Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Теоретические и экспериментальные основы применения суб- и сперкритических флюидных сред для экстракции и модификации биологически активных соединений 11
1.1 Основные этапы развития химии и физики сверхкритических сред 1.2 Суб- и суперкритические флюиды как среда для экстракции и модификации биологически активных соединений 18
1.2.1 Экологически чистые процессы экстракции растительных метаболитов, основанные на свойствах суперкритических флюидов и среды субкритической воды 18
1.2.2 Экологически чистые процессы экстракции биологически активных соединений, основанные на свойствах субкритической воды 30
1.2.3 Основные направления использования субкритической воды как среды и реагента для органических реакций 42
Глава 2. Субкритическая вода как среда для экстракции биологически активных растительных метаболитов и получения их «спроектированных» смесей 51
2.1 Разработка экологически чистых методов (без использования органических растворителей) экстракции и химической модификации в среде субкритической воды растительных метаболитов, имеющих фармацевтический и коммерческий потенциал 51
2.1.1 Экстракция биофлавоноидов из растительного сырья 51
2.1.2 Эстракция фенилкарбоновых кислот в среде субкритической воды
2.1.3. Экстракция тритерпеновых растительных метаболитов 98
2.2. Исследование состава «спроектированных» в среде
субкритической воды смесей растительных метаболитов 126
Глава 3 Гидролитические трансформации модельных растительных метаболитов 142
3.1. Гидролиз растительных метаболитов в среде субкритической воды 142
3.1.1. Разработка метода гидролиза рутина в кверцетин в среде субкритической воды 142
3.1.2 Разработка и изучение метода гидролиза экстракта корня солодки в среде субкритической воды 147
3.2 Изомеризация модельных растительных метаболитов в среде субкритической воды 157
3.3 Реакция конденсации в среде субкритической воды: синтез циклотривератрилена 164
з
Глава 4. Изучение комплексообразования тритерпеновых растительных метаболитов при помощи методов масс-спектрометрии 171
4.1. Самоассоциация и комплексообразование глициризиновой кислоты 171
4.1.1 Процессы самоассоциации молекул глициризиновой кислоты: квантовохимическое и масс-спектрометрическое исследование 171
4.1.2 Квантово-химическое и масс-спектральное исследование тримолекулярных комплексов молекул модельного производного бензимидазола и глицирризиновой кислоты 183
4.2. Самоассоциация и комплексообразование тритерпеновых сапонинов плюща 198
4.2.1. Масс-спектрометрия самоассоциации и комплексообразования тритерпеновых сапонинов плюща и холестерина 198
4.2.2 Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением супрамолекулярных комплексов модельных фармаконов и тритерпеновых сапонинов плюща 209
Выводы 249
Список сокращений 251
Список использованных источников 253
- Экологически чистые процессы экстракции растительных метаболитов, основанные на свойствах суперкритических флюидов и среды субкритической воды
- Экстракция биофлавоноидов из растительного сырья
- Разработка и изучение метода гидролиза экстракта корня солодки в среде субкритической воды
- Квантово-химическое и масс-спектральное исследование тримолекулярных комплексов молекул модельного производного бензимидазола и глицирризиновой кислоты
Введение к работе
Актуальность проблемы. Развитие методологии использования экологически безопасных методов экстракции и химической модификации растительных метаболитов для получения физиологически активных субстанций из источников растительного происхождения является одним из приоритетных и бурно развивающихся направлений современной медицинской химии. Замена дорогостоящих и токсичных органических растворителей на экологически чистые суперкритические флюиды и субкритические жидкости, такие как СО2 или вода, является одним из наиболее перспективных подходов к решению таких задач и соответствует основным принципам «Зеленой химии». В последнее десятилетие для экстракции и химической модификации физиологически активных соединений активно используется субкритическая вода (вода в жидком состоянии под давлением при температурах от 100оС до 374оС). Для России, с ее богатейшими растительными ресурсами, применение экологически чистой, доступной и недорогой субкритической воды в технологических процессах взамен дорогостоящих и, зачастую, токсичных органических растворителей, открывает широчайшие перспективы применения в промышленности. Поэтому, исследования, направленные на разработку экологически чистых методов экстракции и химической модификации физиологически активных соединений в среде субкритической воды, являются актуальными и имеют огромный практический и инновационный потенциал.
