Введение к работе
Актуальность работы. Механизмы образования и перестройки синаптических контактов - актуальный вопрос современной синаптологии, ключ к пониманию пластичности нейронов. Классической моделью синаптогенеза являются процессы формирования и удаления нервно-мышечных синапсов, происходящие на скелетных мышечных волокнах млекопитающих в период реиннервации мышцы прорастающим к ней двигательным нервом после его повреждения (Bennett et al., 1973; Argentieri et al., 1992; Burden, 2002; Lomo, 2003). Известно, что подрастающие моторные аксоны образуют на волокне избыточное число контактов, из которых большинство вскоре «замолкают», то есть перестают секретировать медиатор, а вслед за этим отторгаются, элиминируются. В результате на волокне сохраняется один синапс, а иолисинаптическая иннервация сменяется на одиночную, ./ионосинаптическую. Механизмы и процессы, приводящие к подавлению избыточных синапсов и их последующей элиминации, остаются не ясными, несмотря на актуальность и длительную историю изучения вопроса (Hoh et al., 1975; O'Brien et al., 1978; O'Brien et al., 1984; Barber, Lichtman, 1999; Constanzo et al, 1999; Lanuza et al, 2002; Santafe et al., 2002; Nelson et al., 2003; Buffelli et al., 2004; Li et al., 2004).
В последние годы установлено, что в новообразованных моторных
9+
терминалях наряду с потенциал-зависимыми Са -каналами P/Q- и N-типа, запускающими секрецию медиатора, имеются потенциал-зависимые Са -каналы L-типа, принимающие особое участие в регуляции секреции медиатора (Atchison, 1989; Gray et al., 1992; Fu, Huang, 1994; Rosato-Siri, Uchitel, 1999). Показано, что
9+
именно вход кальция в терминали по L-типу Са -каналов (при генерации пресинаптического потенциала действия) приводит к подавлению секреции медиатора в новообразованных синапсах, их «замолканию» и, как следствие -последующей элиминации избыточных синапсов. Соответственно, блокаторы
9+
Са -каналов L-типа (D-600, нифедипин и др.), напротив, способствуют растормаживанию подавленных синапсов и усилению синаптической передачи в период новообразования нервно-мышечных синапсов (Rosato-Siri, Uchitel, 1999;
9+
Santafe et al., 2001; Piriz et al., 2003). Явление Са -зависимого торможения секреции ацетилхолина (АХ) в новообразованных синапсах выявлено как в период реиннервации зрелых скелетных мышц, так и на ранних стадиях онтогенеза и формирования двигательной иннервации скелетных мышечных волокон. Высказываются предположения, что это торможение имеет отношение к подавлению активности избыточных синапсов и ускорению созревания моторной иннервации в виде одиночной концевой пластинки (Santafe et al., 2002).
9+
Механизмы Са -зависимого торможения секреции АХ в моторных синапсах в период их новообразования на скелетных мышечных волокнах остаются не изученными и представляют большой интерес для нервно-мышечной физиологии и клинической неврологии.
Цели и задачи работы. Целью работы было изучить внутриклеточные механизмы, с помощью которых ионы кальция, поступающие в новообразованные
нервные терминали по L-типу Са -каналов, приводят к подавлению секреции медиатора и передачи сигналов в новообразованных моторных синапсах реиннервируемых скелетных мышц мыши. В работе были поставлены следующие конкретные задачи:
9+
Исследовать явление Са -зависимого торможения секреции АХ с помощью агонистов и антагонистов Са -каналов L-типа, его особенности на разных сроках созревания синапсов, при ритмической залповой и спонтанной активности новообразованных контактов.
Выявить вклад депонированного кальция, выбрасываемого через рианодиновые
9+
рецепторы (РиР) терминалей, в Са -зависимое торможение секреции АХ в новообразованных синапсах.
3. Исследовать участие Са -зависимых К -каналов большой и малой
9+
проводимости (ВК- и SK-типа) в реализации Са -зависимого торможения секреции АХ в новообразованных моторных терминалях
9+
4. Выявить участие ряда Са -зависимых белков и ферментов - кальмодулина,
9+
торможении секреции АХ
5. Исследовать возможны
зависимое торможение, осуществляемое с участием РКС.
