Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Влияние глюкокортикоидов на процесс программируемой клеточной гибели путем апоптоза в развивающемся головном мозге 12
1.1. Апоптоз — один из ключевых процессов формирования организма. Его значимость и молекулярные основы 12
1.1.1. Реализация апоптоза на молекулярном уровне. Основные семейства белков 13
1.1.1.1. Семейство каспаз 14
1.1.1.2. Семейство Bcl-2-подобных белков 15
1.1.1.3. Основные молекулярные пути запуска апоптоза 18
1.2. Апоптоз в развивающейся ЦНС 21
1.2.1. Значимость апоптоза в нормальном развитии ЦНС 21
1.2.2. Роль апоптоза при гипоксическом поражении развивающегося мозга...22
1.2.3. Значение экспрессии генов ключевых белков апоптоза в развитии ЦНС25
1.3. Глюкокортикоиды: их роль в развитии ЦНС и регуляции программируемой гибели клеток 28
1.3.1. Влияние глюкокортикоидов на развитие организма и ЦНС 31
1.3.2. Гипоксия и глюкокортикоиды 33
1.3.3. Глюкокортикоиды и апоптоз 35
1.3.3.1. Эффекты глюкокортикоидов на апоптоз в периферических тканях 36
1.1.1.3. Влияние глюкокортикоидов на апоптоз в головном мозге 37
ГЛАВА 2. Материалы и методы 42
2.1. Животные 42
2.2. Препараты и реактивы 42
2.3. Экспериментальные воздействия 42
2.3.1. Острое введение гидрокортизона 42
2.3.2. Однократное введение дексаметазона на 3 день жизни и последующий эпизод острой гипоксии через 4 часа после инъекции 43
2.4. Выделение образцов ткани мозга. 43
2.5. Выделение РНК 44
2.6. Оценка уровней мРНК Bcl-XL, Вах и каспазы-3 методом ОТ-ПЦР 44
2.7. Выделение суммарного белка и его разделение посредством одномерного денатурирующего гель-электрофореза 47
2.8. Оценка уровней белков Bcl-XL, Вах и каспазы-3 методом иммуноблота 48
2.9. Выделение ДНК 48
2.10. Анализ фрагментации ДНК 50
2.11. Оценка двигательной активности неонатальных крысят 50
2.12. Статистический анализ данных 51
ГЛАВА 3. Результаты 53
3.1. Уровень фрагментации ДНК и экспрессия генов апоптоза Bcl-XL, Вах и каспазы-3 в коре, стволе мозга, гиппокампе и мозжечке неонатальных крыс 53
3.2. Влияние глюкокортикоидов и гипоксии на массу тела, мозга и надпочечников крыс в неонатальном периоде развития 59
3.2.1. Масса тела, головного мозга и надпочечников через 6 часов после введения гидрокортизона 59
3.2.2. Масса тела, мозга и надпочечников неонатальных животных после однократного введения дексаметазона на 3 день жизни 61
3.2.3. Масса тела, масса мозга и надпочечников неонатальных животных после кратковременного 10-минутного эпизода гипоксии 63
33. Эффекты глюкокортикоидов на уровни мРНК и белка Bcl-XL, Вах, каспазы-3 и на
фрагментацию ДНК в неонатальном головном мозге крыс 63
3.3.1. Эффекты гидрокортизона на уровни мРНК и белка Bcl-XL, Вах и каспазы-3
через 6 часов после инъекции 64
3.3.1.1. Гиппокамп и кора головного мозга 64
3.3.1.2. Ствол головного мозга 70
3.3.1 J. Мозжечок 70
3.3.2. Эффекты гидрокортизона на степень фрагментации ДНК через 6 часов после инъекции 70
3.3.3. Уровни мРНК и белка Bcl-XL, Вах и каспазы-3 в головном мозге 8-дневных животных после однократной инъекции дексаметазона на 3 день жизни и последующего эпизода острой гипоксии 73
3.4. Разработка автоматического метода количественной оценки уровня двигательной активности неонатальных животных 81
3.5. Эффекты глюкокортикоидов и кратковременного эпизода гипоксии на уровень двигательной активности неонатальных животных 89
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 91
выводы 107
список литературы 108
- Апоптоз — один из ключевых процессов формирования организма. Его значимость и молекулярные основы
- Глюкокортикоиды: их роль в развитии ЦНС и регуляции программируемой гибели клеток
- Уровень фрагментации ДНК и экспрессия генов апоптоза Bcl-XL, Вах и каспазы-3 в коре, стволе мозга, гиппокампе и мозжечке неонатальных крыс
- Уровни мРНК и белка Bcl-XL, Вах и каспазы-3 в головном мозге 8-дневных животных после однократной инъекции дексаметазона на 3 день жизни и последующего эпизода острой гипоксии
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Программируемая гибель клеток путем апоптоза — базовый биологический процесс, необходимый для ликвидации избыточных, необратимо поврежденных и переродившихся клеток в многоклеточном организме (Hengartner, 2000). Апоптоз играет ключевую роль в ходе нормального формирования нервной системы млекопитающих и развитии ряда патологических состояний головного мозга (Oppenheim, 1991; Yuan, Yankner, 2000). Основными внутриклеточными регуляторами апоптоза в развивающемся головном мозге млекопитающих являются антиапоптозный белок Bcl-XL и проапоптозный белок Вах (Roth, D Sa, 2001; Akhtar et al., 2004). Изменение уровней этих белков и их соотношения друг к другу может отражать степень готовности клеток мозга к запуску программы апоптоза. Центральным эффектором в реализации молекулярных механизмов программы апоптоза в ЦНС является каспаза-3 (Yuan, Yankner, 2000). Высокая значимость этих генов для формирования головного мозга была подтверждена многими экспериментами (Roth, D Sa, 2001), в то же время вопросы фармакологической регуляции их экспрессии в ходе развития ЦНС, несмотря на свою высокую актуальность, остаются малоизученными.
