Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Теоретические основы применения лазеров в биологии 7
1.2. Механизм действия лазерного излучения с биообъектами 21
1.3. Механизм светочувствительности биологических систем 25
1.4. Роль нелинейно-оптических процессов 29
2. Характеристика и классификация вируса ВТМ 43
2.1. Общая характеристика группы тобамовирусов 44
2.2. Морфология вирионов, распространение и хозяева 46
2.3. Цитопатология, тельца включений 49
2.4. Структура генома 49
2.5. Классификация тобамовирусов 53
3. Экспериментальная часть
3.1. Объекты исследований и схема опытов 57
3.2. Условия проведения опытов 62
3.3. Конструкция диагностической системы 68
3.4. Особенности конструкции аналитической стационарной лазерной установки 69
4. Выявление заражённых ВТМ растений
4.1. Оценка заражённости томатов и огурцов ВТМ 75
4.2. Особенности фотолюминесценции растений томатов, заражённых ВТМ 81
4.3. Особенности фотолюминесценции растений огурца, заражённых ВТМ 90
4.4. Исследование фотолюминесценции растений, испытывающих недостаток азота 98
4.5. Сравнительная характеристика различных методов диагностики вируса ВТМ и азотного голодания 105
Заключение 107
Выводы 112
Список использованной литературы 115
- Механизм действия лазерного излучения с биообъектами
- Морфология вирионов, распространение и хозяева
- Условия проведения опытов
- Особенности фотолюминесценции растений томатов, заражённых ВТМ
Введение к работе
Актуальность проблемы. Для сельского хозяйства всех стран мира встала проблема борьбы с болезнями культурных растений с применением самых разнообразных способов. Известно, что в современной экологической обстановке ущерб от вредных организмов значителен. В Африке потери от вредителей, болезней и сорняков достигают 44% от потенциального урожая, в Юго-Восточной Азии - 43%, в Латинской Америке — 35% (Помазков, 2000). По данным ФАО (2003) потери от заболевания растений наносят колоссальные убытки экономике различных стран на колоссальные суммы - только по Европе они исчисляются несколькими сотнями миллионами долларов, в Азии — более 200 млн. долларов, Южная и Северная Америка — более 500 млн. долларов, в России эта цифра близка к 20-25 млн. долларов. Таким образом, мировой ущерб, наносимый сельскому хозяйству различными заболеваниями растений близок к цифре в 1 млрд. долларов.
Борьба с наиболее распространенными болезнями требует больших затрат и усилий. В настоящее время потери сельскохозяйственной продукции обусловлены воздействием антропогенных, стрессовых факторов и приемов, используемых при интенсивных технологиях. В результате организмы активируются и переходят в разряд вредоносных, мутируют, повышается их вредоносность и устойчивость к фунгицидам.
Одной из распространенных форм заболеваний являются вирусные.
Вирусы, микоплазмы, вироиды поражают все живые организмы, часто
являются причиной массовых заболеваний, приводящих к тяжелым
последствиям. В настоящее время известно около 700 возбудителей вирусной
этиологии и их количество постоянно пополняется
(Келдыш, Помазков, 2003).
Широкое распространение вирусных заболеваний, отсутствие приемов массового оздоровления в полевых условиях требует затратных мероприятий по производству оздоровленного посадочного материала. Для борьбы же с распространением и вредоносностью вирусных заболеваний требуется
внедрение целого комплекса мероприятий: использование приемов ранней диагностики, карантин и сертификацию посадочного материала, контроль за источниками инфекции, селекцию устойчивых к заболеванию сортов и гибридов (Келдыш, Помазков, 2003).
Возникает потребность в разработке новых методов диагностики, которые бы были быстрыми, обеспечивали мониторинг заболевания и включались в систему оздоровительных мероприятий. Разработка теоретических предпосылок и внедрение методологических подходов для различных систем защиты растений от болезней создает основу для разработки новых решений борьбы с болезнями растений. С этими целями очень эффективно распространяются физические, биофизические, физиологические и другие методы исследований.
