Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Литературный обзор 12
1.1. Магнитные наночастицы: основные понятия и характеристики 12
1.1.1. Намагниченность, однодоменность и суперпарамагнетизм 12
1.1.2. Стабилизация магнитных коллоидных систем и агрегирование магнитных наночастиц 17
1.1.3. Адсорбционные процессы на поверхности магнитных наночастиц в водных дисперсиях 1.2. Применение магнитных наночастиц в биологии и медицине 22
1.3. Многофункциональные покрытия на магнитных наночастицах 28
1.3.1. Основные требования, предъявляемые к покрытиям наночастиц, используемых для биологических целей 28
1.3.2. Покрытия на основе ПАВ и синтетических полимеров 31
1.3.3. Покрытия на основе природных макромолекул 35
1.3.4. Кремнийорганические и неорганические покрытия 38
1.3.5. Модификация покрытий биовекторами и лекарственными препаратами 39
1.4. Заключение 40
Глава II. Материалы и методы исследований 43
2.1. Методика получения водных дисперсий магнитных наночастиц 43
2.2. Методика подготовки образцов 47
2.2.1. Дисперсии магнитных наночастиц 47
2.2.2. Полимерные пленки 47
2.2.3. Подготовка образцов для исследования адсорбции макромолекул на магнитных наночастицах 48
2.3. Методика получения покрытий на магнитных наночастицах 53
2.4. Методы исследования 55
2.4.1. Электронный магнитный резонанс 55
2.4.2. Динамическое и упругое светорассеяние 65
2.4.3. ИК- и УФ-спектроскопия 67
2.4.4. Атомно-силовая микроскопия 67
2.4.5. Биохимические исследования 68
Глава III. Анализ информативности спектров ФМР магнитных наночастиц в жидких и твердых средах 69
3.1. ФМР магнитных наночастиц в водной дисперсии и полимерных пленках 69
3.1.1. Экспериментальные спектры магнитных наночастиц в водной дисперсии 69
3.1.2. Экспериментальные спектры магнитных наночастиц в полимерных пленках, приготовленных в отсутствии магнитного поля 72
3.1.3. Экспериментальные спектры магнитных наночастиц в полимерных пленках, приготовленных в магнитном поле 74
3.1.4. Анализ изменения параметров спектров ФМР магнитных наночастиц в водных дисперсиях и полимерных пленках. Определение намагниченности частиц по спектрам магнитного резонанса 76
3.2. Анализ температурных зависимостей спектров ФМР магнитных наночастиц в полимерных пленках и вязкой среде 85
3.3. Заключение 92
Глава IV. Исследование адсорбции макромолекул на поверхности магнитных наночастиц 95
4.1. Метод спиновых меток в исследовании адсорбции макромолекул на магнитных наночастицах. Основы подхода 95
4.2. Подходы к количественному описанию адсорбционных процессов 102
4.3. Адсорбция синтетических полимеров на поверхности наночастиц и процессы кластеризации 104
4.3.1. Адсорбция полиэтиленимина и его производных 104
4.3.2. Адсорбция сополимера N-винилпирролидона и аллилглицидилового эфира 113
4.4. Адсорбция природных макромолекул на поверхности магнитных наночастиц 116
4.4.1. Адсорбция фибриногена 116
4.4.2. Адсорбция сывороточного альбумина 126
4.4.3. Адсорбция тромбина 128
4.4.4. Адсорбция иммуноглобулина G 129
4.5. Конкурентные адсорбционные процессы на поверхности магнитных наночастиц 131
4.6. Заключение 137
Глава V. Получение устойчивых белковых покрытий на поверхности магнитных наночастиц 141
5.1. Покрытия из сывороточного альбумина 142
5.1.1. Методика получения покрытий 142
5.1.2. Контроль устойчивости покрытий 143
5.1.3. Контроль избирательности сшивания 147
5.2. Покрытия из тромбина 148
5.2.1. Методика получения покрытий 148
5.2.1. Контроль устойчивости покрытий 149
5.2.3. Контроль сохранения функциональной активности тромбина в составе покрытия 149
5.3. Покрытия из иммуноглобулина G 151
5.3.1. Методика получения покрытий 151
5.3.2. Контроль устойчивости покрытий 151
5.3.3. Контроль сохранения функциональной активности иммуноглобулина G в составе покрытия 152
5.4. Заключение 154
Выводы 156
Литература 158
Благодарности 186
- Намагниченность, однодоменность и суперпарамагнетизм
- Экспериментальные спектры магнитных наночастиц в водной дисперсии
- Адсорбция фибриногена
- Контроль сохранения функциональной активности иммуноглобулина G в составе покрытия
Намагниченность, однодоменность и суперпарамагнетизм
Одним из главных параметров магнитного состояния является объемная намагниченность (магнитный момент ц единицы объёма тела V) или массовая намагниченность (магнитный момент единицы массы т) [23]
Единица измерения намагниченности в системе СИ - 1 Ам"1, в системе единиц СГС - эргТс" см, 1 эргТс" -см = 1 Гс = 10J Ам"1. В иностранной литературе часто используется единицы измерения emu-см"J или emu-г"1, где emu - единица измерения магнитного момента. В дальнейшем при описании магнитных свойств мы будем рассматривать объемную намагниченность.