Основные события нейрогенеза и элиминации избыточных клеток в ЦНС у млекопитающих происходят в перинатальном периоде (Oppenheim, 1991; Meier et al., 2000). В эти критические для онтогенеза сроки мозг наиболее чувствителен к действию различных стрессорных факторов. Ключевую роль в реализации стрессорного ответа организма играют глюкокортикоидные гормоны (Sapolsky et al., 2000). Индуцируемое стрессом повышение уровня этих гормонов в крови в раннем онтогенезе может необратимо влиять на морфологию головного мозга, а также приводить к последующим долговременным изменениям поведения и психической сферы (Naumenko, Dygalo, 1980; Edwards, Burnham, 2001). В то же время глюкокортикоиды способны оказывать и противоположное, нейропротективное действие при гипоксии неонатального мозга (Tuor, 1997).
Механизмы действия глюкокортикоидов на развивающуюся ЦНС до сих пор неизвестны, однако, один из таких механизмов может быть обусловлен влиянием данных гормонов на экспрессию генов ключевых белков программы апоптоза в ЦНС, определяющих предрасположенность клеток неонатального мозга к запуску собственного уничтожения, что может привести к его структурным изменениям. В свою очередь нарушение процессов формирования мозга, индуцированное глюкокортикоидами, способно отразиться и на его функции, проявляясь в виде поведенческих изменений, например, в локомоции. Поэтому выявление подобных изменений в ранние сроки после воздействия может оказаться полезным индикатором нарушения формирования головного мозга (Golan, Huleihel, 2006). Однако сведения о влиянии глюкокортикоидов на двигательную активность неонатальных животных в ранние сроки после перенесенного воздействия в литературе практически отсутствуют. Получение ответов на данные вопросы представляется важным, поскольку глюкокортикоиды и их синтетические аналоги используются в перинатальной медицине, и, кроме того, эти гормоны способны опосредовать действие разнообразных стрессоров на развивающийся организм.
Цель и задачи исследования.
Цель данной работы состояла в выяснении особенностей протекания апоптоза в отделах неонатального головного мозга, определения характера влияния повышенного уровня глюкокортикоидов на этот процесс, а также в оценке возникновения поведенческих проявлений гормональной модификации развития крыс в раннем постнатальном периоде. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучить уровни экспрессии ключевых генов апоптоза — Bcl-XL, Вах, каспазы-3 и классического признака программируемой клеточной гибели — фрагментации ДНК в структурах неонатального мозга крыс.
2. Исследовать действие повышенного уровня глюкокортикоидного гормона гидрокортизона и его аналога дексаметазона на экспрессию Bcl-XL, Вах, каспазы-3 и степень фрагментации ДНК в неонатальном мозге крыс.
3. Разработать метод регистрации двигательной активности неонатальных крысят, и посредством этого метода оценить возможные поведенческие эффекты гидрокортизона и дексаметазона на активность этих животных. Научная новизна.
В работе впервые установлено влияние глюкокортикоидов на экспрессию генов апоптоза в неонатальном головном мозге млекопитающих.