Цели работы: Развитие и изучение методов экстракции и химической модификации в среде субкритической воды растительных метаболитов, имеющих фармацевтический и коммерческий потенциал, установление состава и свойств полученных продуктов с использованием масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением и других современных физико-химических методов (спектроскопии ЯМР, ИК и т.д.).
Задачи исследований:
1) Разработка и изучение экологически чистых методов (без использования
органических растворителей) экстракции и химической модификации в среде
субкритической воды растительных метаболитов, имеющих фармацевтический и
коммерческий потенциал.
2) Разработка методов определения состава и свойств растительных экстрактов с
использованием комплекса физико-химических методов.
-
Изучение строения и устойчивости супрамолекулярных комплексов тритерпеновых растительных метаболитов и модельных фармаконов при помощи методов квантовой химии.
-
Разработка методов использования масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением для изучения строения и свойств супрамолекулярных комплексов на базе модельных фармаконов.
Научная новизна.
Впервые среда субкритической воды систематически использована для экстракции и химической модификации ряда полифенольных, алкалоидных и тритерпеновых растительных метаболитов:
а) впервые разработаны методики для извлечения ряда тритерпеновых сапонинов
растительного происхождения: глицирризиновой кислоты из корня солодки; аралозидов
из аралии манчжурской и сапонинов плюща – физиологически активных растительных
метаболитов, имеющих значительный фармацевтический потенциал.
б) впервые среда субкритической воды использована для синтеза глицирретиновой
кислоты - физиологически активного соединения, которое широко используется в
медицинской практике;
в) впервые предложено среду субкритической воды использовать при получении из «спроектированных» смесей биофлавоноидов шелухи лука, имеющих значительный фармацевтический потенциал;
Впервые в среде субкритической воды реализована реакция изомеризации природного алкалоида апорфинового ряда глауцина в фенантреновый алкалоид дес-глауцин, имеющий значительный потенциал для создания противокашлевых субстанций, не вызывающих наркотического эффекта.
Впервые в среде субкритической воды реализована реакция синтеза макроциклических соединений циклотривератрилена и циклотетравератрилена -потенциальных «курьеров» при получении фармацевтически приемлемых низкодозных субстанций.
Впервые с использованием масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением зарегистрировано образование самоассоциатов глицирризиновой кислоты, строение которых предсказано при помощи методов квантовой химии. Предложенные методики масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением использованы для изучения строения супрамолекулярных комплексов тритерпеновых сапонинов (глицирризиновой кислоты солодки и хедерагенинов плюща) с модельными фармаконами.
Практическая ценность работы. Реализованы принципиальные преимущества использования среды субкритической воды для извлечения физиологически активных растительных метаболитов из группы биофлавоноидов и тритерпеновых сапонинов.
Разработаны методы изучения строения продуктов и анализа состава смесей, полученных как в результате экстракции из природных объектов, так и в ходе химических реакций в среде субкритической воды, с использованием жидкостной хроматомасс-спектрометрии с ионизацией электроспреем.
Предложены экологически безопасные методы получения физиологически активных биофлавоноидов в среде субкритической воды, обладающих широким спектром терапевтического действия (антиоксидантное, капилляроукрепляющее действие и др.), присущего как индивидуальным веществам из группы флавоноидов, так и их смесям, что позволяет создавать на их основе большое число лекарственных форм. Предлагаемые методы экстракции и синтеза в среде субкритической воды, как правило, более эффективны и экологически безопасны по сравнению с традиционными подходами, основанными на использовании дорогостоящих и, зачастую, токсичных органических растворителей. Предлагаемые подходы открывают возможности получения перспективных с фармакологической точки зрения соединений в экологически чистых реакционных средах.