кальмодулинкиназы II (СаМКП) и протеинкиназы С (РКС) в Са -зависимом
5. Исследовать возможный вклад потенциал-активируемых К у-каналов в Са -
Научная новизна полученных результатов.
В работе получен ряд новых ранее не известных фактов. Впервые показано,
9+
что Са -зависимое торможение секреции АХ в новообразованных нервно-мышечных синапсах мыши наблюдается не только при одиночной, но и при залповой вызванной активности синапсов, однако не затрагивает спонтанную секрецию медиатора. Впервые раскрыта роль кальция, входящего по L-типу Са -каналов, в активации РиР и выбросе депонированного кальция, который также участвует в механизме Са -зависимого торможения секреции медиатора. Выявлен ранее не известный факт, что подавление активности пресинаптической
9+
СаМКП может принимать участие в Са -зависимом торможении синаптической передачи в новообразованных моторных синапсах. Наконец, впервые показано, что механизм Са -зависимого торможения АХ включает Са -зависимую активацию РКС, направленную на усиление активности потенциал-зависимых К у-каналов терминалей в новообразованных моторных синапсах мыши.
Теоретическое и практическое значение работы
К числу фактов, имеющих общее теоретическое значение для физиологии синапсов, относится выявленный в работе внутриклеточный каскад реакций, приводящий к Са -зависимому торможению секреции медиатора в новообразованных моторных синапсах мыши. Показано, что входящий в терминали потенциал-активируемый Са -ток L-типа в комплексе с индуцированным им выбросом депонированного кальция, вызывают
9+ 9+
формирование Са -сигналов, реципрокно влияющих на активность Са -зависимых ферментов терминали. Происходит: а) подавление облегчающего действия СаМКП на секрецию АХ; б) активация РКС, направленная на усиление
работы потенциал-зависимых К у-каналов терминали и угнетение секреции АХ в исследуемых синапсах. Таким образом, показана способность двух пресинаптических Са -активируемых ферментов по-разному регулировать секрецию АХ, в зависимости от характера повышения уровня кальция в нервных терминалях. Эти данные приближают нас к пониманию Са -зависимых механизмов регуляции синаптической пластичности в химических синапсах.
Результаты работы могут оказаться полезными при решении прикладных задач синаптологии: при разработке способов коррекции посттравматических перестроек периферических нервно-мышечных синапсов, для ускорения восстановления иннервации мышц.
Основные положения работы, выдвигаемые на защиту
1. В новообразованных нервно-мышечных синапсах мыши Са -зависимое
торможение секреции АХ осуществляется с участием сочетанной активности
9+
Са -каналов L-типа и выброса депонированного кальция через РиР в составе моторных нервных терминал ей.
9+
2. Механизм Са -зависимого торможения секреции АХ предусматривает
подавление потенцирующего действия СаМКП на выброс медиатора и
синаптическую передачу в новообразованных синапсах мыши.
3. Вход кальция по L-типу Са -каналов приводит к активации Са -зависимой
РКС, мишенью которой являются потенциал-активируемые К v- каналы.
Усиление активности К у-каналов, опосредуемое РКС, является одним из
механизмов Са -зависимого торможения секреции в новообразованных синапсах
мыши.
Апробация диссертации
Результаты исследования были представлены на международной молодежной конференции Ломоносов-2007 (Москва, 2007), XX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007), I Всероссийском конгрессе студентов и аспирантов-биологов Симбиоз, Россия 2008 «Биология: традиции и инновации в 21 веке» (Казань, 2008), I Всероссийской (XVI) молодежной научной конференции «Молодежь и наука на Севере» (Сыктывкар, 2008), 6-ом Форуме Федерации Европейских Нейронаук (Женева, Швейцария, 2008), 38-ом ежегодном съезде Общества Нейронаук (Вашингтон, США, 2008), конференции с международным участием «Механизмы нервных и нейроэндокринных регуляций», посвященной памяти Т.М. Турпаева (Москва, 2009), международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009), ежегодном съезде Британского Физиологического Общества «Физиология 2009» (Дублин, Ирландия, 2009).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, в их числе 2 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК.
Структура и объем диссертации