Выявлены ярко выраженные региональные особенности экспрессии генов апоптоза и интенсивности фрагментации ДНК в головном мозге неонатальных крыс, обусловленные асинхронным созреванием исследованных структур мозга. В мозжечке, гиппокампе и коре головного мозга уровень фрагментации ДНК линейно зависит от уровня активации каспазы-3 в этих структурах, при этом интенсивность процессов апоптоза в мозжечке в эти сроки минимальна, а в гиппокампе и коре мозга относительно высока. В отличие от этих структур ЦНС, в стволе мозга на фоне низкого уровня активной каспазы-3 выявлен самый высокий уровень фрагментации ДНК, что свидетельствует о существенном вкладе каспазо-3-независимых механизмов в физиологическую программируемую клеточную гибель в этом отделе неонатального мозга.
Установлено, что проявляющиеся через 6-часов после воздействия эффекты гидрокортизона зависят от интенсивности процессов апоптоза в отделах неонатального мозга. В гиппокампе и коре головного мозга, структурах с высоким уровнями активности каспазы-3 и интенсивности фрагментации ДНК, краткосрочные последствия воздействия гидрокортизона заключались в смещении экспрессии генов белков апоптоза в пользу антиапоптозных процессов: в этих отделах происходило увеличение уровня антиапоптозного белка Bcl-XL. В стволе неонатального мозга, где на фоне низкого уровня активной каспазы-3 наблюдается высокая степень фрагментации ДНК, 6-часовое действие гормона не приводило к существенной модификации уровней ключевых белков апоптоза, однако индуцировало увеличение степени фрагментации ДНК, не сопряженное с активацией каспазы-3. Наконец, в мозжечке, структуре с низкой интенсивностью процессов апоптоза, кратковременное воздействие гидрокортизона существенно не влияло на экспрессию генов апоптоза и фрагментацию ДНК.
Показано, что синтетический аналог глюкокортикоидов дексаметазон приводит к отсроченной стимуляции в коре головного мозга как антиапоптозных (увеличение уровня экспрессии Bcl-XL), так и проапоптозных механизмов (увеличение уровня активной каспазы-3). Кратковременный эпизод гипоксии через 4 часа после инъекции дексаметазона модифицирует экспрессию генов апоптоза спустя 5 суток после воздействия, изменяя ее в пользу антиапоптозных процессов: в коре мозга уменьшается уровень активации каспазы-3, а в гиппокампе и стволе мозга снижается уровень проапоптозного белка Вах.
Нарушения формирования мозга, выявленные по изменению экспрессии генов апоптоза при одновременном действии дексаметазона и гипоксии, сопровождались параллельным уменьшением двигательной активности неонатальных животных.
Теоретическая и практическая значимость.
Результаты работы расширяют теоретические представления о влиянии гормонов стресса — глюкокортикоидов и их аналогов на предрасположенность клеток развивающегося головного мозга к запуску программы самоуничтожения. Полученные данные могут иметь и определенное прикладное значение, поскольку препараты глюкокортикоидов находят достаточно широкое применение в перинатальной медицине.
Положения, выносимые на защиту.
В мозжечке, гиппокампе и коре мозга уровень фрагментации ДНК линейно зависит от уровня активной каспазы-3. В неонатальном стволе мозга при низком уровне активной каспазы-3 выявлен самый высокий уровень фрагментации ДНК, что свидетельствует о существовании в этом отделе каспазо-3-независимых путей физиологической гибели клеток.
Кратковременное воздействие гидрокортизона изменяет экспрессию генов апоптоза в гиппокампе и коре неонатального мозга в пользу антиапоптозных процессов, а в стволе мозга интенсифицирует программируемую гибель клеток. Однократное введение дексаметазона приводит к отсроченной стимуляции в коре мозга как антиапоптозных, так и проапоптозных механизмов.
Совместное воздействие дексаметазона и эпизода гипоксии приводит к последующему изменению экспрессии генов апоптоза в неонатальном мозге в пользу антиапоптозных процессов. Наряду с отсроченными изменениями в экспрессии генов апоптоза у неонатальных животных после совместного действия дексаметазона и гипоксии происходило параллельное снижение уровня двигательной активности. Апробация работы.
Материалы данной работы были доложены или представлены на XLII международной научной студенческой конференции (Новосибирск, 2004); Всероссийском съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004); VII всероссийской конференции «Нейроэндокринология -2005» (Санкт-Петербург, 2005); V Сибирском физиологическом съезде (Томск, 2005); международной школе-симпозиуме "International summer school in behavioural neurogenetics" (Москва, 2005); I съезде физиологов СНГ (Дагомыс, 2005); 35-м ежегодном собрании общества нейронаук США (Вашингтон, 2005); международной конференции "Фундаментальные науки — биотехнологии и медицине" (Новосибирск, 2006).
По теме диссертации опубликовано 14 работ, из них три статьи в отечественной и две — в зарубежной рецензируемой печати.