Намагниченность насыщения массивных материалов определяется, в первую очередь, природой материала и температурой среды. Так, например, намагниченность Ni при 77 К составляет 490 Гс [24], а при 298 К 486 Гс [25], намагниченность Fe при температуре близкой к 0 К равна 1752 Гс, а при комнатной температуре 1714 Гс [25], намагниченность Gd при 77 К 2640 Гс [24]. Намагниченность насыщения наночастиц, как правило, меньше намагниченности массивного образца и снижается с уменьшением размера МНЧ [26-28]. Этот эффект объясняется отличием магнитных свойств поверхностного слоя и ядра МНЧ [26], а также процессами окисления поверхности [27, 28].
Массивные магнитные материалы имеют многодоменную структуру, в которой однородно намагниченные участки разделяются между собой доменными стенками в результате достижения баланса между магнитостатической энергией (AEms), которая возрастает пропорционально объему образца, и энергией формирования доменных стенок (ECJW), пропорциональной площади стенки между доменами [29]. Малые частицы могут быть однодоменными и проявлять свойство суперпарамагнетизма. В этом случае энергия доменных стенок превосходит магнитостатическую энергию, удерживающую образец в намагниченном состоянии. Критический размер, соответствующий состоянию однодоменности, может достигать десятков и сотен нанометров в зависимости от природы материала. Например, диаметр однодоменности для Fe составляет 15 нм, для Ni - 55 нм, для Fe304 - 128 нм, для SmCo5 - 750 нм [21, 30]. Величина магнитного момента однодоменной частицы пропорциональна ее объему.
Под действием внешнего магнитного поля многодоменные и однодоменные частицы перемагничиваются по разным механизмам. Перемагничивание многодоменных частиц происходит в результате движения доменных стенок.
Преобладающим механизмом перемагничивания для однодоменных частиц является процесс синхронного (когерентного) вращения индивидуальных атомных магнитных моментов (магнетонов Бора) [31]. Этому процессу препятствует зависимость магнитных свойств материала от направления - магнитная анизотропия, величина которой пропорциональна константе магнитной анизотропии К и объему образца [32]. Энергия магнитной анизотропии наночастицы Еа зависит от направления вектора намагниченности наночастицы по отношению к кристаллографическим осям и возрастает при увеличении угла между вектором намагниченности и осью легкого намагничивания [33]. Направление, соответствующее минимальной энергии, называется направлением магнитокристаллической анизотропии или осью легкого намагничивания (рис. 1.1).
