Введение к работе
Актуальность проблемы: В животном мире запах особи имеет очень важное значение. Ему отведена роль индивидуального маркtра, по которому мать может разыскать своих детёнышей, самка выбрать подходящего полового партнёра, а самец сообщить о своём территориальном и иерархическом статусе. Кроме того, запах стрессированного или инфицированного животного влияет на поведение других особей (Novotny et al., 1985; Yamazaki et al., 2002; Kavaliers et al., 2005), их иммуно-физиологические функции (Суринов и др., 2005) и даже на хромосомный аппарат реципиента хемосигналов (Даев, Дукельская, 2005). Причем влияние паразитов на запах хозяина в значительной степени определяется активацией иммунной защиты и зависит от функциональной реактивности иммунной системы (Moshkin et al., 2001; Moshkin et al., 2002; Zala et al. 2008).
Всё это каким-то образом зашифровано в молекулах, формирующих индивидуальный запах, и расшифровка этого сигнального кода представляет не только фундаментальный, но и практический интерес, поскольку создает научную основу для развития методов неинвазивной диагностики людей, сельскохозяйственных и диких животных. Кроме того, композиции летучих органических соединений (ЛОС) рассматриваются в качестве перспективного средства управления поведением и физиологическим состоянием животных и человека (Rekwot et al., 2001; Tamagawa et al., 2008). Важно подчеркнуть, что у млекопитающих, в отличие от беспозвоночных животных, внутривидовая хемокоммуникация базируется не столько на отдельных химических соединениях – феромонах в классическом смысле (Karlson, Luscher, 1959), сколько на композициях органических молекул – так называемых signature mixture (Wyatt, 2009; Wyatt, 2010). Причем формирование и восприятие этих композиций имеет и врожденную и приобретенную составляющую (Суров и др., 2004). Все это вносит дополнительные трудности в расшифровку запаховых сигналов млекопитающих.
В настоящее время весьма интенсивно ведётся исследование летучих соединений, выделяемых мышами, которые относятся к наиболее распространенным объектам хемокоммуникационных исследований. У мышей наибольший интерес представляют мочевые метки самцов, богатые белками, благодаря которым летучие вещества удерживаются на месте гораздо дольше (Hurst et al., 1998; Arakawa et al., 2008). Кроме мочи и мочевых меток, индивидуальные маркёры могут содержаться в фекалиях, слюне и даже в крови животных (Lee and Ingersoll, 1979; Knapp et al., 2006). Но наиболее изученными являются запаховые компоненты мочи. К настоящему времени получен список основных летучих органических соединений, входящих в её состав и их приблизительные концентрации (Schwende et al., 1986; Willse et al., 2005; Novotny et al., 2007; Pysanenko et al., 2009). Однако этого знания недостаточно, для того чтобы использовать запахи для неинвазивной диагностики индивидуальных качеств особи и для управления поведением животных. Необходимо понять, какие именно ЛОС ответственны за ту или иную поведенческую реакцию животных, участвующих в восприятии запаха и как меняются сами стимулы при изменении физиологического состояния животного-донора.
В отличие от изучения роли запахов в формировании поведенческих и физиологических реакций, существенно меньше работ посвящено влиянию физиологии и образа жизни особи на её запаховый сигнал. Большей частью они связаны с изучением зависимости ЛОС от эндокринной функции гонад (Schwende et al., 1986; Andreolini et al., 1987; Jemiolo et al., 1987; Osada et al., 2008). Установленная Yamazaki et al. (1999) зависимость индивидуального запаха от генов главного комплекса гистосовместимости (major histocompatibility complex - МНС) стимулировали изучение различий в композиции ЛОС в зависимости от МНС генотипа. Однако сопоставление результатов разных авторов показало, что, хотя ЛОС и варьируют в соответствии с генотипом донора, характер этих вариаций не совпадает в работах разных авторов (Willse et al., 2005; Novotny et al., 2007; Rock et al., 2007; Kwak et al., 2010). Следует также упомянуть исследования, в которых выделены вещества, ассоциированные с такими физиологическими состояниями как половое созревание и стресс (Schaefer et al., 2010).
Значительная методологическая сложность в расшифровке хемосигналов млекопитающих заключается в стохастическом характере их формирования и восприятия (Wyatt, 2010). Комплексное исследование летучих компонент запаха всегда представляло собой сложную задачу ввиду огромного количества летучих соединений внутри одного образца и большого разнообразия их химических структур, для некоторых из которых необходимо подбирать особые методы и условия анализа. Большой вклад индивидуальных особенностей животного в его химические профили, также существенно усложняет задачу, приводя к необходимости исследования больших выборок образцов (Rochfort, 2005). Это существенно повышает временные и финансовые затраты на исследования. Для оптимизации этой работы нами предложен следующий 3-х ступенчатый алгоритм:
- анализ ЛОС, содержащихся в образце, на основе высокопроизводительной газовой хроматографии с низкой эффективностью разделения;
- биотестирование, т.е. выявление сигнальных образцов, в данном случае мочевых меток, различающихся по биологическим эффектам;
- идентификация ЛОС, выделенных при хроматографии, на основе хромато-масс-спектрометрии высокого разрешения.