Апоптоз — один из ключевых процессов формирования организма. Его значимость и молекулярные основы
Гипоксия мозга — патологическое состояние, развившееся в результате недостаточного снабжения кислородом ткани головного мозга (Johnston et al., 2002). В перинатальной медицине нарушение доступа кислорода является главной причиной поражения развивающейся ЦНС и детской смертности; у большинства детей, переживших гипоксическое воздействие, впоследствии развивается ряд долгосрочных отклонений и заболеваний мозга, таких как параличи, эпилепсия и задержка умственного развития (Ekert et al., 1997; Berger, Gamier, 1999; Mishra, Delivoria-Papadopoulos, 1999; McLean, Ferriero, 2004; Bracci et al, 2006; Golan, Huleihel, 2006).
Для изучения перинатальной гипоксии и ее последствий был разработан ряд моделей, имитирующих поражение мозга у свиней, морских свинок, овец, крыс и мышей (Mishra, Delivoria-Papadopoulos, 1999; Northington et al., 2005; Golan, Huleihel, 2006). Среди экспериментальных способов индукции такого поражения ЦНС в раннем постнатальном периоде у крыс наибольшее распространение получили острая гипоксическая и острая гипоксическая-ишемическая модели (Golan, Huleihel, 2006). Изучение этих моделей показало, что перенесенный эпизод кратковременной гипоксии-ишемии приводил к последующему уменьшению объема и снижению веса как пораженного полушария в целом (Andine et al., 1990), так и отдельных структур: коры головного мозга, гиппокампа и стриатума на стороне поражения (Andine et al., 1990; Golan, Huleihel, 2006). Степень поражения ткани головного мозга после гипоксии зависит от продолжительности и интенсивности гипоксического эпизода (Golan, Huleihel, 2006). В гиппокампе и коре мозга даже умеренное по силе воздействие приводило к последующей потере 20 - 30% клеток (Grojean et al., 2003а; Grojean et al., 2003b). При большей продолжительности/интенсивности воздействия количество клеток в коре мозга, стриатуме и гиппокампе на стороне поражения оставалось сниженным по сравнению с контролем даже через 2-3 недели после перенесенного эпизода гипоксии (Almli et al., 2000; Robinson et al., 2005).
Анализ механизмов гипоксического поражения позволил выяснить, что первичное повреждающее действие гипоксии связано с истощением энергетических запасов клеток мозга, индукцией свободно-радикальных механизмов перекисного окисления клеточных мембран и глутамат-опосредованной активацией NMDA-рецепторов, сопровождающейся входом ионов кальция в клетки (Mishra, Delivoria-Papadopoulos, 1999; Mishra et al., 2001). Кроме того, гипоксия напрямую индуцирует активацию транскрипционного фактора HIF-1, который после своей активации взаимодействует с так называемыми гипоксия-реагирующими элементами (HRE) в промоторах ряда генов и таким образом регулирует их транскрипцию при снижении концентрации кислорода в клетке (Wenger, 2000; Zagorska, Dulak, 2004; Chang, Huang, 2006). Прямая реализация этих механизмов является причиной ранней некротической гибели ряда клеток в очаге поражения (Northington et al., 2001).
Однако более подробное изучение процессов клеточной гибели при гипоксии позволило установить, что ряд из вышеупомянутых механизмов (активация свободно-радикальных механизмов и повышение внутриклеточного уровня ионов кальция, активация транскрипционного фактора HIF-1) является триггером для запуска патологического апоптоза в развивающемся мозге (Hutchins, Barger, 1998; Polster, Fiskum, 2004; Chang, Huang, 2006). Выяснилось, что некроз ответственен лишь за первичные клеточные потери в очаге поражения, происходящие в течение первых 6 часов, тогда как вторичная волна гибели клеток, наблюдаемая позднее — это ПКГ путем апоптоза (Beilharz et al., 1995; Pulera et al., 1998; Nakajima et al., 2000; Johnston et al., 2001; Northington et al., 2001; Northington et al., 2005; Zhu et al., 2005).
В научных кругах до сих пор идет спор о вкладе процессов некроза и апоптоза в ходе реализации эффектов гипоксии (Northington et al., 2005). Важность ПКГ путем апоптоза в патогенезе гипоксического поражения неонатального мозга была подтверждена рядом гистологических и биохимических исследований: гибнущие клетки обладали характерными для апоптоза морфологическими признаками (Beilharz et al., 1995; Nakajima et al., 2000; Northington et al., 2001), кроме того в зоне поражения наблюдалось изменение экспрессии ряда генов апоптоза (Ferrer et al., 1997; Nakajima et al., 2000; Rothstein, Levison, 2005), увеличение уровня активации каспаз (Feng et al., 2003b; Feng et al., 2003a) и фрагментации ДНК (Beilharz et al., 1995; Pulera et al., 1998). Еще одним подтверждением важности ПКГ путем апоптоза при гипоксическом поражении мозга является нейропротективный эффект, оказываемый препаратами, ингибирующими активность каспаз: применение этих ингибиторов сразу после эпизода гипоксии-ишемии приводило к достоверному уменьшению потери массы ткани в зоне поражения (Han et al., 2002; Feng et al., 2003b; Feng et al., 2003a).
