нм. Определение проводилось при 25 С. Активность фермента выражалась в нмоль/мин/мг белка, для пересчёта был использован коэффициент экстинции 21 мМ -1см-1.
Активность аспартатаминотрансферазы (Ь-аспартат:2-оксоглутарат аминотран сфер азы, КФ 2.6.1.1.) в плазме крови определяли в соответствии с динитрофенилгидразиновым методом Райтмана-Френкеля [202] с использованием наборов фирмы "PLIVA-Lachema" (Чешская Республика, г. Брно). К реакционной смеси, содержащей 0,1 моль/л L-аспартата и 0,2 ммоль/л 2-оксоглутарата в 0,1 молярном фосфатном буфере (рН = 7,0) добавляли 0,05 мл плазмы и инкубировали в течении 60 мин при +37 С. По истечении этого времени к реакционной смеси добавляли 0,25 мл 2,4 динитрофени л гидразина (0,1 ммоль в 1М НС1) и 2,5 мл 1М NaOH. Через 20 минут определяли оптическую плотность против холостого опыта (вместо плазмы добавляется вода) при длине волны 540 нм. Расчёт активности фермента производили по калибровочному графику и выражали в ME (мкмоль/(мин/л)).
Активность креатинкиназы (АТФ:креатин N-фосфотрансфераза, К.Ф. 2.7.3.2.) определяли в плазме крови методом Энора-Розенберга [97]. Реакционная смесь содержала в конечном объёме 1,0 мл: 300 ммоль/л Трис, 5 ммоль/л MgS04,5 ммоль/л креатинфосфата, Іммоль АТФ. Реакцию инициировали добавлением 0,1 мл сыворотки. Смесь инкубировали 30 мин при -г37 С. После инкубации добавляли 0,5 мл 5% раствора гидроксида бария и 0,5 мл 5% раствора сульфата цинка, затем центрифугировали 1000 g в течении 15 мин. К 1 мл супернатанта добавляли 1,0 мл воды, 1,0 мл 1% а-нафтола и 1,0 мл 0,5% раствора диацетила. Оптическую плотность измеряли через 30 мин при 520 им. Расчёт активности фермента производили по калибровочному графику и выражали в ME (мкмоль/мин/л).
Влияние мелатонина на доксорубицин-индуцированный оксидативный стресс
В результате чего, можно сделать заключение, что введение мелатонииа не приводило к изменению активности HXOl в изучаемых органах.
При введении мелатонина с доксорубицином не изменялась также и активность глутатион-Э-трансферазы (рис. 3.7). В группе животных, получавших совместно доксорубицин с мелатонином, активность Г-S в тканях печени была ниже, чем в контрольной группе, и составляла 0,344 ± 0,072 мкмоль/мии/мг белка, что приблизительно соответствовало активности FST в тканях печени животных, получавших доксорубицин и была на 12,5% ниже, чем в контрольной группе. В группе животных, которым совместно с доксорубицином вводился глицин, было отмечено достоверное снижение активности Г-S в тканях печени на 33% (р 0,05) по сравнению с контрольной группой (рис. 3.2), и существовала аналогичная тенденция снижения активности TST в тканях печени после введения доксорубицина. Возможно, что снижение активности FST связано с клеточными защитными механизмами и не зависит от введения глицина и мелатонина. В литературе нами не было найдено данных, свидетельствующих о влиянии мелатонина и глицина на активность глутатиои-S-трансферазы. С другой стороны, конъюгат глутатиона и доксорубицина может ингибировать глутатион-Э-трансферазу [224] и, тем самым, снижать её активность в тканях животных, которым вводился доксорубицин, что косвенно подтверждает наши результаты. В тканях почек введение мелатонина совместно с доксорубицином вызывало тенденцию к увеличению активности PST по сравнению с группой животных, получавших доксорубицин (рис. 3.7), аналогичное действие вызывало и совместное введение глицина с доксорубицином (рис. 3.2). В тканях сердца животных, которым одновременно вводился мелатонин с доксорубицином, отчетливых тенденций не прослеживалось, так же как и в опытах с глицином. Экспрессия TST в тканях сердца и почек находится на низком уровне в сравнении с тканями печени, например, активность этого фермента в сердечной мышце составляет всего 6% от его активности в печени, следовательно изменения в активности этого фермента не могут быть вызваны ингибированием его активности коиыогатом PST-ДОК, в следствии низкой скорости его образования в тканях сердца и почек в сравнении с гепатоцитами.
Как видно из рисунка 3.8, совместное введение доксорубицина с мс-латонииом приводило к увеличению активности глутатион редуктазы в тканях почек по сравнению с группой животных, которым вводился только доксорубицин, до значений этого параметра, детектируемых в контрольной группе животных. Так. активность ГР в тканях почек у животных, получавших совместно мелатонин с доксорубицином. составила 91,6 ± 18,23 нмоль/мин/мг белка, что на 47% выше, чем у животных получавших доксорубицин (р 0,001), у которых активность этого фермента составляла 62.09 ±8,04 нмоль/мин/мг белка. Активность ГР у животных контрольной группы составляла 85,77 ± 7,18 нмоль/мин/мг белка и практически не отличалась от активности этого фермента в группе животных, получавших мелатонин с доксорубицином, но была достоверно выше (р 0,01) активности ГР в тканях почек животных, получавших доксорубицин. Похожая картина наблюдается и в опытах с введением глицина совместно с ДОК (рис. 3.3).
Введение мелатонина не вызывало изменение активности глутатион редуктазы в тканях печени и сердца (рис. 3.8). Такое же отсутствие эффекта на активность ГР наблюдалось при совместном введении глицина и доксорубицина (рис. 3.3).
Введение мелатонииа совместно с доксорубицином приводило к нормализации концентрации ГЗН в тканях почек и печени (рис. 3.9). У группы животных, получавших совместно с доксорубицином мелатонии. концентрация ГЗН в тканях почек составляла 0,088±0,008 мкмоль/мг ткани, что на 44% была выше, чем в группе животных, которым вводился только доксорубицин (р 0,05), у которых концентрация TSH в тканях почек составляла 0,0613±0,018 мкмоль/мг ткани (рис. 3.9). Концентрация глутатиона в тканях почек контрольной группы не отличалась от аналогичного показателя животных, получавших совместно доксорубицин с мелатонином, но была достоверно выше (р 0,05) по сравнению с концентрацией ГЗН в тканях почек животных, которым вводился только доксорубицин (рис. 3.9).
В тканях печени животных, которым вводился доксорубицин с мелатонином концентрация глутатиона составляла 0Д74±0,024 мкмоль/мг ткани и, статистически не отличалась от концентрации TSH в тканях печени животных, получавших доксорубицин, в которой она составляла 0Д44±0,008 мкмоль/мг ткани (рис. 3.9). Концентрация глутатиона в тканях печени животных контрольной группы составляла 0,175 ± 0,016 мкмоль/мг ткани и статистически не отличалось от среднего значения концентрации TSH в тканях печени группы животных, получавших ме-латонин совместно с доксорубицином (рис 3.9), и составляла практически одинаковую величину. Тогда как в группе животных, которые получали доксорубицин. концентрации глутатиона была статистически достоверно ниже на 17% (р 0,05), чем в контрольной группе животных (рис. 3.9). Поэтому можно сделать заключение, что совместное введение доксорубицина и мелатонииа не приводило к снижению концентрации TSH в тканях печени.