В последние годы во многих странах мира среди биофизических методов большое внимание уделяется интенсивному внедрению лазера в биологические исследования. Уникальное свойства лазера открыло широкие возможности его применения в различных областях диагностики. Эффективность лазерного сканирование широко известно в области медицины (Dougherty, 1982; Странадко, 1997, Мюллер, 1997), микробиологии, биохимии, устойчивости к внешним воздействиям (Москаленко, Прилуцкий, 2000; Лебедев, Левчук, Ломакин, Носкин, 1987; Губин, 1987; Рис, Стернберг, 1988).
Традиционный подход к определению заболевания растений включает в себя визуальное наблюдение за состоянием растения. Проявление внешних признаков заболевания наблюдается тогда, когда заболевание принимает хронический характер, борьба с ним становится затруднительной, а признаки заболевания не являются специфичными. Препаративные же методы продолжительны по времени, дорогостоящи.
Актуальность данной работы связана с тем, что в настоящее время появилась лазерная диагностическая аппаратура для исследования в различных областях науки, таких как медицина, биология, микробиология и
т.д. Представляется достаточно перспективным использование метода лазерной фотолюминесценции для определения болезней растений на ранней стадии. Этот метод позволяет: во-первых, определить болезни растений на ранней стадии развития, когда другие методы не позволяют определить болезни с необходимой точностью и, во-вторых, метод лазерной фотолюминесценции позволяет проводить диагностику растений в режиме реального времени (on line). Преимуществом данного метода является возможность проводить исследования бесконтактным способом, не повреждая растение и сканируя большие площади посевов, например, установив лазерную диагностическую аппаратуру на передвижное транспортное средство (Пискарёв, 2004).
В настоящей работе нами поставлена следующая цель - показать возможность и практическую осуществимость применения современных лазеров для диагностики вирусных заболеваний.
Цель и задачи работы. Для выполнения поставленной цели необходимо выполнить следующие задачи:
1. Разработка концепции диагностической системы, основанной на
использовании метода лазерной фотолюминесценции, способности ее работы
в неблагоприятных внешних условиях и обладающей однотипной
конфигурацией основной подсистемы — источника зондирующего лазерного
излучения;
-
Сборка, наладка и калибровка диагностического лазерного стенда для отработки методики фотолюминесцентного анализа болезней растений на ранних стадиях;
-
Проведение экспериментов со здоровыми растениями и растениями на ранней стадии заболевания вируса табачной мозаики с целью разработки методики фотолюминесцентного анализа с использованием импульсно-периодического эксимерного лазера.
4. Выделение общих критериев для определения заболевания вирусом табачной мозаики на основе сканирования с помощью импульсно-периодического эксимерного лазера.
Научная новизна.
-
Впервые для диагностирования заболевания ВТМ овощных растений была использована установка, сконструированная на основе эксимерного лазера, показавшая преимущества дистанционного диагностирования.
-
Показано, что увеличение длины волны фотолюминесценции растений является признаком заболевания ВТМ после предварительного облучения ультрафиолетом с длиной волны света 308 нм.
-
Установлено, что растения, испытывающие недостаток азотного питания, но имеющие визуальные признаки ВТМ, характеризуются более короткой волной фотолюминесценции, чем растения в благоприятных условиях питания.
Практическая значимость. На основе большого экспериментального материала подтвержденного статистическим анализом, рекомендуемый метод диагностирования заболевания ВТМ овощных растений может быть использован в овощных хозяйствах. В качестве диагностического признака заболевания является увеличение длины волны фотолюминесценции облученного ультрафиолетовым светом растения. Апробация работы. Результаты исследования автора докладывались на научных конференциях Аграрного факультета РУДН в 2002 — 2006 годах, на международной научной конференции ПНИИАЗ в 2004 году. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 статей. Объем и структура диссертации. Диссертация представлена на 127 страницах машинописи, состоит из введения, обзора литературы, методики исследований, экспериментальной части, обсуждения,
выводов и рекомендаций. Список литературы представлен 143 источниками, из них _53 на иностранных языках.