Глюкокортикоиды: их роль в развитии ЦНС и регуляции программируемой гибели клеток
Развивающаяся ЦНС периодически подвержена на протяжении всего перинатального периода воздействию повышенного уровня глюкокортикоидов различного происхождения.
Когда мать испытывает хронический стресс любой этиологии, головной мозг неродившегося ребенка подвергается воздействию высоких, хронических концентраций глюкокортикоидов эндогенного происхождения, вырабатываемых корой материнских надпочечников. В постнатальном периоде стрессорные факторы в жизни самого ребенка могут провоцировать повышенную эндогенную секрецию этих гормонов (Matthews, 2000; Edwards, Burnham, 2001). Хронический материнский стресс у крыс, мышей и приматов в антенатальном периоде замедляет рост и развитие плода. Пренатальный стресс у макак-резусов снижает вес плода при рождении (Edwards, Burnham, 2001). У крыс антенатальное воздействие эндогенных глюкокортикоидов приводит к потере части нейронов паравентрикулярного ядра путем апоптоза. Пренатальный стресс влияет и на развитие систем нейротрансмиттеров, включая серотонин-, холин- и катехоламинэргическую (Edwards, Burnham, 2001; Welberg, Seckl, 2001). Пренатальное стрессорное воздействие вызывает поведенческие нарушения у крысят после рождения: нарушения сна, усиление страха, дефицит внимания, познавательного поведения и уменьшение количества общественных контактов, искажение полового поведения (Edwards, Burnham, 2001; Welberg, Seckl, 2001). Подобное воздействие приводит к повышению уровней АКТГ и кортизола у новорожденных макак-резусов. Повышенный уровень глюкокортикоидов в третьем триместре вызывает у крысят необратимое 70% и 30% снижение MR и GR в гиппокампе соответственно (Edwards, Burnham, 2001).
Глюкокортикоиды экзогенного происхождения также могут влиять на развитие ЦНС в перинатальном периоде. Антенатально они назначаются с целью ускорения созревания респираторной системы для профилактики респираторного дистресс-синдрома новорожденных и некоторых других заболеваний. В постнатальном периоде использование глюкокортикоидов связано с различными заболеваниями новорожденных (аутоиммунные гемолитические анемии, травмы ЦНС, респираторный дистресс-синдром новорожденных, миоклонические приступы и др.) (Matthews, 2000; Edwards, Burnham, 2001).
Пренатальное ежедневное введение дексаметазона и бетаметазона макакам-резусам, крысам и овцам в третьем триместре приводит к существенному снижению массы мозга, легких, печени, поджелудочной железы, сердца и надпочечников плода (Whitelaw, Thoresen, 2000; Edwards, Burnham, 2001). Введение самкам мышей на 13 - 18 день беременности преднизолона вызывает задержку созревания мышат (Edwards, Burnham, 2001). Назначение однократной фармакологической дозы дексаметазона самкам макак-резусов в последнем триместре дает дозозависимую дегенерацию нейронов в гиппокампальных зонах СА1 - САЗ у новорожденных. Введение этой же общей дозы в течение нескольких дней вызывает более тяжелые поражения нейронов этих зон; в последующем (через 20 месяцев) наблюдается 30% снижение количества нейронов в гиппокампе по сравнению с контрольными животными (Matthews, 2000; Edwards, Burnham, 2001; Welberg, Seckl, 2001). Введение глюкокортикоидов крысам антенатально на 17 - 19 день беременности вызывает раннее созревание дофаминергической системы переднего мозга крысят (Edwards, Burnham, 2001). Введение гидрокортизона крысам в течение последней недели беременности изменяет обмен норадреналина в структурах мозга взрослых животных (Naumenko, Dygalo, 1980), тогда как введение в эти же сроки дексаметазона приводит впоследствии у крысят к изменениям метаболизма серотонина в коре, гиппокампе, гипоталамусе и среднем мозге, норадреналина в мозжечке, коре и гиппокампе (Matthews, 2000; Edwards, Burnham, 2001).
