Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы
1.1 Фитовирусы и устойчивость растений 8
1.1.1 Типы вирусных инфекций растений 8
1.1.2 Вирус мозаики сои 11
1.2 Метаболизм растений при патогенезе 16
1.2.1 Белки растений связанные с патогенезом (PR-белки) 16
1.2.2 Локализация и свойства PR-белков 16
1.2.3 Классификация PR-белков 17
1.2.4 Биологические свойства PR-белков. 19
1.3 Пероксидаза 22
1.3.1 Характеристика фермента пероксидазы 22
1.3.2 Активность пероксидазы в связи с устойчивостью 23
1.3.3 Изоферменты пероксидазы 27
1.4 1-»3-Р-0-Глюканазы растений 28
1.4.1 Свойства, специфичность и структура 1- 3-p-D-глюканаз 29
v 1.4.2 Биологическая функция 1-»3-3-В-глюканаз 30
1.5 Гликозидазы растений 35
1.6 Фенольные соединения при патогенезе растений 38
Глава II. Материалы и методы
2.1 Материалы 42
2.2 Методы работы с вирусами 42
2.2.1 Инфицирование растений вирусами 42
2.2.2 Выделение вируса мозаики сои 43
2.2.3 Электронная микроскопия 44
2.2.4 Выделение вируса табачной мозаики 44
2.2.5 Спектрофотометрическая характеристика вирусов 45
2.2.6 Электрофорез капсидных белков вируса мозаики сои 45
2.2.7 Минигель-электрофорез антигена вируса мозаики сои 46
2.2.8 Определение вирус-ингибирующей активности гомогенатов листьев сои 48
2.2.9 Определение инфекционности вируса мозаики сои 48
2.3 Энзиматические методы исследования 49
2.3.1 Приготовление растительных экстрактов 49
2.3.2 Определение активности пероксидазы 50
2.3.3 Изоэлектрофокусирование пероксидаз 50
2.3.4 Идентификация изоферментов пероксидазы 51
2.3.5 Определение изоэлектричесих точек изопероксидаз 51
2.3.6 Сканирование гелей 52
2.3.7 Определение активности 1-»3-Р-0-глюканазы 52
2.3.8 Жидкостная хроматография продуктов гидролиза ламина рана 1 - 3-Р-0-глюканазой сои 52
2.3.9 Определение влияния групп-специфических реагентов и природных эффекторов на 1-»3-(3-0-глюканазу сои 53
2.3.10 Определение активности гликозидаз (P-D-глюкозидазы, P-D-галактозидазы и a-D-маннозидазы) 53
2.3.11 Выделение и определение фенольных соединений 53
Глава III. Результаты исследований
3.1 Характеристика вируса мозаики сои 55
3.2 Скрининг сортов сои на устойчивость к вирусу мозаики сои и их биологическая характеристика 57
3.3 Изучение распределения инфекционности вируса мозаики сои по сортам сои с различной устойчивостью 60
3.4 Распределение антигена вируса мозаики сои в сортах сои с различной устойчивостью 65
3.5 Изучение вирус-ингибирующей активности экстрактов листьев сои Приморская 529 и Dewamusume 70
3.6 Сравнительная характеристика активности ферментов 73
3.7 Пероксидаза различных по устойчивости сортов сои 74
3.8 Определение изоферментного спектра пероксидаз 74
3.9 Сравнение активности 1 -»3-Р-0-глюканазы сортов сои 80
3.10 Влияние ингибиторов на активность 1 —»3-р-0-глюканазы сои 83
3.11 Гликозидазы сортов сои 84
Глава IV. Обсуждение результатов 89
Выводы 100
Литература 102
- Вирус мозаики сои
- Изучение распределения инфекционности вируса мозаики сои по сортам сои с различной устойчивостью
- Определение изоферментного спектра пероксидаз
- Гликозидазы сортов сои
Введение к работе
Актуальность темы. Одна из ценнейших сельскохозяйственных культур в
мире - соя подвержена многим вирусным заболеваниям [Irvin, Schultz, 1981]. Наиболее вредоносным для неё является вирус мозаики сои (ВМС). Снижение урожая при поражении ВМС составляет от 30 до 90 % [Поливанова, 1980; Крылов, 1992]. Ситуация осложняется отсутствием сортов, иммунных к вирусу [Рейфман и др., 1975; Iwai, Wakimoto, 1990].