Ось легкого намагничивания
Общее направление вектора намагниченности частицы определяется магнитокристаллической анизотропией (константа Ка), анизотропией формы (константа Ksh). которая возникает вследствие размагничивающих полей в образце. и анизотропией поверхности (константа Ks), обусловленной отличием симметрии окружения поверхностных атомных магнитных моментов от объемных (ориентация поверхностных спинов не совпадает с направлением спинов в объеме) [34, 35]. Размагничивающим полем называют собственное магнитное поле тела, возникающее вследствие воздействия на него внешнего поля и направленное против него. Размагничивающее поле является функцией размагничивающего фактора, котором будет подробнее рассказано в Разделе 2.4.1. Для сферических образцов размагничивающие поля равны нулю и увеличиваются при удлинении объекта (Ksh 0).
Взаимодействия различных соединений с поверхностью наночастиц приводят к изменению электронного окружения поверхности частиц [20] и могут приводить к изменению степени окисления атомов, входящих в состав МНЧ [36]. Нанесение как органических, так и неорганических покрытий влияет на магнитную анизотропию и намагниченность наночастиц по причине изменения объемного соотношения ядро/оболочка, размера и формы частиц, появления поверхностных дефектов. В работе [37] проведен анализ влияния различных покрытий на геометрические, электронные и магнитные свойства частиц кобальта с диаметрами менее 10 нм. Есть данные о том, что покрытие одного и того же состава, например, покрытие из золота, уменьшает магнитную анизотропию МНЧ кобальта и увеличивает магнитную анизотропию МНЧ железа по сравнению с объемным кобальтом и железом соответственно [38]. Противоположные воздействия покрытий были описаны в работе [15]. Покрытия из кобальта увеличивали намагниченность МНЧ оксидов железа, а покрытия из углерода, золота и серебра уменьшали ее. Это можно было бы связать с наличием у кобальта магнитных свойств, однако, увеличение намагниченности МНЧ оксидов железа происходило также при нанесении на них покрытий из платины и палладия. Чем толще покрытие на МНЧ, тем сильнее его влияние на магнитные свойства МНЧ [39].
В условиях сильной магнитной анизотропии вектор магнитного момента удерживается вдоль оси легкого намагничивания. При слабой магнитной анизотропии в результате тепловых флуктуации может происходить перескок вектора от одной оси легкого намагничивания к другой (релаксация Нееля) [40]. С уменьшением размера частицы интенсивность движения вектора магнитного момента возрастает. Кинетику процесса перескока (время релаксации Нееля) можно описать, используя уравнение [41]: rN=r0(Ea)exp -± , (1.3) где т0(Еа) - предэкспоненциальный множитель, зависящий от энергии анизотропии. При Еа«кТ экспоненциальный множитель стремится к 1 и время релаксации
Нееля определяется предэкспоненциальным множителем, который уменьшается при увеличении энергии анизотропии. При Еа » кТ значение времени релаксации Нееля определяется экспоненциальным членом и быстро повышается с ростом Еа.
Экспериментальные спектры магнитных наночастиц в водной дисперсии
Спектр ФМР магнитных наночастиц в водной дисперсии (магнитной жидкости) представляет собой широкую линию гауссовой формы. На рис. ПІЛ показано изменение линий спектра ФМР магнитных наночастиц магнетита с размерами 12 нм в дисперсии в зависимости от их концентрации и температуры. В области 3400 Гс на всех спектрах присутствуют узкие слабые линии, которые, по-видимому, принадлежат изолированным ионам железа [340-342]. Особенностью наблюдаемых спектров гидрозолей магнетита является их раздвоение - появление в полях 2000-2500 Гс «низкопольной компоненты». Проведем анализ параметров спектров наночастиц с целью выяснения природы этой компоненты. Характеристические параметры спектров ФМР: положение максимума основного Нтах1 и дополнительного (низкопольного) максимума Нтал2 спектров, относительная интенсивность І2ІІ\ низкопольного максимума, ширина линии АН (расстояние между основными максимумом и минимумом) приведены в табл. III. 1 и Ш.2. Зависимости АН от концентрации и температуры для наглядности выведены на рис. Ш.2.
Как видно из табл. III. 1, Ш.2 и рис. Ш.2, ширина АН основного пика спектра ФМР растет с увеличением концентрации МНЧ в дисперсии и уменьшением температуры. По всей вероятности, причиной увеличения ширины линии с повышением концентрации является рост дипольного взаимодействия между магнитными частицами за счет уменьшения расстояния между ними. При предельно ослабленном дипольном взаимодействии (при концентрации МНЧ в гидрозоле менее 0,1 об.%) ширина линии при комнатной температуре составила 660 Гс.