Постнатальное применение глюкокортикоидных гормонов у животных с антенатальным ростом мозга (приматы) вызывает небольшие изменения, но у видов с постнатальным окончанием развития ЦНС (грызуны) использование этих гормонов дает более значимый эффект. Однократное введение дексаметазона на 7 день жизни вызывает снижение массы всего мозга и его отдельных частей (фронтальной коры, мозжечка, ствола мозга) на 28 день по сравнению с контролем; кроме того, оно ускоряет общее созревания крысенка и необратимо снижает миелинизацию волокон в ЦНС (Benesova, Pavlik, 1989; Edwards, Burnham, 2001; Welberg, Seckl, 2001). Серьезным осложнением воздействия глюкокортикоидных гормонов на ЦНС является искажение нейрональной миграции и вероятность развития кортикальной дисплазии (Edwards, Burnham, 2001). Неонатальный курс введения глюкокортикоидов также приводит к снижению нейрогенеза в коре мозга и гиппокампе (Kanagawa et ah, 2006), кроме того в последней структуре под действием этих гормонов происходит атрофия дендритов нейронов различных областей гиппокампа (Edwards, Burnham, 2001).
Неонатальное введение синтетических аналогов кортикостерона вызывает у крысят необратимые изменения ряда поведенческих реакций (Matthews, 2000; Edwards, Burnham, 2001; Welberg, Seckl, 2001). Так, однократное введение дексаметазона на 7 день жизни приводило к ранним транзиторным нарушениям сенсомоторной сферы поведения (Ferguson et al., 2001). Впоследствии у таких животных наблюдались гиперактивность, высокая эмоциональная реактивность и сниженная способность к адаптации; в то же время у них наблюдались проблемы с моторной координацией в пространстве (Benesova, Pavlik, 1989; Ferguson, Holson, 1999). При более продолжительном курсе терапии дексаметазоном в неонатальном периоде у животных в дальнейшем наблюдались нарушения социального поведения и нарушения при пространственном обучении (Edwards, Burnham, 2001; Kamphuis et al., 2004). Вместе с тем, изменяется ли поведение животных непосредственно в период применения гормона, остается неясным.
Все вышеперечисленные факты свидетельствуют о неблагоприятных, а зачастую и вредных эффектах стресса и глюкокортикоидов на нормальное развитие организма в целом и ЦНС в частности. В то же время, на фоне неонатальной гипоксии мозга глюкокортикоиды, по-видимому, способны оказывать и совершенно противоположное — нейропротективное действие.
Уровень фрагментации ДНК и экспрессия генов апоптоза Bcl-XL, Вах и каспазы-3 в коре, стволе мозга, гиппокампе и мозжечке неонатальных крыс
Всю статистическую обработку полученных данных производили с использованием программы Statistica 6.0 (Statsoft Inc., США).
Межструктурные различия в уровнях экспрессии генов апоптоза и индексе фрагментации ДНК на 6 и 8 дни жизни животных оценивали однофакторным либо двухфакторным дисперсионным анализом (для однофакторного анализа фактор: структура мозга; для двухфакторного анализа факторы: день жизни и структура с мозга), достоверность различий между группами устанавливали согласно критерию множественных сравнений Шеффе. Зависимость между уровнем активной каспазы-3 и индексом фрагментации ДНК в структурах мозга 8-дневных животных анализировали посредством регрессионного анализа (линейная модель регрессии).
Влияние гидрокортизона, дексаметазона и гипоксии на массу тела, массу мозга и надпочечников оценивали одно- либо двухфакторным дисперсионным анализом (для острого введения гидрокортизона фактор анализа: введение препарата; для остальных экспериментов факторы анализа: введение препарата и воздействие гипоксии), достоверность различий между группами устанавливали согласно критерию множественных сравнений Шеффе.
Влияние гидрокортизона, дексаметазона и гипоксии на уровни мРНК и белка Bcl-XL, Вах и каспазы-3 в структурах мозга и на уровень двигательной активности животных на 8 день жизни оценивали одно- либо двухфакторным дисперсионным анализом (для острого введения гидрокортизона фактор анализа: введение препарата; для остальных экспериментов факторы анализа: введение препарата и воздействие гипоксии), достоверность различий между группами устанавливали согласно критерию множественных сравнений Фишера.
Физиологическая гибель клеток путем апоптоза необходима для адекватного развития головного мозга (Oppenheim, 1991; Yuan, Yankner, 2000). Так как формирование структур головного мозга у млекопитающих идет асинхронно (Будко et al., 1985), интенсивность процессов апоптоза в различных отделах может сильно варьировать в каждый конкретный промежуток времени. Поскольку эти различия в исходной активности молекулярных механизмов программы самоуничтожения способны оказать существенное влияние на первоначальную степень предрасположенности нервных клеток к запуску апоптоза, в работе были исследованы уровни ключевых участников апоптоза ЦНС — Bcl-XL, Вах и каспазы-3 и уровни фрагментации ДНК в гиппокампе, мозжечке, коре и стволе головного мозга 8-дневных крыс.