Общепризнанно, что для разработки мер борьбы с вирозами необходимо изучение взаимоотношений вирусов с растениями. Поэтому актуально всестороннее изучение механизмов взаимодействия вирусов и растений, так как именно при их взаимодействии проявляются такие важнейшие свойства растений, как устойчивость, иммунитет, способность локализовать инфекцию и др. [Реунов, 1999; Малиновский, 2002].
В ответ на внедрение патогенов в растениях происходят различные изменения, в том числе индуцируются так называемые PR-белки ('pathogenesis-related proteins') [Datta, Muthurishnam, 1999], которые в большинстве своем являются ферментами. Установлена физиологическая роль отдельных из них при грибной инфекции. 1—!>3-Р-0-Глюканаза (PR2), как полисахаридгидролаза способна выщеплять из гиф грибов олигосахарины (1—^З-РгО-глюканы), обуславливающие синтез абиотических веществ - фитоалексинов, токсичных для грибов [Albersheim et al., 1992; Озерецковская, Роменская, 1996]. Также 1—>3-j3-D глюканаза при в совместном действии с хитиназой, другим PR-белком, способны полностью гидролизовать клеточные стенки грибов. В то же время в работах на модельной системе ВТМ-табак показано подавление инфекционности вируса табачной мозаики различными олигосахаридами, продуктами ферментативного (1—»3-р-0-глюканазой) гидролиза полисахаридов [Елякова и др., 1994; Коваленко 1996; Reunovetal, 1996; Реунов и др., 2000; Коваленко 2001].
Роль другого PR-белка - пероксидазы (PR9) в вирусном патогенезе связывают с синтезом лигнина при образовании некрозов в случае гиперчувствительного ответа растений. Однако нет четкого представления о роли этого полифункционального фермента при вирусном патогенезе [Van Loon, 1997; Chit-turetal, 1999].
Индуцибельные PR-белки - большей частью кислые белки, секретируют-ся при вирусном патогенезе в межклеточное пространство, апопласт. Полагают, что в первой линии защиты участвуют белки клеточных стенок [Datta, Muthurishnam, 1999]. Кроме того, динамичнФСх^^^вд^одрдоде^очной стенки и рас-
SHUHOTEKA і
тения в целом в стресс-адаптивных реакциях растений обусловлена среди многих реакций и усилением катаболических процессов, осуществляемых гликози-дазами [Bolanos etal., 1984; Munos et al., 1993; Тарчевский, 2000]. Согласно литературным данным, в метаболизме гликоконъюгатов клеточных стенок принимают участие многие олигосахаридгидролазы, например, такие, как p-D-глюкозидаза, P-D-галактозидаза и a-D-маннозидаза [Bagaharia, Chanda, 1998].
Большинство работ по изучению белков, связанных с патогенезом при вирусных инфекциях, выполнены на табаке и томатах. Исследования по изучению метаболических процессов сои при вирусном патогенезе в литературе представлены слабо, что объясняется сложностью работы с растениями сои и высокой лабильностью самого вируса [Lim, 1985; Iwai, Wakimoto, 1990; Ward, Sukla, 1991].
Продуктивным подходом при изучении защитных механизмов растений является сравнение особенностей протекания инфекции, направленности биохимических реакций близкородственных растений, по-разному реагирующих на заражение одним и тем же вирусом [Журавлев, 1979; Малиновский, 1998].
