Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
Кристаллический дельта-эндотоксин и данные о механизме его действия на насекомых 10
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 34
ВЛИЯНИЕ ДЕЛЬТА-ЭНДОТОКСИНА НА Mg2+-3ABHCИМУЮ АТФазу НАСЕКОМЫХ 45
Действие дельта-эндотоксина in vitro на препараты, содержащие АТФазную активность .. 46
Изучение действия дельта-эндотоксина на устойчивые виды (на примере капустнойсовки) 53
Изменения АТФазной активности в процессе воздействия дельта-эндотоксина in vivo на насекомых 56
СВЯЗЬ МЕЖДУ ИЗМЕНЕНИЕМ КОНЦЕНТРАЦІЙ НЕКОТОРЫХ ИОНОВ И АКТИВНОСТИ Mg2+ -ЗАВИСИМОЙ АТФазы НАСЕКОМЫХ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ДЕЛЬТА-ЭНДОТОКСИНА 67
ЦИТОТОКСИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ДЕЛЬТА-ЭНДОТОКСИНА ВАС. THURINGIEHSIS ... 78
6.1. Цитотоксическое действие дельта-эндотоксина 78
6.2. Разобщающие свойства дельта-эндотоксина ... 92
6.3. Спектральное изучение свойств дельта-эндотоксина 98
7. ВОЗМОЖНОСТЬ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 105
ВЫВОДЫ НО
ЛИТЕРАТУРА 112
- Кристаллический дельта-эндотоксин и данные о механизме его действия на насекомых
- Действие дельта-эндотоксина in vitro на препараты, содержащие АТФазную активность
- СВЯЗЬ МЕЖДУ ИЗМЕНЕНИЕМ КОНЦЕНТРАЦІЙ НЕКОТОРЫХ ИОНОВ И АКТИВНОСТИ Mg2+ -ЗАВИСИМОЙ АТФазы НАСЕКОМЫХ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ДЕЛЬТА-ЭНДОТОКСИНА
- ЦИТОТОКСИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ДЕЛЬТА-ЭНДОТОКСИНА ВАС. THURINGIEHSIS
Кристаллический дельта-эндотоксин и данные о механизме его действия на насекомых
Высокая токсичность химических пестицидов для теплокровных и полезных насекомых, с одной стороны, и развитие у вредителей устойчивости к ним - с другой, объясняют возросший в последнее время интерес к биологическому методу борьбы. Микробиологический метод, как составная часть биологического, основан на регуляции численности насекомых - вредителей с помощью энтомопато-генных микроорганизмов и их продуктов.
В настоящее время микроорганизмы используются в форме микробиологических инсектицидов и интродукций, способствующих 1 возникновению эпизоотии в популяциях вредных насекомых и стойкому сохранению микроорганизма в новых условиях среды.
Большое внимание уделяется применению микробиологических препаратов, которые обладают такими важными качествами, как безвредность для теплокровных, в том числе и человека, способность снижать численность вредителя до экономически неощутимых уров -ней благодаря высокой вирулентности, относительная простота размножения, низкая себестоимость, хорошая устойчивость при хранении, простота и легкость применения. Бактериальные препа -раты отвечают всем перечисленным требованиям. Более того, в отличие от химических, бактериальные препараты не обладают контактным действием, специфичны и активны.
Чаще всего применяются препараты на основе поражающей многочисленные виды Lepidoptera энтомопатогенной спорообразующей бактерии Bac.thuringiensis , такие как дендробациллин, инсек-тин, ; энтобактерин и другие.
Большой вклад в создание отечественных бактериальных препаратов внесли работы советских ученых В.П.Поспелова, Е.В.Талала-ева, Э.К.Африкяна, А.Б.Гукасяна, Н.И.Исаковой, Н.В.Кандыбина, А.Я.Лесковой, В.И.Поспелова и других микробиологов.