Анализ степени фрагментации ДІЖ выявил достоверные межрегиональные различия по этому показателю на 8 день жизни животных (Рис. 4; F o = 19.11, р 0.0001). Наиболее высокий индекс фрагментации ДНК был обнаружен в стволе мозга 8-дневных крысят, а наиболее низкий - в мозжечке, при этом между данными структурами показатель различался в 6 раз. В гиппокампе и коре мозга на 8 день жизни индекс фрагментации ДНК был в 4 - 5 раз выше этого показателя в мозжечке, и на 20 - 40% ниже, чем в стволе мозга.
В коре головного мозга 8-дневных животных уровни мРНК (Рис. 5А, В; F(3,20) = 8.25, р 0.001) и белка (Рис. 5Б, Г; F(3,i7) = Ю.34, р 0.0005) проапоптозного гена Вах были достоверно выше по сравнению со стволом мозга, гиппокампом и мозжечком. В этих структурах экспрессия данного гена была приблизительно на одном уровне. Уровень мРНК Bcl-XL достоверно не различался между исслуемыми структурами (Рис. 6А; F(3,i4) - 0.95, р 0.44). В то же время, уровень этого антиапоптозного белка в стволе мозга был достоверно ниже по сравнению с корой и гиппокампом (Рис. 6Б; F(3,2i) = 3.22, р 0.043).
Уровни мРНК и белка Bcl-XL, Вах и каспазы-3 в головном мозге 8-дневных животных после однократной инъекции дексаметазона на 3 день жизни и последующего эпизода острой гипоксии
Кора головного мозга. Однократное введение дексаметазона на 3 день жизни привело к увеличению уровня мРНК антиапоптозного белка Bcl-XL и соотношения мРНК Bcl-XL/Bax в коре головного мозга 8-дневных животных (Рис. 15А и Табл. 6; F(U5) = 5.80, р 0.030 и F(j,i4) = 13.44, р 0.0026 соответственно). Выявленные изменения в уровне мРНК Bcl-XL, индуцированные однократной инъекцией дексаметазона 3-дневным животным, привели к увеличению уровня этого антиапоптозного белка и соотношения белков Bcl-XL и Вах (Рис. 15Б и Табл. 7; F(i,22) = 9-28, р 0.0059 для уровня белка Bcl-XL, F(1 21) = 12.24, р 0.0022 для соотношения Bcl-XL/Bax). Однако, несмотря на эти изменения уровней регуляторных белков в пользу антиапоптозных процессов, введение дексаметазона на 3 день жизни индуцировало полуторакратное увеличение в коре головного мозга 8-дневных животных также и уровня активной каспазы-3 (Рис. 16 и Табл.7; F )= 24.48, р 0.0001), что является прямым свидетельством стимуляции этим синтетическим аналогом глюкокортикоидов процессов апоптоза в данной структуре мозга.
Вместе с тем, кратковременная экспозиция крысят в атмосфере 100% азота на 3 день жизни через 4 часа после инъекции дексаметазона приводила к совершенно противоположному результату: в коре головного мозга 8-дневных животных после такой комбинации воздействий происходило не повышение, а снижение уровня активной каспазы-3 (Рис. 16 и Табл. 7; F(i 22)= 24.48, р 0.0001).
Однократное введение дексаметазона 3-дневным животным не влияло на уровни мРНК и белка Вах, мРНК каспазы-3, а также самой интактной каспазы-3 в коре мозга на 8 день жизни крысят (Табл. 6 и 7). Кратковременная экспозиция в атмосфере 100% азота, производимая на 3 день жизни, также не приводила к статистически значимым изменениям уровней транскриптов и белков исследуемых генов апоптоза в коре мозга 8-дневных животных (Табл. 6 и 7).
Гиппокамп. Однократное введение дексаметазона на 3 день жизни без последующей гапоксии не приводило к существенным изменениям в уровнях экспрессии генов апоптоза в гаппокампе 8-дневных животных (Табл. 6 и 7). В то же время аналогичное введение, за которым следовал кратковременный эпизод гипоксии, вызывало снижение уровня проапоптозного белка Вах и параллельное увеличение соотношения белков Bcl-XL и Вах в гаппокампе на 8 день жизни по сравнению с контрольными группами (Рис. 17 и Табл. 7; F();2o) = 5.71, р 0.027 и F(U7)= 5.29, р 0.035 соответственно). Уровни мРНК Вах, а также транскриптов и белков других исследуемых в работе генов апоптоза в гаппокампе 8-дневных животных после введения на 3 день жизни дексаметазона и последующего эпизода гипоксии достоверно не отличались от этих показателей у контрольных животных (Табл. 6 и 7). Кратковременная экспозиция в атмосфере 100% азота, производимая на 3 день жизни, также не приводила к статистически значимым изменениям экспрессии исследуемых генов апоптоза в гаппокампе 8-дневных животных (Табл. 6 и 7).