Центру линии спектра ФМР МНЧ при комнатной температуре соответствует поле 3015 Гс (g = 2,25). При повышении температуры центр спектра ФМР МНЧ в гидрозоле с фиксированной концентрацией смещается в более высокие магнитные поля, при уменьшении - в низкие (рис. III. 1, б). Последний эффект сопровождается увеличением относительной интенсивности дополнительного пика. К анализу этих закономерностей мы перейдем в Разделе 3.1.4.
Появление в спектре ФМР МНЧ дополнительных пиков, относительная интенсивность которых увеличивается с понижением температуры (замедлением разупорядочивающего броуновского движения) и увеличением концентрации МНЧ в гидрозоле, может быть связано с формированием анизотропных структур МНЧ в магнитном поле спектрометра - линейных агрегатов. В исследуемом диапазоне температур и концентраций исследование угловых зависимостей формируемых в водной дисперсии в магнитном поле спектрометра анизотропных структур наночастиц не представляется возможным. Помещение МНЧ в твердые матрицы позволяет проводить анализ угловых зависимостей спектров ФМР как изолированных МНЧ, так и линейных агрегатов МНЧ.
Адсорбция фибриногена
Информация о доле адсорбировавшихся молекул была получена методом ЭПР-спектроскопии спиновых меток по изменению интенсивности первой компоненты азотного триплета 1+\ в результате добавления МНЧ в раствор фибриногена (ФГ). На рис. IV. 16 представлена зависимость доли адсорбированных макромолекул ФГ от концентрации наночастиц в системе «ФГ, 7 + МНЧ, 5» в фосфатном буфере с рН 8,5 через час после добавления МНЧ к раствору ФГ. Как следует из рисунка, доля адсорбированного белка находится в прямой зависимости от концентрации МНЧ в системе. Величина адсорбции ФГ составляет 4,2 мг/мг. При этом в адсорбционном слое оказывается 35 макромолекул (уравнение (IV.7)). Используя уравнения (IV.5) и (IV.6), определим толщину адсорбционного слоя вокруг наночастицы в предположении плотной упаковки молекул ФГ. Рассчитанная таким образом толщина (23 нм) является минимальной, диаметр МНЧ с адсорбционной оболочкой равен -58 нм. Ориентация макромолекул длинной осью по нормали к поверхности МНЧ будет приводить к формированию частиц с диаметром более 100 нм. Через -100 минут после добавления МНЧ в раствор белка интенсивность спектра спиновых меток в системе «ФГ, 3 + МНЧ, 5» уменьшается на -47%. Среднее количество молекул, адсорбируемых одной наночастицей, в этом случае равно -21, а толщина адсорбционного слоя в предположении плотной упаковки составляет около -19 нм. Диаметр наночастиц с адсорбционной оболочкой при этом равен -50 нм.
Исследование процесса формирования адсорбционной оболочки на поверхности МНЧ методом ЭПР-спектроскопии спиновых меток позволяет сделать вывод о том, что адсорбционное равновесие в системе устанавливается через 90 минут. Подтверждение этим данным можно найти при анализе систем, содержащих ФГ и МНЧ, методом ФМР. Как было показано в Главе III, сопоставление положения центра спектра в поле позволяет сделать качественный вывод о наличии и толщине адсорбционного слоя. При этом меньшее значение резонансного поля характеризует системы, в которых достигается меньшее расстояние между частицами и более сильные диполь-дипольные взаимодействия между частицами. На рис. IV. 17 приведены спектры ФМР МНЧ в дисперсии с концентрацией МНЧ 0,5 мг/мл в присутствии и в отсутствии ФГ. Центр спектра системы, содержащей ФГ и МНЧ, находится в более высоких полях по сравнению с центром спектра МНЧ (изменение положения центра спектра составляет 47 Гс), что объясняется формированием адсорбционной оболочки. Анализ изменения положения центра спектра системы в зависимости от продолжительности инкубации ФГ с МНЧ позволяет изучать кинетику адсорбции фибриногена на наночастицах (рис. IV. 18). Как видно из рисунка, при данных условиях эксперимента процесс адсорбции происходит наиболее активно в течение первых 40 мин., а адсорбционное равновесие в системе наступает через 80-90 минут после начала адсорбции. Частицы в дисперсии, имеющие на поверхности адсорбционный слой, который препятствует их сближению в магнитном поле спектрометра, могут называться «изолированными».