Апробация работы. Основные результаты работы представлены на III Международной научно-практической конференции “Сверхкритические флюидные технологии: инновационный потенциал России”, (Ростов-на-Дону; 11-12 октября 2006); IX Международном Семинаре по магнитному резонансу (спектроскопия, томография, экология) 15 – 20 сентября 2008 год; V Международной научно-технической конференции “Актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики, физики и химии. БФФХ-2009”, (Севастополь, 21–25 апреля 2009); IV, V Международной конференции по новым технологиям и приложениям современных физико-химических методов (Ростов-на-Дону, 18-22 сентября 2007, 1 - 5 июня 2009), V Международной научно-практической конференции «Сверхкритические флюиды: фундаментальные основы, технологии, инновации» (Суздаль, 15–18 сентября 2009); III Всероссийской конференции «Аналитика России» (г. Краснодар, 27 сентября – 2 октября 2009 г.), X Международном Семинаре по Магнитному Резонансу г. Ростов-на-Дону, 2 - 7 марта 2010, VI Международной научно-техническая конференция “Актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики, физики и химии”, Украина, г. Севастополь, 26 – 30 апреля 2010, I международной конференции серии ChemWasteChem: “Химия и полная переработка биомассы леса”, Санкт-Петербург (Репино), 14–18 июня 2010 г, IV Всеросс. конференции-школы:
“Фундамент. вопросы масс-спектрометрии и её аналитические применения” Звенигород, 10-14 октября 2010, 12th International Symposium MATERIALS, METHODS & TECHNOLOGIES (MMT), Sunny Beach, Bulgaria June 11 – 15, 2010, VII Международной научно-технической конференции “Актуальные вопросы биологической физики и химии”. Севастополь. Украина. 26 – 30 апреля 2011, Всероссийской научной конференции (с международным участием) “Успехи синтеза и Комплексообразования”, г. Москва, 18 по 22 апреля 2011, International Conference “Renewable Wood and Plant Resources: Chemistry, Technology, Pharmacology, Medicine”. Санкт-Петербург, 21-24 июня 2011. VI Научно-практической конференции «Сверхкритические флюиды (СКФ): фундаментальные основы, технологии, инновации». Иркутск, 4 - 7 июля 2011г, VI Международная конференции по новым технологиям и приложениям современных физико-химических методов, Ростов-на-Дону, 31 августа - 4 сентября 2011, VIII Международная конференция "Спектроскопия координационных соединений" г. Туапсе, Краснодарский край, Россия 19-23 сентября 2011, VIII Международной научно-технической конференции «Актуальные вопросы биологической физики и химии. БФФХ – 2012», 23 - 27 апреля 2012, IX Всероссийской конференции с международным участием «Спектроскопия координационных соединений», 13 - 19 сентября 2012.
Работа выполнена при поддержке грантов президента РФ ведущих научных школ (НШ-363.2008.3, НШ-3233.2010.3, НШ-927.2012.3), грантов Министерства образования и науки РФ (РНП 2.2.2.23915 и 2.1.1.4939), Американского фонда гражданских исследований и развития (CRDF США) по Российско-американской программе “Фундаментальные исследования и высшее образование” (гранты CRDF BP3C04, BP4M04) и грантов РФФИ (11-03-12141-офи-м-2011).
Полученные в работе результаты частично использовались при реализации ряда проектов по программе Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере СТАРТ-06 (г/к 4366р/6813).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 49 работ, включая 27 статей в рецензируемых российских (список ВАК) и зарубежных журналах, 22 работы опубликованы в материалах и тезисах докладов международных и всероссийских конференций. Получено 6 патентов РФ.
Личное участие автора. Автору принадлежат замысел, формулировка задач исследования, обоснование выбора объектов, необходимых для решения поставленной задачи. Автор разрабатывал направление научного поиска, руководил постановкой экспериментов, принимал личное уч астие в работе по экстракции и модификации растительных метаболитов в среде субкритической воды и проведению масс-спектрометрического эксперимента.
Объем и структура диссертации.