Цель и задачи исследований. Целью исследования было изучение особенностей распределения инфекционности и антигена среднепатогенного штамма вируса мозаики сои в растениях сои с различной реакцией на заражение и сравнение ответных реакций сои, выражающихся в изменении активности перокси-дазы, 1—>3-|3-В-глюканазы и трех гликозидаз (P-D-глюкозидазы, P-D-галактозидазы и ct-D-маннозидазы), как ферментов, участвующих в метаболизме, связанном с защитными процессами растений. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Провести скрининг образцов мировой коллекции дикорастущей сои Glycine Willd и сортов культурной сои Glycine max [L.] (Merrill), дифференциаторов штаммов вируса мозаики сои, а также различных сортов сои с целью подбора растений с одинаковыми фазами развития, но различающихся по устойчивости к ВМС.
Изучить распределение инфекционности и антигена среднепатогенного штамма вируса мозаики сои в растениях сои с разной реакцией на заражение.
Изучить участие в инфекционном процессе различных по устойчивости сортов пероксидазы и 1—>3-ртО-глюканазы - ферментов, связанных с патогенезом и метаболизмом углеводов и фенольных соединений.
5 4. Сравнить ответные реакции сортов сои на ВМС выражающихся в изменении активности P-D-глюкозидазы, P-D-галактозидазы, и a-D-маннозидазы.
Научная новизна.
Впервые изучено количественное распределение антигена вируса мозаики сои в растениях сои с разной устойчивостью к вирусу методом электрофореза антигена осажденного из сока листьев высокоспецифичной антисывороткой. Выявлено, что антиген вируса может транспортироваться в крайне устойчивых растениях сои сорта Dewamusume, но уровень накопления его очень низок (от 0,02 до 0,23мкг/см2 листа). Установлено, что со временем происходит деструкция антигена. Изучено влияние вируса мозаики сои на активность пероксидазы и ферментов углеводного обмена в листьях крайне устойчивого (Dewamusume) и восприимчивого (Приморская 529) сортов сои в вегетативной стадии роста. Показана, наибольшая метаболическая активность пероксидазы по сравнению с другими ферментами. Впервые показано, что активирование фермента пероксидазы при вирусном заражении восприимчивого сорта сои обусловлено вкладом кислого (pi 4,0) и щелочного (pi 8,9) изоферментов. Установлено, что крайне устойчивый сорт сои характеризуется более высоким уровнем активности 1->3-р-Б-глюканазы и отличным от восприимчивого сорта набором изо-форм пероксидазы.
Практическая значимость работы:
Выявленные большая урожайность сорта сои Dewamusume, по сравнению с урожайным сортом-стандартом Приморская 529, обусловленная высокой степенью ветвления и большим количеством бобов в пересчете на одно растение, а так же устойчивость к вирусу мозаики сои, позволяют рекомендовать его для использования в селекционной практике с целью выведения урожайных и устойчивых к ВМС сортов. Сорт Dewamusume можно использовать как дополнительный дифференциатор ВМС, так как первичные листья этого сорта в юве-нильной стадии роста после инфицирования вирусом мозаики сои реагируют образованием единичных локальных некрозов. По результатам распределения инфекционности и антигена ВМС в восприимчивом сорте Приморская 529 рекомендуются оптимальные сроки сбора листьев для выделения вируса. Это критический лист, на котором образуются первые симптомы заболевания, и листья выше формирующихся узлов через 2-3 недели после заражения или через 1-2 недели после проявления симптомов заболевания, вместо 35-40 дней, как было принято ранее [Поливанова, 1975; Пинкевич, 1977; Какарека, 1995]. Реко-
мендуется для определения инфекционности вируса мозаики сои на листьях индикаторного растения фасоли обыкновенной сорта Top Crop использовать первичные листья растения-индикатора до раскрытия 1-го тройчатого листа. Подсчет некрозов проводить после высушивания листьев индикатора в гербарии, при этом некрозы становятся выпуклыми, а артефакты повреждения после механической инокуляции нивелируются, что облегчает подсчет и увеличивает достоверность результатов.