В качестве объектов исследования были выбраны гибриды растений томатов и огурцов, представленные в таблице 1 схемы опытов.
Таблица 1 Гибриды растений, взятые в качестве объектов исследования (2002-2006 гг.)
огурцы
Примечание: гибрид огурца Калунга F1 был исследован на фотолюминесценцию растения с недостатком азота.
Повторность - 5-кратная. Результаты исследований обрабатывались статистически (Доспехов, 1979). Использовали импульсно-периодический эксимерный лазер для выявления заболевания растений на ранней стадии.
Экспериментальная установка обеспечивала выбор длины волны и
энергии, обеспечивающих вторичный сигнал фотолюминесценции с
максимальным разрешением по амплитуде и спектру.
Семена растения были высеяны в кассеты в июле. Кассеты позволяют получать максимально выровненные растения с мощной корневой системой.
Заражение рассады проводилось в 25-дневном возрасте в стадии 3-4 листьев механическим способом. В качестве материала для заражения растений был взят дикий штамм вируса ВТМ - U1.
Для подтверждения результатов и получения точной информации о заболевании - образцы заражённого материала были направлены в лабораторию молекулярной вирусологии ВНИИСБ РАСХН, где они были исследованы с помощью метода ПЦР на наличие вируса ВТМ.
Механизм действия лазерного излучения с биообъектами
Биологический эффект вызывает лишь излучение такой длины волны, при которой оно поглощается молекулами или фоторецепторами тех или иных структурных компонентов клеток. Спектры поглощения различных макромолекул весьма разбросаны. Так, пептидные группы поглощают излучение электромагнитных волн с длиной волны 190нм, карбонильные группы - 225 нм, триптофан - 220 и 280 нм, тирозин - 275 и 222 нм, фенилаланил - 258 нм, каталаза - 628 нм. Максимальная спектральная чувствительность молекул ДНК соответствует длинам волн 620 нм и 820 нм и т.д. В то же время биологические эффекты воздействия разного по длине волны низкоэнергетического лазерного излучения очень сходны и, как правило, объединяются термином «биостимуляция».
Поиски фоторецепторов и фотоакцепторов ведутся давно. Экспериментальные исследования по определению специфических фотоакцепторов дают основания считать таковыми в красной области спектра каталазу, супероксиддисмутазу, цитохромоксидный комплекс ааз, молекулярный кислород с образованием синглетного кислорода. Максимум фотоиндуцированной биостимуляции электромагнитными волнами в красной (633 нм), зеленой (500 нм) и фиолетовой (415 нм) области спектра дает основание думать о порфириновой природе первичного фотоакцептора в клетках.
Второй подход к этому вопросу, более объективен, поскольку он объединяет наиболее восприимчивые к электромагнитному излучению биоструктуры и отводит им роль неспецифических фотоакцепторов. Спектр поглощения биополимеров электромагнитных волн оптического диапазона весьма широк. Так белки, в зависимости от сложности их структуры, поглощают свет от ультрафиолетового до инфракрасного спектра: элементарные белковые структуры (аминокислоты, различные остатки белковых молекул и др.) взаимодействуют с излучением ультрафиолетового диапазона; чем длиннее система сопряженных двойных связей в молекуле, тем при большей длине волны располагается длинноволновый максимум поглощения. Ферменты также являются веществами белковой природы, несущими на себе определенные компоненты - активационные центры. Ферменты служат катализаторами биохимических реакций, а для ферментативного катализа важнейшее значение имеет электронно-конформационные взаимодействия. Учитывая, что энергия конфор-мационных переходов биополимеров невелика. Ээнергия, необходимая для образования спирального участка биополимера из 4-х звеньев, равна около 10 кДж/моль, а энергия внутреннего вращения пептидной связи примерно равна 84 кДж/моль). Этим можно объяснить отклик различных ферментативных систем даже на слабые энергетические воздействия, а, именно, на низкоэнергетическое лазерное излучение красного и ближнего инфракрасного диапазона. Фосфолипиды и клеточные мембраны, имеющие жидкокристаллические структуры, обладают неустойчивым состоянием при температуре тела около 37С. Они весьма чувствительны к воздействию излучения электромагнитных волн всего оптического диапазона. Пигментные комплексы биоструктур также восприимчивы к световому излучению весьма широкого диапазона длин волн.