Экологически чистые процессы экстракции растительных метаболитов, основанные на свойствах суперкритических флюидов и среды субкритической воды
Под экстракцией в среде субкритической воды (СБВЭ), понимают экстракцию с использованием в качестве растворителя горячей воды под давлением (температура 100 С - 374С). СБВЭ - интенсивно развиваемые в последнее десятилетие методики для замены традиционных методов экстракции с использованием органических растворителей. Субкритическая водная экстракция – экологически дружественная методика, которая может обеспечить высокий выход экстракта из твердых образцов [88]. Субкритическая водная экстракция выполняется с использованием горячей воды (от 100 до 374 C, 374 C) при высоком давлении - достаточном, чтобы вода оставалась в жидком состоянии.
В последнее десятилетие субкритическая водная экстракция привлекает все большее внимание, в первую очередь, из-за уменьшения полярности воды с возрастанием температуры. Первые применения субкритической воды (1994 год) были нацелены на извлечение экологических поллютантов из загрязненных почв, отложений, и отстоев [93, 94]. Позднее начали применять субкритическую воду для экстракции биологически активных соединений из растительного материала [95-102]. Развиты модели, для предсказания растворимости органических соединений в воде, с целью оценки возможности их экстракции субкритической водой [103,104]. Также исследовалась стабильность органических соединений в воде при высоких температурах [105-107].
Экспериментальная установка, используемая для субкритической водной экстракции, в целом весьма проста (Рисунок 11). В основном, установка состоит из водного резервуара, соединенного с насосом высокого давления для ввода растворителя в систему; нагревательного элемента, куда помещается камера, в которой проходит экстракция, и редукционного клапана (рестриктор) для поддержания заданного давления в проточной системе. Экстракты собираются в склянку, помещенную в конце системы. Кроме того, для быстрого охлаждения протекающего экстракта система может быть оборудована устройством охлаждения.
Экспериментальная схема установки по экстракции субкритической водой. ПК - продувочный клапан, РПК – редукционно-предохранительный клапан, БТК – блок температурного контроля, ЭК – экстракционная камера, ЕСЭ – емкость сбора экстрактов, ЕСО – емкость сбора отходов
Возможности соединения системы субкритической водной экстракции (Рисунок 11) с оборудованием высокоэффективной жидкостной хроматографии для выделения целевых продуктов в он-лайн-режиме изучено в работах [108-110]. Субкритическая водная экстракция широко используется для извлечения различных компонентов из растений. Одним из наиболее хорошо изученных субкритической водной экстракцией материалов был розмарин (Rosmarinus officinalis L.).
Для того чтобы определить степень селективности экстракции антиоксидантных компонентов Ибаниз и др. [111] исследовали экстракцию антиоксидантных компонентов из розмарина в среде субкритической воды в широком диапазоне температур (от 25 до 200 C). Отмечено влияние температуры на выход экстракции, который увеличивался при более высоких температурах. Авторы подтвердили, что главным компонентом экстракта, извлеченного при низких температурах (25оC), было самое полярное соединение - розманол. При 200оC, способность воды растворять полярные соединения уменьшалась и, одновременно, увеличивалась концентрация в экстракте других, менее полярных соединений, типа карнозиновой кислоты.
Экстракт антиоксидантов, полученный в среде субкритической воды сопоставим с экстрактом. полученным при использовании суперкритического углекислого газа. В дополнение к извлечению антиоксидантов, из розмарина [112] возможна субкритическая водная экстракция ароматических соединений. С использованием субкритической воды были изучены чабер (Satureja hortensis) и мята (Mentha piperita) [113].
Проведено сравнение эффективности субкритической водной экстракции с традиционными методами (типа Soxhlet). Экстракты гвоздики (Syzygium aromaticum) [114] демонстрировали, что количество эвгенола (1 -окси - 2 - метокси - 4 - аллилбензол), полученного с использованием субкритической воды при 150 C, сравнимо с извлеченным с применением традиционной Сокслет - экстракции и дистилляцией паром. Эвгенол и его ацетаты обладают антиоксидантными свойствами, подобными другим естественным компонентам, типа -токоферола [115].
Необходимо отметить, что использование субкритической водной экстракции, обеспечивает множество преимуществ перед традиционными методами (то есть дистилляцией). Ими являются: малое время экстракции, более высокое качество экстрактов (главным образом для эфирных масел), низкие затраты экстрагента и экологически совместимая методика, поскольку не используется органические растворители. Эти преимущества подтверждены для субкритической водной экстракции нескольких растений, типа лавра [116], сладкого укропа [117], орегана [118] и кава [119].