В течение 80 минут после добавления МНЧ к раствору ФГ наблюдается увеличение интенсивности светорассеяния раствора, свидетельствующее об увеличении молекулярной массы структур, формирующихся в системе вследствие связывания макромолекул с поверхностью МНЧ. Дальнейшая экспозиция приводит к седиментации частиц, что делает невозможным исследование системы методом упругого светорассеяния. В системе, содержащей ФГ с концентрацией 1 мг/мл, после добавления МНЧ (концентрация МНЧ в системе 0,165 мг/мл) была записана индикатриса рассеяния (рис. IV. 19). Молекулярную массу белковых кластеров определяли экстраполяцией на нулевой угол. Максимальное значение среднемассовой молекулярной массы белкового кластера наблюдалось на 75-й минуте адсорбции и составило 33 106 Да согласно уравнению (11.12). На рис. IV.20 представлена зависимость среднемассового числа молекул Nm фибриногена в частицах, формирующихся в результате адсорбции ФГ на МНЧ, в зависимости от продолжительности инкубации ФГ с МНЧ. Согласно расчетам в предположении, что только ФГ дает вклад в молекулярную массу, максимальное количество макромолекул в частицах составляет 95-100. что в 3 раза превышает число молекул в адсорбционном слое, определенное при исследовании системы методом спиновых меток. Это несоответствие может быть связано с формированием кластеров, включающих несколько агрегатов (МНЧ с адсорбционным слоем).
Предположение о формировании кластеров подтверждается методом динамического светорассеяния. Через 0,5 ч после добавления МНЧ в раствор ФГ с концентрацией 3 мг/мл в фосфатном буфере с рН 8,5 (система «ФГ, 3 + МНЧ, 5») на гистограмме распределения частиц по размерам наблюдаются два пика, соответствующие диаметрам 90 и -600 нм. После 1,5-часовой инкубации МНЧ в растворе ФГ пики смещаются и соответствуют диаметрам 70 и -470 нм. Бимодальное распределение по размерам в системе «ФГ, 3 + МНЧ, 5» указывает на протекание двух процессов - адсорбции молекул фибриногена на наночастицах и взаимодействия наночастиц в оболочках между собой с формированием крупных кластеров. С течением времени наблюдается компактизация структур, сопровождающаяся уменьшением их размеров. Формирование кластеров было также зафиксировано методом динамического светорассеяния в результате адсорбции на МНЧ макромолекул ФГ в системе «ФГ, 1 + МНЧ, 2,5» в фосфатном буфере с рН 6,5 (без NaCl), однако не наблюдалось в 0,15 М растворе NaCl при концентрации ФГ 1 мг/мл, а МНЧ 0,05 об.%. Этот результат свидетельствует о зависимости процесса формирования кластеров от ионной силы раствора.
Форма частиц в системе может быть определена по угловой зависимости усредненного фактора рассеяния, построенной в координатах Кратки и Порода [336]. Как видно из рис. IV.21, угловые зависимости усредненных факторов рассеяния, характеризующих пространственную организацию кластеров и агрегатов, кардинальным образом отличаются от угловой зависимости фактора рассеяния фибриногена, структуру которого можно аппроксимировать жестким стержнем. Экстремальный характер кривых указывает на сфероподобную форму кластеров и агрегатов, а смещение максимума в область малых углов рассеяния говорит о прогрессирующей компактизации структур с ростом молекулярной массы кластеров и агрегатов.