Биологические жидкости, являясь сложными многокомпонентными системами и обладая свойствами жидких кристаллов, реагируют структурной альтерацией вещества даже на слабые внешние физические воздействия. Наличия их в составе, в частности, в крови, форменных элементов (эритроциты, лейкоциты, тромбоциты и др.) существенно повышают восприимчивость и чувствительность жидких сред организма к внешнему воздействию различных физических факторов, в том числе низкоэнергетического лазерного излучения. В биологических жидкостях имеются специфические фотоакцепторы, реагирующие на лазерное излучение определенной длины волны. Кроме того, энергетической мощности фотонов всех спектров оптического диапазона вполне достаточно для возникновения от их воздействия структурной альтерации в жидких комплексах биообъекта (Прохончуков, Жижина, 1996; Москвин, 1997; Кейси, Паниш, 1981).
Говоря о взаимодействие лазерного излучения с биологическими объектами и механизме его действия необходимо упомянуть о лазерной биостимуляции, механизме светочувствительности биологических систем, роли нелинейно-оптических процессов, граничных слоях и структурах при лазерной биостимуляции и квантовых аспектах лазерной биостимуляции.
Лазерная биостимуляция (ЛБС) широко используется в биологической и медицинской практике, но его сущность и механизмы ещё далеко не полностью раскрыты и поняты (Кару, 1989; Илларионов, 1992). К основным свойствам ЛБС обычно относятся селективность лазерного воздействия. Изменения индуцируются только в больных биосистемах, на здоровых воздействие не сказывается. Эффект наблюдается при очень малых интенсивностях и малых поглощаемых энергетических дозах. Эксперимен тально было установлено, что лазерное излучение действует как на биологические клеточные структуры, так и на отдельную клетку (Малов, Малов, Чёрный, 1997).
Несомненную фундаментальную проблему создает и эволюционно сформировавшееся наличие в нативных конформациях биологических макромолекул согласованности ближних, средних и дальних взаимодействий (Попов, 1997). Ситуацию в биосистемах усложняют как отсутствие строгой границы между этими явлениями, так и открытость и неравновесность таких систем.
На настоящий момент описание явлений, например в клетке, имеет мозаичный характер: первичный акт взаимодействия фотона с макромолекулой должен описываться квантомеханически, изменение конформационного состояния макромолекулы описывается в рамках квантовой химии и биохимии (Волькенштейн, 1978). Структура макромолекулы в целом описывается на основе статистической теории П.Флори, а взаимодействие макромолекул описывается в рамках детерминистических моделей типа «замок-ключ», «рука-перчатка». Поведение, например, клетки в целом описывается на основе теории автоматов и систем (Рубин, 1987). Кроме этого, по мере необходимости, во внимание принимаются и теория фазовых переходов и самоорганизации (Гросберг, Хохлов, 1989; Романовский, Степанова, Чернавский, 1984).
Эффект ЛБС является нетривиальным примером взаимодействия двух неравновесных систем: когерентного поля и биологической системы. Несмотря, казалось бы, на необходимость «резонанса» этих двух систем по длине волны для возникновения взаимодействия, оно происходит всегда при монохроматичности излучения. Это связано, видимо, с дискретностью энергетического спектра биосистемы и с изменением ее параметров во времени - она «дышит» и тем самым, всегда обеспечивает резонанс, структур. Основными чертами этого взаимодействия следует считать наличие самоорганизации и эквифинитности. (Малов, Малов, Чёрный, 1997).