Озел и др. [120] исследовали извлечение эфирного масла из растения фимбры колючей (Thymbra spicata). Изучено влияние нескольких параметров: температуры (100, 125, 150 и 175C), давления (20, 60 и 90 бар) и скорости потока (1, 2 и 3 мл/мин.). Установлено, что максимальный выход экстракта (3,7 %) получен при 150 C и 60 бар, скорости потока 2 мл/мин. для 30 мин. Найдено, что эфирные масла Timbra spicata, сдерживают рост мицелия нескольких разновидностей грибов [120].
Субкритическая экстракция также применялась для извлечения антиоксидантных соединений из микроводорослей S. platensis [121]. Проводилось исследование с использованием этанола под давлением в качестве экстрагента [112, 122]. Денери и др. [122] исследовали извлечение каротиноида из микроводорослей Haematococcus pluvialis и Dunaliella salina, используя этанол выход экстракта сопоставим с выходом, полученным при использовании традиционных методов извлечения.
Полиненасыщенные жирные кислоты, содержащиеся в семенах льна, могут быть потенциально полезными для предупреждения сердечнососудистых заболеваний, улучшения состояния кожи и волос, в том числе и как профилактическое средство против рака. Содержащиеся в пределах оболочки, окружающей льняное семя, соединения - лигнаны обладают антивирусными, антибактериальными и противогрибковыми свойствами, являясь одновременно мощным антиоксидантом, иммуномодулятором и фитоэстрогеном [123,124].
Экстракция биофлавоноидов из растительного сырья
Аралозид C (молекулярная масса 1086 дальтон, С5зН84О2з) (Рисунок 55) - тетраозид, содержащий по одному остатку D-глюкозы, D-глюкуроновой кислоты, D-галактозы, D- ксилозы [211].
Аралозид С, представляющий собой олеаноловой кислоты 3-О-[-D-глюконопиранозил-(13)--Ь-арабинозил]-28-О--0-глюкопиранозид, который впервые выделен в индивидуальном состоянии из корней момордики Momordica cochinchinensis, позже найден в семенах Chenopodium pallidwaule [212].
Аралозиды А, В и С представляют собой белый или желтоватый аморфный порошок, хорошо растворимый в воде, метиловом и этиловом спирте, нерастворимый в бензоле, хлороформе и эфире. Температура плавления колеблется в пределах от 184 до 190 оС [213].
Смеси этих аралозидов являются действующими веществами лекарственных средств «Настойка аралии» и «Сапарал», применяемых в качестве тонизирующего и иммунномодулирующего средства и близких по лечебному действию к препаратам женьшеня [214].
Исходным продуктом для лекарственных средств из аралии является концентрат «Сапарал» (ФС 42-1924-82), представляющий собой аморфный порошок кремового цвета без запаха с содержанием смеси аралозидов А, В и С не менее 80 %. Классическая схема экстракции включает применение в качестве экстрагентов и реагентов метанола, этилацетата, н-бутанола, активированного угля, соляной кислоты и гидроксида аммония [215], что приводит к необходимости регенерации и утилизации значительного количества растворителей и адсорбентов. С другой стороны, известно, что вода в области критической точки может выступать в качестве реагента, растворителя и катализатора [1], в том числе в субкритической области температур (100-374 оС) и давлений менее 22,1 МПа [216].
Основной целью данного этапа работы является разработка эффективных методик установления качественного и количественного состава смесей аралозидов, выделенных в среде субкритической воды из 108 корня аралии маньчжурской, с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием.
Экстракция аралозидов из корней аралии в среде субкритической воды проведена в статическом режиме. В герметичный реактор емкостью 10 см3 из нержавеющей стали помещали навеску сухого средне измельченного корня аралии и добавляли выбранный объем воды; герметично закрытый реактор помещали в термостат при температуре 140±2 оС на 1 ч.