Апробация работы:
Результаты исследований были представлены на конференциях молодых ученых (МГУ, Москва, 1984; ТГУ, Тбилиси, 1985; ИФР, Москва, 1986); VIII Всесоюзном совещании "Теория и практика использования иммунитета с.-х. культур к вирусным болезням" (Вильнюс, 1984); международных конгрессах XIV биохимическом (Praha, Czechoslovakia, 1988) и XVI ботаническом (Missouri, USA, 1999) и 10-й международной конференции вирусологов растений (Praha, Czechoslovakia, 1989); IV съезде ВОФР (С.-Петербург, 1999); региональной конференции к 70-летию ВИР (Владивосток, 1999); Всероссийской конференции "Химия и технология растительных веществ" (Сыктывкар, 2000); конференции ТИБОХ ДВО РАН "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии" (Владивосток, 2000); международном симпозиуме "Сознание и наука: взгляд в будущее" (Владивосток, 2001); международной конференции "Bioresourses and viruses" (Kiev, Ukraine, 2001).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 127 страницах, содержит 15 таблиц, иллюстрирована 13 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, экспериментальной части, обсуждения результатов и выводов. Список литературы представлен 257 работами, из которых 192 зарубежных авторов.
Вирус мозаики сои
Вирус мозаики сои (ВМС), вызывающий мозаичные заболевания рас- тений сои, наиболее распространенная болезнь этой экономически важной сельско-хозяйственной культуры во всех соесеющих регионах мира [Bos, 1972]. Симптомы заболевания весьма разнообразны. Больные растения ниже здоровых или, наоборот, вытянутые, слабые. Отмечаются различного рода деформации: листья, скрученные только у основания или по всей длине, превращаются в трубочку; жилки второго порядка сближаются с главной жилкой и листочки принимают узкую ланцетовидную форму [Поливанова, 1977; Irwin, 1981; Lim, 1985]. Вирозные растения образуют меньше бобов, часто серповидной формы с отсутствием опушения, с худшей наполненностью, результатом этого является снижение урожайности на 30-40%, а в неблагоприятные годы до 70% и более [Поливанова, 1980]. Кроме того, семена, выросшие на пораженных растениях, имеют радиальную пигментацию коричневого цвета, что осложняет рафинирование масла и ухудшает его качество. Содержание белков и жиров в пигментированных семенах снижено [Omar et al., 1985].
Факторами повсеместного распространения ВМС являются: передача вируса семенами и распространение насекомыми переносчиками, в основном тлями [Maury et al., 1985; Дьяконов, 2002]. Зараженность посевов к концу вегетации зависит от погодных условий года (влияющих на численность переносчиков) и обычно колеблется в пределах 40-70%, в неблагоприятные годы может достигать 90% [Irvin, Schultz, 1981; Крылов, 1992; Гнутова и др., 1996]. К счастью вирионы ВМС имеют свойство инактивироваться в семенах в период хранения, в результате чего предпосевная зараженность семян составляет только 6-15% [Maury et al., 1983; Diaco et al., 1985; Гнутова, 1993]. Этого инфекционного начала оказывается достаточно для повторного перезаражения в период вегетации. Все возделываемые на Дальнем Востоке сорта сои поражаются ВМС [Поливанова, Крылов, 1985; Гнутова и др., 1996]. Проявление симптомов у разных сортов сои неодинаково. Симптомы в виде слабой мозаики могут быть маскированы в период высокой температуры [Omar et al., 1985]. Некрозы и некротизацию жилок вызывают суровые штаммы ВМС. По результатам визуальной оценки проявления симптомов и диагностики капельной серологической реакцией с антисывороткой все циркулирующие на Дальнем Востоке изоляты ВМС были разделены на 3 группы: слабые, средние, сильные [Рейфман с сотр. 1977; Поливанова, 1980]. Слабые штаммы не оказывают на развитие растений сильного влияния, симптомы на сое проявляются в виде мозаики и морщинистости. Растения образуют плоды с жизнеспособными семенами. Распространены в основном в Амурской области. Для штаммов средней патогенности характерна яркая мозаика, скручивание в трубочку, пузырчатость, резкая морщинистость листьев растений сои. Распространены во всех районах возделывания сои и выделены. Сильный штамм (некротический) был выделен из единичных растений [Поливанова, 1980]. В Приморье он вызывает пожелтение листьев и нередко некроз верхушки. Симптомы проявляются в виде системных некрозов, потемнения листьев, резкой морщинистости, задержки роста растений. Для пораженных растений характерна желто-зеленая окраска. Больные растения отличаются слабым развитием с не полной выполненостью бобов и серповидностью последних. Семена, собранные с зараженных растений, имеют низкую всхожесть и редкие из них передают вирус [Поливанова, Крылов, 1985 ]. Случается, что растения погибают, не успев образовать семена. При заражении в эксперименте все исследуемые сорта восприимчивы к сильному штамму, но не все из них передают вирус семенами. Все штаммы обуславливают на семенах пигментацию радиального типа, характерную для ВМС [Поливанова и др., 1977; Irwin, 1981]. Японские фитовирусологи дифференциацию штаммо-вого разнообразия вируса мозаики сои проводят на основе различной реакции сортов-дифференциаторов и классифицируют циркулирующие изоляты ВМС на 5 штаммов [Tokahashi et al., 1980]. В зависимости от набора сортов дифференциаторов в литературе имеются и другие классификации [Cho & Goodman, 1979; Chen et al., 1988a; Chen et al., 1988b; Lim, 1985]. К настоящему времени не выявленно иммунологических различий между штаммами ВМС [Hill, Benner, 1980].
В соответствии с морфологическими признаками вирус мозаики сои относят к группе Потивирусов (Potiviridae). ВМС представляет собой гибкую частицу размером 750x15нм. В соке вирус сохраняется в течение 3-4 дней при комнатной температуре и сохраняет инфекционность при разведении 104. Для гибких вирионов этой группы характерна спиральная симметрия с шагом спирали 3,4 нм [Hollings, Brant, 1981а]. Геном потивирусов представлен од-ноцепочечной плюс РНК с мМ около 3,0-3,5 mDa и длиной «более 9000 нук-леотидов [Hollings, Brant, 1981b]. Например, мМ РНК УВК составляет 3,0-3,5 mDa [Mattheus, 1982], ВМС 3,02 mDa [Hill, Benner, 1980], BMT - 3,5 mDa [Tomlinson, 1970, Цит. по Моисеенко, 1998]. Вирусные РНК потивирусов имеют поли (А) последовательность на 3 - конце [Vance, Beachy, 1984b; Reichmann et al., 1992]. Седиментационные диаграммы представителей рода Potyviras, как правило, обнаруживают наличие одной седиментирующей зоны в препаратах. Коэффициент седиментации вирусных частиц этой группы колеблется от 140 до 160 S (УВК - 150-160S; ВМС - 147S; ВЖМФ - 143 S). Плавучая плотность вирионов варьирует от 1,31 до 1,33 г/см [Vance, Beachy, 1984а].