Морфология вирионов, распространение и хозяева
Тобамовирусы относятся к группе палочковидных вирусов, частицы которых состоят на 95% из белка и на 5% из нуклеиновой кислоты. Вирион содержит одну молекулу РНК, примерно 2140 субъединиц капсидного белка, и представляет собой полый цилиндр длиной около 300 нм. Внешний диаметр вирусных частиц - примерно 20 нм, внутренний приблизительно 4 нм (Гиббс, Харрисон, 1978). Субъединицы капсидного белка образуют правозакрученную спираль вокруг одной молекулы РНК, причем с каждой субъединицей белка ассоциировано тринуклеотидное звено РНК. Тобамовирусы распространены повсеместно, заражая большое количество видов растений, нанося особенно большой ущерб семейству пасленовых. Было показано, что ВТМ инфицирует 199 из 310 видов растений из 29 семейств (Lewandowski, 1995). На листьях инфицированных растений появляются чередующиеся светло- и темно-зеленые участки, образующие мозаичный узор (Lewandowski,. 1995). Характер этого узора в деталях широко варьирует при различных сочетаниях растений-хозяев и штаммов ВТМ. От больного растения к здоровому тобамовирусы передаются путем механической инокуляции, возможны заражение здорового растения, если в почве есть части органов инфицированных растений, и перенос семенами, если вирионы попали на оболочку семени (Lewandowski, 1995); и с помощью насекомых-переносчиков (Гиббс, Харрисон, 1978). Тобамовирусы перемещаются в растении от клетки к клетке по плазмодесмам, такое перемещение носит название ближнего транспорта, а от одной части растения к другой по флоэме - дальний транспорт. Весь процесс распространения вирусной инфекции протекает в четыре этапа (Atabecov and Taliansky, 1990): 1. Выход вируса в проводящие ткани - переключение с ближнего на дальний транспорт; 2. Дальний транспорт по тканям проводящих путей; 3. Проникновение из проводящей системы в клетки паренхимы вторично инфицируемых листьев и его распространение там; 4. Путем ближнего транспорта вирус распространяется в паренхиме и эпидермисе зараженного листа.
Перемещение из клетки в клетку вирусной РНК тобамовирусов происходит в комплексе с транспортным белком, т.е. вирус распространяется по плазмодесмам в виде рибонуклеопротеидного комплекса (РНП), отличного от вирусных частиц (Waigmann et al., 1994).
Дальний транспорт тобамовирусов в растении происходит по флоэме. Наличие белка оболочки (БО) является необходимым условием для дальнего транспорта (Saito et al., 1990); мутанты с нарушением в гене белка оболочки не способны инфицировать части растения, удаленные от точки первичного заражения. По-видимому, ВТМ перемещается по флоэме в виде вирионов, так как мутации в участке начала сборки вирионов ВТМ также подавляют дальний транспорт вируса.
О скорости распространения вируса из клетки в клетку можно судить по скорости увеличения радиуса местных некрозов, например Раппапортом и Вилдманом в 1957 г. для ВТМ у Nicotiana glutinosa при 25С была получена цифра 14 мкм/ч (Гиббс, Харрисон, 1978). Скорость движения вируса по флоэме гораздо выше - 80 см за 12 часов по стеблю томатов (Гиббс,
Харрисон, 1978). Направление движения вирусной инфекции по растению коррелирует с транспортом углеводов (Гиббс, Харрисон, 1978).
Было показано, что в инфицированных тобамовирусами клетках растений N. glutinosa прежде всего исчезает строма хлоропластов; затем граны и ламеллы становятся аморфными и хлоропласт разрушается. В ядре, прежде всего, исчезает его матрикс. Вещество цитоплазмы агрегирует, и граница между цитоплазмой и вакуолью становится незаметной (Hayashi et al., 1965).