Bac.thuringiensis являєтся спорообразующей аэробной кристаллофорной бактерией. Вегетативные клетки ее палочковидные, с закругленными концами, величиной 0,8 - 1,2 х 3 - б мк,обладают активной подвижностью, грамположительны. Споры овальные, продолговатые, 0,б - 0,9 х 1,3 - 1,6 мк (Африкян, 1973; Гулий с соавт., 1981).
Действие дельта-эндотоксина in vitro на препараты, содержащие АТФазную активность
В результате проведенных нами экспериментов было обнаружено, что дельта-эндотоксин, полученный методом щелочного гидролиза, вызывает in vitro значительное увеличение ферментативной активности препаратов, полученных из целых гусениц,головного мозга и кишечника боярышницы (Aporia crataegi L. ) іу возраста, капустной СОВКИ (Mamestra brasaicae L. ) ІУ возраста И обыКНОвен -ного соснового пилильщика (Diprion ріпі L. ) УІ-УП возрастов (табл. 2-4). Для того, чтобы выяснить, не является ли способность гидролизовать АТФ свойством самого дельта-эндотоксина, были про - V7 ведены опыты по изучению его действия на этот субстрат в условиях которых обычно проводили ферментативную реакцию,но в отсутствии фермента. Было обнаружено, что дельта-эндотоксин не способен катализировать гидролиз АТФ с высвобождением фосфата. Исследование же дельта-эндотоксина в отсутствии как фермента, так и субстрата показало, что он также не может являться поставщиком свободного фосфата в реакционную среду.
СВЯЗЬ МЕЖДУ ИЗМЕНЕНИЕМ КОНЦЕНТРАЦІЙ НЕКОТОРЫХ ИОНОВ И АКТИВНОСТИ Mg2+ -ЗАВИСИМОЙ АТФазы НАСЕКОМЫХ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ДЕЛЬТА-ЭНДОТОКСИНА
Как отмечалось выше, изменения концентрации ионов к , ifa+ , Са + и Mg2+ в гемолимфе и кишечной ткани - проявление дейст -вия дельта-эндотоксина на биохимическом уровне, на которое прежде всего обращают внимание исследователи (Pendleton , 1970а; Smirnoff and Valero , 1980 и другие). Было убедительно доказано, что речь может идти только о нарушении активного транспорта через мембрану, так как эндотоксин не является ионофором, спо -собным переносить ионы через мембрану (Faust et ai ., 1978; Иі-shiitsutsuji-Uwo et al ., 1979).
Известно, что АТФазы ответственны за активный перенос ио нов через мембрану клетки или ее органелл ( Skou , I965;Albers 1967). Результаты предыдущей главы показывают, что Mg -зависимая АТФаза различных тканей насекомых сильно активируется под действием дельта-эндотоксина как в опытах in vitro , так и in vivo . Степень ее активирования находится в прямой зависимости ОТ ВОСПРИИМЧИВОСТИ вида К Bac.thuringiensis . В связи с этим очень важным представляется выяснить, является ли вызываемое дельта-эндотоксином нарушение уровней концентрации ионов к+ , Ua+, +2 2+ Са , Mg в гемолимфе и кишечниках насекомых следствием воз -действия на активность Mg2+-зависимой АТФазы. Для этого изучали влияние дельта-эндотоксина in vivo на концентрации этих ионов в гемолимфе и активность фермента кишечной ткани у двух видов насекомых, чувствительных к действию Вас. thuringiensis : монашенки ІУ возраста и непарного шелкопряда ІУ возраста. Гусеницам монашенки вводили перорально токсин в концентрации 0,5 мг/мл, а непарного шелкопряда - I мг/мл.