Для большинства потивирусов молекулярная масса (мМ) структурного белка определена методом электрофореза в полиакриламидном геле. По данным Хиберта с сотрудниками мМ нативного белка оболочки ВМС сотавляет 32,0-33,9 kDa [Hiebert et al., 1984]. В тоже время Пинкевич при определении молекулярной массы структурного белка ВМС методом электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующей системе были обнаружены два белковых компонента: 1-е молекулярной массой 28,11 и II - 32,64 kDa [Пинкевич, 1977]. В зависимости от времени хранения вирусного препарата наблюдался спонтанный переход компонента II в белок I и появление нового дополнительного быстродвижущегося белка с молекулярной массой" 25,57 kDa. , [Atabekov, Taliansky, 1990; Maia et al., 1996]. Одной из вероятных причин такого спонтанного изменения структуры белка ВМС может быть гидролиз его протеазами [Irwin, 1981; Vance, Beachy, 1984a].
Изучение распределения инфекционности вируса мозаики сои по сортам сои с различной устойчивостью
Логика эксперимента состояла в том, что изучение накопления и распределения ВМС по растениям проводили в вегетативной стадии роста до цветения, в течение Зх и более недель после механической инокуляции первичных листьев ювенильных растений (2х-недельных проростков) с периодичностью 1 неделя. Это совпадало с формированием нового узла и тройчатого листа в нем [Fehr W.R. et al, 1971].
Одним из чувствительных методов определения вируса в растениях и даже количественного их определения является использование растений,реа-гирующих после инфицирования образованием локальных некрозов. Круг растений-хозяев для ВМС ограничен, известны некоторые виды мари и фасоли [Bos, 1972, Milbrath, Soong, 1976]. Наиболее удобны в работе первичные листья фасоли сорта Top crop, реагирующие на инфицирование ВМС образованием точечных некрозов (рис. 3). Так как с ростом листа чувствительность к вирусам изменяется [Метьюз, 1973], предварительно проводили тестирование различных вариантов листьев растения-индикатора на чувствительность к ВМС (рис. 4). Наибольшую чувствительность проявляли первичные листья фасоли в ювенильной стадии роста с нераскрывшимся первым настоящим тройчатым листом. Результаты распределения инфекционности ВМС по листьям поражаемого сорта и развитие симптомов заболевания представлены в таблице 4. Через 1 и 3 дня после заражения первичных листьев восприимчивого сорта сои Приморская 529 инфекционность первичных листьев и листьев 1-го узла не выявлена. Через 7 дней после заражения гомогенаты первичных листьев и листьев отрастающего 2-го яруса вызывали образование единичных некрозов на /4 листа фасоли Top crop. На 10-й день после заражения гомогенат из тройчатого листа 2-го узла вызывал образование 123±27 некрозов. Определение ВМС в молодом растущем листе 2-го узла сои поражаемого сорта совпадает с появлением на нем первых мозаичных симптомов, посветление жилок (первичная мозаика). На 14-й день опыта, когда раскрывался лист 3-го узла и на нем появлялись мозаика и деформация (скручивание), инфекционность гомогенатов из листьев 2-го и 3-го узлов значительно возрастала. Через 21 день, с развитием листа 4-го узла и образозованием на нем мозаики, скручивания и пузырчатости, инфекционность листа была наибольшей.
Гомогенаты листьев 2-го и 3-го узлов также вызывали множество некрозов на листьях индикаторного растения. Распределение инфекционности ВМС в листьях сои Приморская 529 через 28 дней после заражения первичных листьев в двух сериях характерных опытов отражало также высокий уровень содержания ВМС в листьях 2-5-го и иногда 6-го узлов, что совпадало и с развитием симптомов.
Определение растительных вирусов по инфекционности гомогенатов листьев считают одним из чувствительных методов (Журавлев, 1979, Matthews, 1981). Однако при тестировании на инфекционность гомогената тройчатого листа 1-го узла поражаемого сорта, во все сроки опыта, кроме 28-го дня, получен отрицательный результат. Через 4 недели после инфицирования гомогенаты из листьев 1-го узла вызывали образование единичных некрозов. Инфекционность гомогенатов первичных листьев была значительно меньше по сравнению с инфекционностью листьев 2-го и выше узлов, где развивались типичные симптомы заболевания (табл. 4).