Контроль сохранения функциональной активности иммуноглобулина G в составе покрытия
Подготовка образцов для оценки функциональной активности IgG на поверхности МНЧ осуществлялась в два этапа. На первом этапе образцы «IgG-МНЧ-О» и «IgG-МНЧ-1» осаждали на магните Nd-Fe-B в течение 1 суток с последующим удалением надосадочного раствора. Контроль содержания белка в надосадочных растворах «IgG-МНЧ-О» и «IgG-МНЧ-1» по методу Бредфорда демонстрировал равенство концентраций белка в пределах ошибки эксперимента. На втором этапе к осадкам добавляли 200 мкл буфера и редиспергировали их с использованием УЗ диспергатора. Это приводило к разбавлению осадков в 5 раз. Сохранение функциональной активности IgG оценивали по их способности взаимодействовать с молекулами anti-IgG кролика. Известно, что в результате взаимодействия поликлональных антител с антигенными детерминантами молекул антигена могут образовываться белковые кластеры, обнаруживаемые различными иммунохимическими методами. В работе для оценки протекания реакции антиген-антитело был использован простой и информативный метод двойной радиальной иммунодиффузии. На рис. V.5 представлены картины преципитации при двойной радиальной иммунодиффузии для IgG образцов осадков с anti-IgG кролика. Как видно из рисунка, содержание IgG, обладающего функциональной активностью, в осадке образца «IgG-МНЧ-І» в 2-4 раза превышает содержание способного к реакции антитело-антиген IgG в осадке образца «IgG-МНЧ-О». Так, при разбавлении более чем в 16 раз осадка образца «IgG-МНЧ-О» преципитат плохо заметен или не образуется; для осадка образца «IgG-МНЧ-І» подобная ситуация наблюдается при разбавлении более чем в 64 раза. Преципитат не формируется при взаимодействии anti-IgG с осадком образца «0-МНЧ-О». Следует отметить, что преимущественное количество МНЧ не диффундирует в гель. По-видимому, эффект преципитации связан с макромолекулами, десорбировавшимися с поверхности МНЧ в процессе УЗ диспергирования образцов.
Содержание в системах свободного IgG было оценено методом Бредфорда после повторного осаждения. Для получения образцов к разбавленным осадкам добавляли 0,15 М NaCl с рН 7,3 в объемном соотношении 9:1 и подвергали полученные системы ультразвуковой обработке. Инкубированные в течение 1,5 часов образцы «IgG-МНЧ-О» и «IgG-МНЧ-І» повторно осаждали на магните. Анализ содержания белка в над осадочных растворах «IgG-МНЧ-О» и «IgG-МНЧ-І» показал, что содержание белка в случае «IgG-МНЧ-І» на 12% превышает содержание белка в надосадочном растворе «IgG-МНЧ-О» . Этот результат в совокупности с результатом для надосадочных растворов «IgG-МНЧ-О» и «IgG-МНЧ-І», представленным выше, свидетельствует о том, что УЗ обработка образцов «IgG-МНЧ-О» и «IgG-МНЧ-І» приводит к десорбции IgG с поверхности МНЧ с последующей адсорбцией IgG на МНЧ в случае «IgG-МНЧ-О» . В результате УЗ обработки образца «IgG-МНЧ-І» с поверхности МНЧ десорбируются ковалентно сшитые агрегаты макромолекул IgG. По-видимому, значительная часть агрегатов не может адсорбироваться на МНЧ ввиду пространственных затруднений и остается в надосадочном растворе. Очевидно, наличие таких агрегатов в осадке «IgG-МНЧ-І» и повторная адсорбция IgG на МНЧ в осадке «IgG-МНЧ-О» объясняют различие функциональной активности осадков «IgG-МНЧ-О» и «IgG-МНЧ-І», продемонстрированное методом двойной радиальной иммунодиффузии.
Результаты исследования покрытий из IgG позволяют сделать вывод о том, что процесс свободнорадикального сшивания может быть использован для закрепления этих макромолекул на поверхности МНЧ, поскольку свободнорадикальное окисление не нарушает функциональную активность IgG в составе покрытия.
