Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Молекулярные механизмы неспецифической резистентности как универсальньіе эффекторы доимунной защиты 16
1.1 Лизоцим как гуморальный фактор неспецифической резистентности местного иммунитета 18
1.2 Система комплемента как центральный фактор неспецифической резистентности сыворотки крови 23
1.3 Антимикробные пептиды и белки острой фазы как эффекторы воспалительного ответа 37
ГЛАВА 2. Основные клеточные факторы системы неспецифической резистентности 45
2.1 Нейтрофильные гранулоциты, их функциональная активность и морфологическая неоднородность 45
2.2 Макрофагальная система как узловой фактор неспецифической резистентности и адаптивного иммунитета 62
2.3 Естественные киллеры и их основные функции 67
ГЛАВА 3. Материалы и методы исследования 75
ГЛАВА 4. Особенности морфологии и колонизационной резистентности буккальньіх эпителиоцитов у разных доноров .97
ГЛАВА 5. Функциональная активность лизоцима слюны 107
5.1 Использование показателя литическои активности лизоцима слюны в качестве прогностического критерия тяжести кариозного процесса у детей 107
5.2 Морфологические аспекты состояния Micrococcus lysodecticus в системе с лизоцимом слюны 111
ГЛАВА 6. Активность альтернативного каскада комплемента в реакциях с бактериями 114
6.1 Особенности функциональной активности альтернативного каскада комплемента в реакциях с грамположительными бактериями рода Staphylococcus 115
6.2 Особенности функциональной активности альтернативного каскада комплемента в реакциях с грамотрицательными бактериями рода Proteus 117
7.1 Сравнительные исследования методов фиксации при работе с нейтрофильными гранулоцитами в атомно-силовой микроскопии 141
7.2 Неоднородность характера образования псевдоподий у нейтрофильных гранулоцитов в зависимости от объекта фагоцитоза 146
7.3 Особенности морфологии нейтрофильных гранулоцитов при исследованиях методом атомно-силовой микроскопии в различных буферных системах 151
ГЛАВА 8. Изучение ригидности мембран нейтрофильных гранулоцитов в атомно-силовой микроскопии 164
ГЛАВА 9. Морфо-физиологические особенности нейтрофильных гранулоцитов на фоне действия биотических и абиотических агентов 170
9.1 Морфо-физиологические особенности активности фагоцитов в системе «яд-гепарин» 171
9.1.1 Особенности функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов на фоне действия пчелиного яда 171
9.1.2 Протекторное действие гепарина в отношении респираторной активности нейтрофильных гранулоцитов 174
9.1.3 Особенности морфологии макрофагов при воздействии пчелиного яда и комплекса «яд-гепарин» 177
9.2 Динамические исследования жизнеспособности нейтрофильных гранулоцитов в системах с липополисахаридом 181
9.3 Динамические исследования жизнеспособности нейтрофильных гранулоцитов в системах с пероксидом водорода 193
9.4 Динамические исследования жизнеспособности нейтрофильных гранулоцитов в системах с квантовыми точками 204
Обсуждение результатов 226
Выводы 240
Литература 243
- Лизоцим как гуморальный фактор неспецифической резистентности местного иммунитета
- Нейтрофильные гранулоциты, их функциональная активность и морфологическая неоднородность
- Использование показателя литическои активности лизоцима слюны в качестве прогностического критерия тяжести кариозного процесса у детей
- Особенности функциональной активности альтернативного каскада комплемента в реакциях с грамотрицательными бактериями рода Proteus
Введение к работе
Актуальность исследования.