Затем реактор охлаждали, осадок вместе с остатками корней отфильтровывали на бумажном фильтре (синяя лента); водный фильтрат пропускали через хроматографическую колонку (h = 20 см, = 1 см) c оксидом алюминия для хроматографии; фракцию аралозидов отделяли от смол и балластных веществ элюированием смесью ацетонитрил–вода в соотношении 35:65. После упаривания с применением роторного испарителя (температура упаривания не более 40 оС) получен сыпучий порошок коричневого цвета без запаха. Содержание аралозидов в полученном экстракте определено методом потенциометрического титрования и составило 12,2 ± 0,27 % суммы аралозидов, влажность равна 7,2 % после высушивания при температуре 102 ± 2 оС до постоянной массы.
Наличие и концентрация аралозидов А, В и С в полученных экстрактах определены методом потенциометрического титрования в соответствии с требованиями ГФ (Государственная фармакопея XI, том 2, статья 65 «Корни аралии маньчжурской» [217], а также методом высокоэффективной жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (ВЭЖХ/МС) с применением комплекса «Thermo Finnigan MSQ Surveyour», колонка ODS C18 5 мкм 1502,1 мм, градиентное элюирование ацетонитрил–вода от 5 до 95 об. % при температуре 40 оС и скорости потока 0,4 мл мин–1; ионизация электрораспылением при напряжении на конусе 70 В; продолжительность хроматографирования 25 минут. Молекулярная масса и фрагментация аралозидов исследована с применением тандемного масс-спектрометра «Thermo Finnigan LCQ Deca XP Max» с ИЭР с детектированием
109 положительных ионов [195]; применен прямой ввод экстракта пробы со скоростью 5 мкл мин–1; напряжение на конусе оптимизировано для каждого соединения; спектры МС/МС и МС/МС/МС получали с применением ионной ловушки и нормализованной энергии столкновений, обеспечивающей воспроизводимость результатов для различных МСn-спектрометров; величины заряда ионов определяли с использованием функции ZoomScan. Параллельно с комплексом ВЭЖХ/МС использован жидкостный хроматограф «Thermo Separation Products» с УФ-детектором с детектированием при длине волны 206 нм, колонка Cromasil С18 5 мкм 1504 мм, изократический режим элюирования смесью 0,005 М серная кислота– ацетонитрил в соотношении 65:35 при температуре 40 оС и скорости потока 0,8 мл мин–1, время хроматографирования 10 мин.
Качество исходных корней аралии маньчжурской соответствовало требованиям ГФ XI, том 2, статья 65 «Корни аралии маньчжурской» [217].
В качестве стандарта смеси аралозидов использован концентрат препарата «Сапарал» (ФС 42-1924-82) производства ЗАО «ВИФИТЕХ» с общим содержанием аралозидов 80,2 % в пересчете на сухой препарат.
Классический экстракт аралозидов получен по методике [211] экстракцией метанолом. Экстракт анализировался при помощи методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. На рисунке 56 представлена хроматограмма рутинного (метанольного) экстракта из корня аралии (с УФ-детектором с детектированием при длине волны 206 нм, колонка Cromasil С18 5 мкм 1504 мм).
Разработка и изучение метода гидролиза экстракта корня солодки в среде субкритической воды
Исследования показали, что субкритическая вода в интервале температур 110-160 С (с небольшим преимуществом температуры 130С по количеству извлекаемых сапонинов) в сочетании с 3% NH4OH, как экстрагента, является оптимальным для экстракции сапонинов. Добавка NH4OH служит для перевода малополярных сапонинов (плохо растворимых в воде), в водорастворимую аммониевую соль. В случае субкритической экстракции водой, без добавления NH4OH, температура 110 С - 160 С не достаточна для полного извлечения сапонинов.
Таким образом, оптимальные условия экстрагирования сапонинов из листьев плюща в субкритической воде следующие: температура 130 С, соотношение сырье: экстрагент 1:8, экстрагент: 3% NH4OH, масса сухих листьев плюща 1 г, объем экстрагента 8 мл, время экстрагирования 60 минут.