Наглядным результатом вирусной инфекции на клеточном уровне является образование включений. Для ВТМ-Ш характерны находящиеся в цитоплазме кристаллические (кристаллы Ивановского), аморфные включения, а также прямые палочки, расположенные параллельно друг другу, и беспорядочно расположенные нити. Кристаллы состоят, в основном, из вирусных частиц. Аморфные включения в виде гранул включают в себя элементы эндоплазматической сети, рибосомы, вирусные палочки и широкие нити, представляющие собой пучки трубочек (Hayashi et al., 1965). В отличие от BTM-U1 и от большинства штаммов ВТМ, Казахский изолят, помимо кристаллических включений в протоплазме, образует также различного рода включения в ядре (Гольдин, 1963). Для ВМТ характерны так называемые овальные тельца включения (Гольдин, 1963).
Геном тобамовирусов представлен смысловой РНК (+РНК) длиной около 6400 нуклеотидов, которая кэппирована с 5 -конца (в качестве кепа выступает 7-метилгуанозин m GpppG) и имеет нетранслируемую область длиной около 70 нуклеотидов. В этом районе локализован участок, характерный отсутствием остатков гуанозина и получивший название Q-последовательность. Отсутствие гуанозина обусловливает низкий уровень вторичной структуры РНК и, следовательно, слабое взаимодействие РНК с капсидным белком, что облегчает депротеинизацию вирионов (Namba et al., 1989, Mundry et al., 1991). Слит (1987) продемонстрировал энхансерную функцию Q-последовательности - трансляция in vitro проводилась в эукариотических системах лизата ретикулоцитов кролика, экстракта зародышей пшеницы и прокариотической системе S-30 из Е. Coli. Исследования показали важность Q-последовательности как общего энхансера трансляции мРНК в прокариотических системах 70S-рибосомальных и эукариотических 808-рибосомальных.
Условия проведения опытов
Семена растения были посеяны в кассеты (рис. 3.8.) в июле, одновременно. Кассеты (рис. 3.9.) наиболее оптимальный способ получения здоровой рассады, достоинствами которой является: 1. Позволяет облегчить операцию набивки ячеек субстратом; 2. Даёт возможность производить сортировку и полное заполнение кассет стандартными растениями; 3. Растения получается максимально выровненные с мощной корневой системой; 4. Снижение затрат труда и расходов на тепло; 5. Всхожесть рассады достигает 100%; 6. Улучшается приживаемость; 7. Облегчается набивка ячеек субстратом; 8. Возможность производства сортировки и полноты заполнения кассет стандартными растениями; 9. Выход максимально выровненных растений с мощной корневой системой; 10.Снижение затрат труда и расходов на тепло; 11. Достижение 100% приживаемости растений. Заражение рассады проводилось в 25 дневном возрасте: в стадии 3-4 листьев, механическим способом. В качестве материала для заражения растений был взят дикий штамм вируса ВТМ - U1, более подробно он описан в главе 2. Процесс заражения осуществлялся вирусом ВТМ U1, с использованием следующих инструментов и материалов: точной пипетки, ступки с пестиком, дистиллированной воды (рис.3.10 и 3.11).