Параллельно проводили заражение и определение инфекционнцсти ВМС в листьях сои сорта Dewamusume. Следует отметить, что во всех опытах ни один гомогенат листьев тех же узлов не вызывал образование некрозов на листьях фасоли Top crop, поэтому мы не стали представлять их в таблице. Первичные листья сорта Dewamusume в ювенильной стадии роста иногда через 9-10 дней после инокуляции ВМС реагировали образованием единичных ржаво-коричневых локальных поражений (некрозов), не более 1-3 на лист (рис. 5). При переносе растений в камеру с температурой 32С инфекция ВМС в Dewamusume не переходила в системную. В соке листьев различных узлов и из некрозов на первичных листьях инфекционность ВМС не выявляли. Так же не было обнаружено нитчатых частиц вируса электронно-микроскопическими исследованиями. При помещении инкулированных ВМС растений Dewamusume в камеру с температурой ниже 15С количество некрозов увеличивалось.
Определение изоферментного спектра пероксидаз
Спектр пероксидазы листьев сои Приморская 529 представлен 10 изо-формами, локализующимися при изоэлектрофокусировании в интервале рН от 4,0 до 8,9, у Dewamusume обнаружено 9 изоферментов в этом же интервале рН (рис. 10); в листьях устойчивого сорта отсутствовал изофермент с pi 4,6. Этот же изофермент отсутствовал и в спектре изоформ связанной пероксидазы листьев устойчивого сорта. Остальные изоформы связанной пероксидазы исследуемых растений были представлены одинаковым набором молекулярных форм фермента в диапазоне рН 4,7 - 8,9. Не обнаружено появления дополнительных изоформ фермента в ответ на заражение вирусом восприимчивого сорта сои Приморская 529.
Рост активности пероксидазы в восприимчивом сорте сои Приморская 529, инфицированном ВМС, обусловлен увеличением активности двух пред-существующих изоферментов: при проявлении спектра изоформ пероксидазы после изоэлектрофокусирования на ПААГ-пластинках с субстратом бензидином изоферменты с pi 8,9 и с pi 4.0 окрашиваются с большей интенсивностью (рис. 10, 11). Более интенсивное, чем в контроле, окрашивание этих изоформ было характерно и для связанной фракции пероксидазы. Остальные изоформы фермента окрашивались при действии субстрата (бензидин) слабее. Таким образом, щелочной (катионный) изофермент с pi 8,9 и кислый (анионный) - с pi 4.0 определяют увеличение активности фермента пероксидазы в системно инфицированных растениях восприимчивого сорта сои Приморская 529.
Кроме того, следует отметить, что увеличение активности пероксидазы с ростом листьев сои обоих сортов происходит в большей степени за счет увеличения активности щелочного или катионного изофермента с pi 8,9 и появления нейтральных изоформ пероксидазы (рис. 11).
Выявленный полиморфизм по количеству и активности изоферментов пероксидазы сравниваемых сортов давал основание предполагать связь его с устойчивостью сорта к ВМС. С этой целью поиск был расширен до 14 сортов (табл. 10, рис. 12). Сорта,в которых изофермерт с pi 4,6 отсутствует,были: Ои 13, Dewamusume, Norin 2 и Nemashiradsu, но среди этой группы сортов устойчивостью ко всем штаммам обладает только сорт Devvamusume, другие проявляли разную степень устойчивости к штаммам В и С. Среди сортов То Х kashlnogaha Ou 3 и Norin 4 этот изофермент проявлял минимальную актив ность. В третьей группе сортов с максимальным проявлением активности нзофермента с pi 4,6 были сорта с различной степенью устойчивости к штаммам ВМС (Siromane, Harosoy, Peking, Kariutakia, Приморская 529, При-морская 429) и дикорастущая соя Glycine ussuriensis. Следовательно, выявленный полиморфизм изоформ пероксидазы в различных сортах не дает оснований связывать его с устойчивостью сои к вирусу мозаики.