Сырье (листья плюща) измельчают с помощью лабораторной мельницы. Методика экстракции листьев плюща, заключается в следующем: навеску 1 г сухого среднеизмельченных листьев плюща (3 - 5 мм), помещают в реактор из нержавеющей стали, емкостью 10 см3 и добавляют 8 мл 3% раствора аммиака. Плотность загрузки сырья определяют следующим образом: навеску листьев плюща, массой 1 г помещают в мерный цилиндр и отмечают величину объема, который заполняет данная навеска, рассчитывают массу измельченного корня в объеме 1 см3. Реактор герметично закрывают с помощью разводных ключей и помещают в сушильный шкаф с температурой 140 С на 1 час. Затем реактор охлаждают до комнатной температуры (около 30 минут) в емкости с холодной водой. Содержимое реактора (корни и экстракт) количественно переносят в коническую колбу объемом 100 мл, промывают реактор дистиллированной водой. Далее содержимое колбы отстаивают в течение нескольких часов до полного оседания балластных веществ. После чего, экстракт фильтруют с помощью воронки Бюхнера с бумажным фильтром, колбы Бунзена и водоструйного насоса. Измеряют объем отфильтрованного экстракта. Отбирают аликвоту экстракта, содержащую сапонины плюща, очищают фильтрованием под вакуумом через фильтр 0,45 мкм для дальнейшего анализа с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии. Оставшийся жидкий экстракт, содержащий сапонины, выливают в фарфоровую чашку и упаривают до густого состояния на водяной бане, затем количественно переносят на поддон с целлофаном и сушат при температуре до 100 С под вентилятором. Высушенный экстракт переносят в ступку и растирают до однородного порошка. Полученный экстракт взвешивают. Средняя масса полученного экстракта составляет 25% от исходной массы листьев плюща.
Таким образом, разработана экологически дружественная методика экстракции листьев плюща с использованием субкритической воды, позволяющая получить максимальный выход сапонинов.
По всей территории России и ближнего зарубежья широко распространено выращивание такой сельскохозяйственной культуры, как репчатый лук. Лук содержит различные фитохимические субстанции и служит ценным их источником для укрепления здоровья. Установлено, что потребление лука, уменьшает риск развития рака легких, пищевода и желудка [225-227]. Например, в экспериментах с использованием свиней в качестве биомедицинской модели, показано, что лук приводит к снижению в крови общего холестерина, липопротеинов и триглицеридов, которые используются в качестве индикаторов риска сердечно-сосудистых заболеваний [228]. Кроме того, экстракты лука продемонстрировали антитромботическую активность in vitro и in vivo в экспериментах на мышах [229] и антитромботический эффект у больных диабетом крыс, при использовании модели сахарного диабета, вызванного инъекцией стрептозотоцина [230].
Важнейшими, функционально значимыми соединениями, присутствующими в луке и его отходах, являются широко используемые флавоноиды. Этот класс полифенольных соединений, содержащихся в экстрактах многих растений, характеризуется наличием в составе молекул бензопиранового гетероцикла и гидроксильных групп, взаимодействующих с агрессивными радикалами с образованием малоактивных радикалов семихинонного типа [162, 231, 232]. В луке обнаружено большое количество различных флаваноидов [233], в первую очередь гликозиды кверцетина – рутинозиды (РУ) (рутин XX, Рисунок 63, рамнетин) и кверцетин I (КВ).
Флавоноиды являются спазмолитическими и гипотензивными средствами, и уже используются для профилактики сердечно - сосудистых заболеваний, наряду со своими производными входят также в состав других широко распространнных лекарственных средств и биологически активных добавок.
Квантово-химическое и масс-спектральное исследование тримолекулярных комплексов молекул модельного производного бензимидазола и глицирризиновой кислоты
В настоящее время активно ведутся работы по созданию низкодозных лекарственных субстанции на основе глицирризиновой кислоты XII и известных базовых физиологически активных компонентов (фармаконов) [252-253], обеспечивающих уменьшение эффективных доз лекарственных препаратов в 100 - 200 раз [254]. В таких субстанциях, молекулы глицирризиновой кислоты выступают в роли полидентантных лигандов, образующих с фармаконами нековалентные супрамолекулярные комплексы различной стехиометрии. Для установления фундаментальных связей структура – свойства важно изучение механизмов образования таких комплексов по типу «гость-хозяин», где сапонин, в качестве молекулы-«хозяина», может образовывать в гидрофильной среде эндолипофильную полость для молекулы-«гостя» [255]. Ранее с использованием квантово-химических расчетов и масс-спектрометрии показано [261], что молекулы глициризиновой кислоты Гк образуют устойчивые самоассоциаты кластеров общего вида Xn (n=6). Установлено, что самоассоциаты глицирризиновой кислоты, образующиеся из двух и более молекул, имеют полость, достаточную для включения соразмерных молекул-гостей.