В ходе проведения эксперимента был собран лабораторный стенд, включающий в себя (рис. 3.16 и 3.17): 1. Эксимерный лазер. Рабочая смесь ХеС1. Длина волны ((Х,л) 308 нм, энергия в импульсе Еимп= 180-200 мДж. Частота повторений импульсов до 100 Гц. Используется в качестве источника УФ возбуждения для исследуемого объекта. 2. Устройство для уменьшения энергии эксимерного лазера (подавитель) - используется для достижения уровня энергии, обеспечивающий сохранность биологического объекта и обеспечение необходимого уровня регистрируемого сигнала. 3. Лазер на красителях - необходим для обеспечения проведения исследований в широком диапазоне спектра длин волн. 4. Блок удвоения - для преобразования излучения лазера на красителях во второю гармонику. 5. Сплиттер - прозрачная кварцевая пластинка для отвода небольшой (несколько процентов) энергии излучения на фотодатчик (ФЭК - 29). Это делается для фиксирования времени начала излучения (синхронизации). Начало счёта времени процесса. 6. Устройство для уменьшения энергии лазера на красителях (подавитель) - используется для достижения уровня энергии, обеспечивающий сохранность биологического объекта и обеспечение необходимого уровня регистрируемого сигнала. 7. Пульт управления эксимерным лазером - осуществляет запуск, регулировку частоты повторения импульсов и контроль готовности. 8. Пульт управления (PC) лазера на красителях и блока удвоения. 9. Фотодатчик излучения (см. п. 3 ФЭК - 29). Ю.Стробируемый интегратор - обеспечивает выборку (временную) регистрируемого сигнала с требуемой задержкой и регулируемой шириной выборки. Позволяет работать в режиме накопления импульсов (осреднение), в нашем случае 8 импульсов с вычитанием фоновых и других помех. Марка ВСІ -280. Сигнал с него подаётся на графопостроитель. 11. Графопостроитель - отображает спектральную характеристику в процессе измерений. 12.Цифровой осциллограф - TDS - 3032 В (быстрый), полоса пропускания 300 мГц. Минимальное время развёртки 0,4 нс/клетку шкалы. Используется для изучения временных характеристик сигналов фотолюминесценции, а также для точного (ручного) съёма некоторых наиболее характерных участков спектра, вместо ВСІ. 13.Компьютер для сбора и архивирования данных, получаемых с цифрового осциллографа. 14.Принтер - для распечатывания данных. 15Дифровой осциллограф - TDS - 3032 В (быстрый), полоса пропускания 300 мГц. Минимальное время развёртки 0,4 нс/клетку шкалы. Используется для изучения временных характеристик сигналов фотолюминесценции, а также для точного (ручного) съёма некоторых наиболее характерных участков спектра, вместо ВСІ. Іб.Зеркало многопроходной кюветы. П.Зеркало многопроходной кюветы. 18.Многопроходная кювета - предназначена для размещении объектов исследования в жидкой фазе в сверх малых концентрациях. 19.3еркало для вывода излучения и многопроходной кюветы. 20.Измеритель мощности лазерного излучения. 21.Кварцевая оптическая кювета - предназначена для размещения объектов исследования в жидкой фазе. 22.Конденсор - предназначен для фокусировки исследуемой зоны объекта на щель монохроматора. 23.Фильтры - предназначены для подавления возбуждающего лазерного излучения (Л.=308) и срезания верхних порядков спектра монохроматора. 24.Монохроматор (МДР-23)- спектральный прибор позволяющий выделять из исследуемого светового сигнала монохроматические линии в широком диапазоне длин волн и широким диапазоном спектрального разрешения (Х=0,23 нм в нашем случае). 25.Пульт управления монохроматором - обеспечивает включение и сканирование по длинам волн с различными скоростями. 26.Фотоумножитель (Hamamatsu - R 562). Предназначен для регистрации выходящего из монохроматора излучения. 27.Калибровочная лампа (СИРШ-46). Предназначена для абсолютной калибровки приёмного тракта стенда. 28.Блок питания калибровочной лампы - устанавливает параметры регулировки лампы.
Особенности фотолюминесценции растений томатов, заражённых ВТМ
В качестве образцов для исследования брали заражённые и здоровые листья томата. Длина волны облучения не изменялась и была аналогична эксперименту с растениями огурца и равнялась 308 нм. Заражение растений проводилось одновременно с растениями огурца и проходило идентично. Для исследования взяты 3 гибрида томатов, проверенных на заражаемость ВТМ. Была проведена проверка возможности отражения или люминесценции воды. Результаты фотолюминесценции гибридов томата приведены в таблице 4.3. Таблица 4.3
По результатам эксперимента с гибридом томата Торбей F1 была рассчитана кривая спектра фотолюминесценции, средняя из пяти повторностей, представленная на рис. 4.5. Пик спектра фотолюминесценции больного растения томата смещён в длинноволновую область красного диапазона. Длина волны первого пика фотолюминесценции больного растения 426 нм может говорить о сильной восприимчивости томата к вирусу ВТМ, в результате чего распространение вируса в растение происходило достаточно быстро. Сравнение со здоровым растением даёт значительную и очевидную разницу в 12 нм. Пик фотолюминесценции здорового растения приходится на длину волны 414 нм. Вторые пики фотолюминесценции также имеют значительную разницу и составляют для здорового растения 429 нм и для больного - 440 нм соответственно. В данном случае можно говорить о сильном поражении растения вирусом, хотя внешне, это может сильно и не проявляться (рис. 4.6).