Неспецифическая резистентность является одним из центральных механизмов, поддерживающих физиологическую целостность организма (Ярилин, 1999). Это система «экстренного реагирования», подключающаяся к элиминации дестабилизирующих факторов до активации специфических компонентов защиты. Тем самым достигается выигрыш во времени, предоставляющий организму дополнительную возможность к настройке и реализации мощных адаптивных факторов. Этим, по-видимому, и обусловлена разноплановость и разнонаправленность реакций в системе неспецифической резистентности. Интерес к тонким молекулярным механизмам распознавания и взаимодействия между патогенами и системами защиты заставляет рассматривать эти механизмы на клеточном и гуморальном уровне. Традиционно принято делить совокупность реакций защиты на местный и системный иммунитет. В реализации защитных функций местного иммунитета полости рта большая роль принадлежит лизоциму слюны – фактору, способному к прямому бактериолизу грамположительных микроорганизмов (Дорофейчук, 1968). Общепризнанность этой роли приводит к поиску практического приложения тестов по определению активности фермента. Среди клеточных факторов местного иммунитета можно выделить транзиторные и стационарные. В качестве стационарного клеточного фактора местного иммунитета полости рта необходимо особо отметить буккальные эпителиоциты – клетки на арене которых реализуются комплексные взаимодействия между представителями нормо- и патофлоры и осуществляются процессы реализации всего спектра защитных механизмов в системе неспецифической резистентности (Маянский и др., 1987). С переходом на системный уровень число гомеостатических факторов значительно возрастает. Многие из них находятся в тесной кооперации и образуют целостные системы и сети, например, система альтернативного каскада комплемента, система лектинового пути комплемента, цитокиновая сеть. Последние годы ознаменовались всплеском интереса к функционированию системы альтернативного каскада комплемента, поскольку она способна не только регулировать реакции гуморально-клеточной кооперации, но и принимать непосредственное участие в поддержании гомеостатического баланса. Однако некоторые вопросы остаются практически не освещенными, в частности, в литературе мало сведений о степени активации системы альтернативного каскада в зависимости от вида и штамма микроорганизма.
Не меньшее значение принадлежит и факторам местного иммунитета, которые не только выполняют гомеостатическую и элиминационную роль, но и могут служить высокоинформативными индикаторами нарушений местного гомеостаза. Среди клеточных факторов системы неспецифической резистентности особую роль играют нейтрофильные гранулоциты (Маянский, 1989). Во-первых, эта фракция является превалирующей среди всех лейкоцитов крови, во-вторых, клетки находится в крови в преформированном состоянии, т.е. состоянии полной «боеготовности». В-третьих, нейтрофил является в определенном смысле убиквитарным для организма: он обнаруживается практически во всех тканях и органах в процессе острого воспаления. Экстренный и экстремальный характер деятельности нейтрофила нашел отражение и в особенностях клеточной морфологии.
Появившиеся в последние годы новые методы исследований позволяют не ограничиваться только визуализацией клеточных и тканевых объектов, или только регистрацией биохимических сдвигов в живых системах, но сочетают в себе морфологические и функциональные тесты (Dufrne Y.F., 2001). Появление новой методологии особенно важно в настоящее время, поскольку возрастающая абиогенная и биогенная нагрузка на организм человека делает чрезвычайно актуальной оценку границ резистентности и адаптационных возможностей различных систем органов, в особенности тех, центральной задачей которых является обеспечение гомеостатического баланса всего организма. Указанные положения и явились основанием для наших исследований.
Цель исследования: изучить функциональную и морфологическую многовариантность реактивности местных и системных факторов врожденного иммунитета в ответ на биогенные и абиогенные воздействия.
Задачи исследования:
1. выявить вариабельность реактивности местного клеточного иммунитета в системе «буккальные эпителиоциты – микрофлора» и рассмотреть преимущества разных микроскопических методов в определении параметров колонизационной резистентности;
2. исследовать различия в функционировании лизоцима как гуморального неспецифического фактора местного иммунитета у здоровых детей и детей, страдающих кариесом и оценить возможности определения активности лизоцима слюны для использования в качестве прогностического критерия тяжести кариозного процесса;
3. изучить степень активации системы альтернативного каскада комплемента в реакциях с разными штаммами грамположительных и грамотрицательных бактерий и рассмотреть возможные причины вариабельности АПАК-реактивности;
4. разработать методику витального исследования нейтрофилов методом сканирующей зондовой микроскопии, выявить морфо-функциональные особенности клеток в зависимости от используемого буфера, сравнить морфологические параметры клеток, при использовании разных методов фиксации и изучить ригидность мембран нативных нейтрофильных гранулоцитов и нейтрофилов, находящихся под воздействием биотических и абиотических факторов;
5. определить структурные и физиологические особенности работы фагоцитов в системе «яд-гепарин»;
6. исследовать морфо-физиологические особенности нейтрофильных гранулоцитов под воздействием различных физико-химических факторов и охарактеризовать разновариантность реактивности нейтрофилов.