Целью данной работы было изучение формирования и определение состава этих комплексов с использованием масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением. Для определения строения и устойчивости комплексов были проведены квантово-химические расчеты супрамолекулярных комплексов глицирризиновой кислоты (XII) ГК и модельного фармакона - 9-диэтиламиноэтил–2,3–дигидроимидазо[1, 2 - а] бензимидазола БМЗ (XLVII) (Рисунок 95).
Молекулярные комплексы глицирризиновой кислоты с производным бензимидазола XLVII, использованные в масс-спектрометрических экспериментах, были синтезированы в лаборатории В. А. Анисимовой в НИИФОХ ЮФУ
Исследованные объекты являются удобными модельными структурами как для дизайна низкодозных лекарственных субстанций нового поколения [252-254], так и для изучения процессов формирования нековалентных супрамолекулярных субстанций [255-256].
Для доказательства формирования супрамолекулярных комплексов была использована масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением, по аналогии с ранее использованной нами [261]. Съемки масс-спектров проведены при помощи масс-спектрометра «Bruker Daltonics micrOTOF-Q» с вводом пробы напрямую ионизацией электрораспылением. Детектирование отрицательных и положительных ионов проводилось в интервале от 50 до 3000 Да с точностью не менее 110–2Да. Напряжение на капилляре распылителя ±4200 В, параметры газа-осушителя (азот «осч», 5 л/мин, 200С) и энергия ионов на квадруполе (5,0 эВ) оптимизированы для детектирования пиков псевдомолекулярных и ассоциатных ионов. Для прямого ввода взяты растворы в ацетонитриле (фирма Merck, квалификация HPLC/MS) в концентрации до 0,2 мг/мл (10–710–6 М).
Ввиду большого размера исследуемых систем все квантово-химические расчеты проводились при помощи пакета программ Gaussian-03 полуэмпирическим методом PM3 [262]. Исследована возможность образования супрамолекулярных кластеров ГК и фармакона БМЗ различного состава в условиях газовой фазы и с учетом влияния растворителя (воды) в явном виде. Все приведенные структуры соответствуют точкам минимума на соответствующих ППЭ. При этом, энергия комплексообразования супрамолекулярных субстанций рассчитывалась как разность полной энергии соответствующего комплекса и суммы полных энергий всех молекул, которые его образуют. Графические изображения молекулярных структур, представленные на Рисунок 102 -104, получены с использованием программы Chemcraft [260], где в качестве исходных данных использовались расчетные данные.
Для изучения процессов формирования нековалентных супрамолекулярных комплексов глицирризиновой кислоты получены масс спектры набора комплексов ГК и модельного фармакона - БМЗ (C15H22N4 2НCl), Mw(d)=258,36), имеющих различную стехиометрию. Формирование комплексов производного бензимидазола и глицирризиновой кислоты исследовано методами масс-спектрометрии в образцах при различных соотношениях хозяин:гость (1:1, 2:1, 3:1, и 4:1). В данном случае в роли «хозяина», определяющего формирование супрамолекулярной структуры, использована глициризиновая кислота ГК, самоассоциаты которой имеют полость, достаточную для включения соразмерных молекул-гостей [261].
В масс-спектрах смеси ГК и БМЗ регистрировали пики, принадлежащие как протонированным ионам и катионам молекул глицирризиновой кислоты и бензамидазола, так и соответствующим комплексам, состоящие из мономеров, димеров, тримеров и тетрамеров глицирризиновой кислоты с включением одной, двух и четырех молекул производного бензимидазола (XLVII).