Сканирование гибрида Полфаст F1 (табл.4.1) показало аналогичные результаты, что гибрида Торбей F1. Здоровые растения испускали световые излучения в несколько более длинных диапазонах волн. Первый пик имел спектр излучения, варьировавший в диапазоне 423 - 425 нм, а второй в диапазоне от 434 до 436 нм. Заражение ВТМ привело к сдвигу излучения в более длинную область: первый пик варьировал в диапазоне 432 - 434 нм, а второй в диапазоне 444 - 448 нм.
Заключительным в серии экспериментов с томатами использовали гибрид Бенито F1 (табл. 4.1). У этого гибрида также отмечено два основных пика фотолюминесценции. Длина волны первого пика изменялась от 423 до 425 нм у здоровых растений и от 433 до 435 нм у больных. Для второго пика характерны изменения в более длинноволновой части спектра. У здоровых растений от 442 до 445 нм и у больных - 467-468 нм, что показано на рис. 4.8. Рис. 4.8. Кривые спектров фотолюминесценции гибрида Бенито F1
Приведенные графики показывают, что пики фотолюминесценции уменьшают амплитуду с ростом порядка. Первый пик имеет большую амплитуду и у здоровых растений имеет максимум в зоне 414 - 423 нм, а у больных - 426 - 433 нм (рис. 4.5, 4.7, 4.8). Вторые пики фотолюминесценции имеют меньшую амплитуду и расположены в более длинноволновой (красной) части спектра: здоровые растения имеют пик в диапазоне 429 - 443 нм, а больные растения - 440 - 467 нм (рис. 4.5, 4.7, 4.8).
Чем интенсивнее вирус проникает в клетку, тем сильнее изменяется её структура, а, следовательно, и электронные связи, определяющие флюо рисцентные отзывы. Клетка - это «приёмник», работа которого зависит от многих факторов. Клетка в каждом состоянии имеет свои отклики: в больном или здоровом состоянии отклик (ответ) будет различный. Длина волны (к) 308 нм - ультрафиолетовое излучение с высоким запасом энергии, которое позволяет получить ряд специфических отзывов (в нашем случае пиков волн). Этим облучением мы затрагиваем целую структуру клетки, а не единичный фрагмент.
Необходимо отметить, что ось Y (ось абсцисс) в нашем случае не является ключевой. Она выражается в милливольтах (мВ) и её максимум дельта (А) равен 50 мВ. Для нас она не является характерной, т.к. в ходе эксперимента меняются: угол излучения и насыщенность (накачка) лазера. Картину фотолюминесценции это не меняет, однако дельта может изменяться. В большинстве случаев, в пике она достигает своего максимального значения.
Синим цветом, изображена кривая излучения здорового растения, фиолетовым - заражённого растения. Основные пики фотолюминесценции приходятся на следующие длины волн: первый пик фотолюминесценции у больного растения 417 нм, у здорового растения - 380. Второй пик фотолюминесценции характеризуется длиной волны света у больных растений 435 нм и у здоровых - 420 нм.
Основные результаты определяются по данным первых пиков, так как здесь мы получаем наиболее сильный сигнал. Как видно из рисунка, далее сигнал уменьшается, вплоть до исчезновения в красной зоне спектра. Для чистоты контроля эксперимента наблюдается кювета с дистиллированной водой. Желтая кривая обозначает отсутствие фотолюминесценции у воды, что говорит о чистоте проведения эксперимента.