В таблицах 8-ІІ представлены результаты проведенных исследований. Их анализ показывает, что концентрация ионов калия начинала изменятся только в промежуток времени 15-30 мин после введения токсина (табл. 8, 10). В то же время,активность Mg --зависимой АТФазы повышалась уже спустя 1-5 мин после обработки гусениц дельта-эндотоксином (табл. 10). У контрольных насекомых, которым вместо раствора дельта-эндотоксина вводили 0,04 н NaOH , являющийся обычным растворителем токсина, нейтрализованный до рН 7,5 для предотвращения возможного нежелательного влияния щелочности, достоверных изменений активности Mg -зависимой АТФазы кишечников и концентрации ионов в гемолимфе не наблюдали (табл. 9 и II). Степень активирования фермента пропорциональна измене -нию концентрации ионов калия в гемолимфе. У гусениц монашенки наблюдалось активирование Mg -зависимой АТФазы в 1,5-2 раза. Этому соответствовало увеличение концентрации к в гемолимфе в 1,3-1,7 раз (табл. 8). У непарного же шелкопряда активирование фермента в 2-6 раз вызывало увеличение концентрации ионов калия в 1,5-2,0 раза (табл. 10). Эти данные показывают также существование зависимости изменения обоих изучаемых биохимических параметров от концентрации вводимого токсина. Всё вышесказанное позволяет сделать однозначный вывод о том, что нарушение концентрации ионов калия является вторичным эффектом, связанным с влиянием дельта-эндотоксина на АТФазную систему насекомых.
Цитотоксические и биохимические свойства дельта-эндотоксина вас. Thuringiehsis
Известно, что дельта-эндотоксин Bac.thuringiensia , разложенный кишечным содержимым насекомых, действует на культуру клеток насекомых аналогично тому, как и на клетки кишечного эпителия, вызывая образование везикул, набухание и лизис клеток (Murphy et al ., 1976). Наблюдали изменения и в ультраструктуре клеток: увеличение в объеме и вакуолизацию ядра, эндоплазма ТИЧЄСКОГО реТИКулума, МИТОХОНДРИЙ ( Nishiitsutsuji-Uwo et al ., 1979; Johnson , 1981).
Целью настоящего исследования было проверить, оказывает ли дельта-эндотоксин, полученный в результате щелочного гидролиза, эффект, подобный полученному в результате обработки кишечным соком. Важным представлялось также выяснение вопроса, наступают ли изменения тонкой структуры клетки при неповрежденной цитоплазма-тической мембране и какова их временная последовательность. Для этого методом световой, электронной сканирующей и трансмиссионной микроскопии изучали клетки непарного шелкопряда, которые в течение I, 15, 30, 45 мин, I, 2, 3, б, 12, 24 и 48 ч инкубировали в присутствии растворов дельта-эндотоксина,полученных методами как щелочного гидролиза, так и гидролиза кишечным соком капустной белянки.
В ходе исследования было установлено, что первые изменения клеток по сравнению с нормой (рис. 9) наблюдаются уже через одну минуту инкубации клеток с дельта-эндотоксином. При действии токсина, полученного щелочным гидролизом, клетки начинали вакуоли -зироваться через этот промежуток времени. Степень вакуолизации возрастала с увеличением продолжительности инкубации и была весьма значительной через 15 мин (рис. 10). В это же время появ-ляются первые признаки разрушения клеток (рис. II). Мембраны клеток истончены. Ядра приобретают зернистость,сильно набухают. Через 3 ч инкубации практически все клетки разрушены (рис. 12).
При действии на клетки токсина, обработанного кишечным соком, характер изменений клеток был тем же самым, однако патология клеток протекала значительно быстрее. Так,например, отдельные разрушенные клетки появлялись уже через одну минуту. После 15 мин не обнаружено ни одной целой клетки.
В контроле при обработке клеточной культуры нейтрализованным до рН 7,5 раствором 0,04- н. гидроокиси натрия каких либо изменений по сравнению с интактньми клетками обнаружено не было (рис. 9). При обработке кишечным соком без дельта-эндотоксина наблюдали лишь очень слабую вакуолизацию даже через три часа инкубации.