Гликозидазы сортов сои
По сравнению с пероксидазой и 1—»3-Р-0-глюканазой гликозидазы в листьях сои характеризуются значительно меньшим уровнем активности (рис. 9, табл. 13-15). Среди гликозидаз наименьшей активностью обладает Р-D-глюкозидаза: от 0,02 до 0,18 мкМ/Імин/Іг сырого веса ткани (рис. 9, табл. 13). По уровню активности p-D-галактозидаза занимает промежуточное положение среди тестируемых гликозидаз: от 0,02 до 0,40 мкМ/1мин/1г сырого рого веса ткани (табл. 14). Наивысшую удельную активность среди гликозидаз проявляет a-D-маннозидаза: от 0,30 до 0,78 мкМ/1мин/1г сырого веса ткани (табл. 15). Следует отметить, что в раскрывающихся тройчатых листьях каждого узла удельная активность a-D-маннозидазы была сопоставима или даже превосходила удельную активность 1— 3-Р-0-глюканазы (табл. 11, 15).
Для p-D-глюкозидазы и p-D-галактозидазы наблюдается обратная, в сравнении с пероксидазой и 1-»3-Р-0-глюканазой, закономерность изменения активности с ростом листа. В течение 4 недель опыта активность этих ферментов в сформированных листьях уменьшается вдвое и больше. Уровень активности a-D-маннозидазы с ростом листа не менялся у обоих сортов. Не было выявлено связи между активностью изученных гликозидаз и заражением ВМС. По уровню активности гликозидаз не установлено различий между сортами.
Для определения концентрации вирусов в растениях имеются три основных подхода или метода: непосредственный подсчет количества вирио-нов в помощью электронного микроскопа; определение относительной концентрации инфекционного начала путем подсчета некрозов на инокулиро-ванных листьях растений-индикаторов и определение относительной концентрации вирусного антигена в растительных тканях иммунологическими методами [Журавлев, 1979]. Пределы чувствительности этих методов различны [Шмыгля, 1987; Реунов, 1999]. В проведенном исследовании распределение вируса мозаики в различных по устойчивости сортах сои проводили прямым подсчетом локальных некрозов на индикаторном растении (по ин-фекционности) и количественным (по определению антигена вируса) методами. При механическом заражении первичных листьев, после длительного латентного периода, статистически значимые количества инфекционных частиц среднепатогенного штамма ВМС появляются в первичных инокулированных листьях и в листьях 2-го узла через 7-10 дней после заражения восприимчивого сорта (табл. 7). Это согласуется с результатами Гера и Толина [Gera, То-Пп, 1994], которые идентифицировали вирус в инокулированных листьях восприимчивого сорта через 6-7, а в срединной жилке листьев вирус определяли через 8-9 дней после инокуляции ВМС. Появление инфекционных частиц вируса в листьях 2-го узла совпадает с образованием мозаичных симптомов, что согласуется с фактом приуроченности мозаичных симптомов к местам усиленного синтеза вирусов [Журавлев, 1979; Matthews, 1981]. Подобная картина распределения вируса сохраняется и через 21 день после заражения: в листьях верхнего узла содержание ВМС выше, чем в ниже расположенных.
Опираясь на данные других авторов и теорию движения ассими-лятов в растении, можно интерпретировать полученные результаты таким образом, что в течение раннего вегетационного периода роста сои после ла 90 тентного периода (7-10 дней) ВМС перемещается по проводящим сосудам флоэмы с током ассимилятов в молодые отрастающие листья с наивысшей аттрагирующей способностью (табл. 7). Подтверждением этому являются: отсутствие вирусных частиц в сформированном первом тройчатом листе и появление некротизащш жилок на обратной стороне листа в тройчатом листе 2-го узла поражаемого сорта, по-видимому, "критического", в котором был зафиксирован высокий уровень инфекционности гомогенатов.