Этот алгоритм был применен для изучения изменений хемосигналов, которые, как было показано ранее (Moshkin et al., 2001; Moshkin et al., 2002), наблюдаются при антигенной стимуляции иммунной системы животных, а также для поиска неинвазивных маркеров, отражающих физиологическое состояние и репродуктивные качества самцов мышей.
Цели работы и задачи исследования. Целью работы являлось изучение летучих компонентов в моче самцов мышей и их взаимозависимостей с активацией иммунной системы, а также репродуктивными способностями самца.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1) На основе высокопроизводительной газовой хроматографии исследовать изменчивость спектра летучих органических соединений в образцах мочи контрольных и иммунизированных самцов.
2) Сопоставить индивидуальные вариации летучих органических соединений с репродуктивной эффективностью самцов.
3) Сопоставить вариации летучих соединений в моче самцов с физиологическими характеристиками их иммунной и репродуктивной системы, а также с их эндокринными параметрами.
4) Провести хромато-масс-спектрометрическую идентификацию химической структуры некоторых биологически значимых летучих соединений.
Положения, выносимые на защиту:
-
Антигенная стимуляция иммунной системы влияет на обмен веществ, что проявляется в изменении спектра выводимых с мочой летучих соединений.
-
В моче самцов мышей содержатся летучие вещества, отражающие репродуктивные возможности животного.
-
Корреляции между показателями эндокринной функции гонад и компонентами запаха, имеющие место у самцов мышей до активации иммунной защиты, нарушаются при антигенной стимуляции.
Научная новизна: В рамках данного исследования были впервые изучены изменения композиции летучих органических соединений в составе запаховых сигналов самцов мышей при развитии иммунной реакции на введение чужеродного антигена. Установлены достоверные изменения нескольких компонентов запаха при антигенной стимуляции животных. На основе многомерной статистики (метод главных компонент) для всей совокупности химических компонентов показано, что сочетание 2-х компонент позволяет с высокой степенью статистической значимости дифференцировать контрольных и антигенстимулированных особей и особей с высокой или низкой иммунореактивностью. Таким образом, впервые экспериментально обосновано, что композиция летучих соединений, выделяемых с мочой, содержит информацию, достаточную для ольфакторного выбора полового партнера и для диагностики иммунного статуса животного.
В работе была установлена положительная связь между репродуктивным успехом самцов и амплитудой трёх хроматографических пиков, которые были идентифицированы как дигидрофураны (ДГФ), являющиеся производными гептанона – феромона самцов мышей, стимулирующих половое созревание самок. Нашими исследованиями впервые показана прямая корреляция между уровнем ДГФ и репродуктивными потенциями самцов. Кроме того, у контрольных самцов выявлены корреляции между ДГФ и эндокринной функцией гонад. Причем наблюдаемые в контроле взаимозависимости нарушаются при антигенной стимуляции самцов, вплоть до инверсии знака корреляции.
Теоретическая и практическая значимость: Установленные в работе хемокоммуникационные и репродуктивные эффекты антигенной стимуляции вносят вклад в изучение механизмов воспроизводства млекопитающих на фоне таких иммуногенных стимулов, как инфекции и аллергены. Изменения корреляций между хемосигнальными маркерами и морфофизиологическими характеристиками самцов, наблюдаемые при активации защитных механизмов, указывает на то, что паразитарная индукция иммунной системы может нарушать сложившийся в популяции генетически детерминированный подбор брачных партнеров.
Кроме того, мы апробировали разработанный для решения оборонных и геологических задач газовый хроматограф ЭХО-В, который может найти широкое применение в биологических и биомедицинских исследованиях, как портативный и высокопроизводительный инструмент. Наибольший интерес для биологии и медицины представляет обусловленная поликапиллярностью высокая чувствительность прибора. Полученные на основе ЭХО-В данные о диагностической значимости ДГФ могут найти применение при мониторинге репродуктивных качеств самцов мышей, чье разведение относится к самому динамично развивающемуся направлению животноводства.
Личный вклад соискателя состоит в непосредственном выполнении всех этапов пробоподготовки и хроматографирования мочи, включая отработку метода предварительного концентрирования летучих компонентов мочи, а также подбор оптимальных условий для хроматографического разделения образцов. Автором полностью выполнен статистической анализ первичных материалов, проведена интерпретация результатов, апробация материала и подготовка публикаций.
Апробация работы: Результаты работы были представлены на 2-ух международных конференциях: «International Symposium on Olfaction and Electronic noses» (Брешия, Италия, 2009), «Exhaled Breath Analysis: From Sensors to Devices and Applications» (Барга, Италия, 2010). И на одной российской научной конференции «Медицинская геномика и протеомика» (Новосибирск, ИХБФМ СО РАН, 2009).
Материалы диссертации докладывались на межлабораторном семинаре ИЦиГ СО РАН (Новосибирск, 2011).
Публикации: По материалам исследования опубликовано 5 работ, в том числе 2 в рецензируемых изданиях.
Структура работы: Диссертация изложена на 107 страницах и состоит из введения, четырёх глав текста, выводов, списка цитированной литературы (147 наименований, в том числе 138 на иностранных языках) и 3-ёх приложений. Текст иллюстрирован 17 таблицами и 17 рисунками.