Ствол головного мозга. Однократное введение дексаметазона на 3 день жизни без последующей гапоксии не приводило к существенным изменениям в уровнях экспрессии генов апоптоза в стволе головного мозга 8-дневных животных (Табл. 6 и 7). Вместе с тем, введение этого синтетического аналога глюкокортикоидов за 4 часа до экспозиции 3-дневных животных в атмосфере 100% азота индуцировало на 8 день жизни животных снижение уровня проапоптозного белка Вах (Рис. 18 и Табл. 7; F(i, 20)= 4.79, р 0.041) и увеличение соотношения антиапоптозного белка Bcl-XL к Вах (Рис. 18 и Табл. 7; F(); i8) = 5.45, р 0.032) в стволовой части их головного мозга. Уровни мРНК и белков других целевых генов в стволе головного мозга 8-дневных животных после введения дексаметазона и последующей гипоксии существенно не изменялись (Табл. 6 и 7). Кратковременная экспозиция в атмосфере 100% азота, производимая на 3 день жизни, также не приводила к статистически значимым изменениям уровней транскриптов и белков исследуемых генов апоптоза в этой структуре мозга у 8-дневных крысят (Табл. 6 и 7).
Влияние однократного введения дексаметазона на 3 день жизни и последующего эпизода острой гипоксии на уровень экспрессии Вах и соотношение Bcl-XL/ Вах в стволе головного мозга 8-дневных животных. (А) Иммуноблот с полосами Вах и актина. Дорожки: О - животные, не подвергшиеся гипоксии, N - животные, подвергшиеся эпизоду гипоксии. (Б) Уровни белка Вах, определенные относительно уровня актина, и соотношение белков Bcl-XL / Вах. Все данные представлены в процентах к группе, получавшей физиологический раствор, значения которой приняты за 100%. — р 0.05 по сравнению со всеми остальными группами. П Физиол. р-р Физиол. р-р + Гипоксия Дексаметазон Дексаметазон + Гипоксия
Мозжечок Однократное введение дексаметазона на 3 день жизни и последующий эпизод 10-минутной гипоксии сопровождались увеличением уровня мРНК антиапоптозного белка Bcl-XL и соотношения уровней мРНК Bcl-XL к Вах в мозжечке 8-дневных животных (Табл. 6; F(J; j8) = 6,81, р 0,018 и F(i5i8) = 5,92, р 0.026 соответственно), однако эти изменения не сопровождались существенной модификацией уровня самого белка Bcl-XL, а также уровней мРНК и белков для других генов апоптоза (Табл. 6 и 7).
Разработка автоматического метода количественной оценки уровня двигательной активности неонатальных животных.
Изменение формирования мозга, индуцированное действием глюкокортикоидов, может отразиться и на его функции, проявляясь в виде поведенческих аномалий. Одним из поведенческих показателей, оценка которого может дать сведения о физическом и психоэмоциональном состоянии животных, подвергшихся экспериментальным воздействиям, является уровень двигательной активности. Однако регистрация локомоции у неонатальных животных стандартными автоматическими методами видеодетекции затруднена в связи с невысокой интенсивностью двигательной активности животных, особенностями перемещения грызунов в неонатальном периоде (вплоть до 10 дня жизни крысята могут только ползать), а также низким уровнем селективности детекции данных методов (Wu et al., 2000; Noldus et al., 2001).
Для преодоления этих затруднений в работе предложен метод автоматической детекции входов животного в квадраты тестовой арены. Регистрация числа входов животного в квадраты тестовой арены производилась с использованием условий входа в квадрат и выхода из него (в квадрате должно находиться 5% и 3% от общей площади животного соответственно для выполнения этих условий). На рисунке 19 представлена схема принципа подсчета количества входов животного в квадраты арены. Каждый раунд детекции программой производится подсчет находящегося в каждом квадрате процента от общей площади проекции животного. Когда крысенок передвигает свою лапу из квадрата D3 в квадрат D4, как отмечено изогнутой стрелкой, процент находящейся в квадрате D4 площади животного увеличивается на следующем раунде детекции с 1 до 6%.