Научная новизна работы.
Впервые продемонстрировано, что поверхность буккальных эпителиоцитов не однородна по механическим свойствам, и на ее поверхности могут выявляться «мягкие» участки.
Впервые выявлено, что межштаммовая вариабельность бактерий в системе альтернативного пути активации комплемента выражена в большей степени, чем межвидовая. Возможность функциональной активности в качестве только опсонического или опсонического и мембранолитического фактора показана для АПАК на разных штаммах Proteus.
Впервые в России разработана оригинальная методика витального наблюдения за клетками в режиме реального времени методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) без использования фиксации. Показано, что механическое воздействие зонда не оказывает повреждающего действия на живую клетку. Впервые в мире определена ригидность мембраны нейтрофильного гранулоцита.
Впервые продемонстрирована проапоптотическая активность липополисахарида в отношении нейтрофильных гранулоцитов при совместном механо-биохимическом воздействии и продемонстрировано поэтапное отделение «апоптозо-подобных» телец от клеток в режиме реального времени. При воздействии пероксида водорода зарегистрирован новый механизм клеточной гибели – «мумификация» нейтрофила, связанная с повышением механической прочности клетки. Токсичность квантовых точек (CdSe/ZnS-МУК) впервые продемонстрирована на нейтрофилах и показан феномен разделения нейтрофилов по функциональной активности на три субпопуляции. Впервые продемонстрировано, что фагоциты в функционально активном состоянии более чувствительны к токсическому действию яда.
Теоретическая и практическая значимость работы. В представленной работе суммируются данные о многовариантности и разнонаправленности проявлений неспецифической защиты, которые отражаются в своеобразии морфологии и неоднозначности физиологического поведения различных факторов на клеточном и гуморальном уровне. Формулируется концепция о том, что хотя в ответ на альтерацию под давлением естественного отбора в системе неспецифической резистентности эволюция отобрала наиболее быстрые, эффективные и наименее энергоемкие реакции, тем не менее, спектр реализации этих реакций может быть достаточно широким. Для реакций неспецифической резистентности узкое нацеливание является не приемлемым, поскольку элиминирующая функция первой линии защиты должна срабатывать и в случае атаки на организм ранее не известных альтерирующих факторов. В таких условиях только наличие выбора варианта и силы ответа на повреждение поможет удержать организм на грани гомеостатического баланса.
В представленной работе показана межштаммовая вариабельность для альтернативного пути активации комплемента, продемонстрированы различия морфо-функциональных характеристик нейтрофильных гранулоцитов в реакциях как с традиционными альтерирующими факторами (липополисахарид, пчелиный яд, пероксид водорода), так и с недавно появившимися продуктами нанотехнологии – квантовыми точками. В случае превышения компенсаторного порога происходит гибель клеток системы неспецифической резистентности. В зависимости от характера и дозы биогенных и абиогенных дестабилизаторов отмечена вариабельность клеточной гибели, в частности, нами зафиксированы три варианта гибели нейтрофильных гранулоцитов: некроз, апоптоз, «мумификация».
Методы атомно-силовой микроскопии и сканирующей лазерной микроскопии были адаптированы для биологических исследований. Применение новой методологии позволило решить ряд практических задач: создать модель для оценки упруго-механических свойств клеток и на ее основе определить значения ригидности нейтрофилов и буккальных эпителиоцитов, выявить токсическую активность квантовых точек (наноматериала, перспективного для биофотоники) и определить степень повреждения клеток при действии традиционного биологического токсиканта – пчелиного яда. Важными практическими приложениями работы являются выводы о протективной активности гепарина в отношении малых доз пчелиного яда и доказательство перспективности использования теста на активность лизоцима слюны в качестве прогностического критерия для оценки степени тяжести кариозного процесса у детей. Полученные теоретические знания дополнили курсы «Физиология человека», «Биомедицинские нанотехнологии», «Общая биотехнология», читаемые автором.
Положения, выносимые на защиту:
-
Использование режима микротвердости в методе сканирующей зондовой микроскопии выявляет наличие мягких областей на поверхности буккальных эпителиоцитов некоторых доноров. Но эти области не являются результатом контаминации микоплазмами и хламидиями.
-
Функциональная активность системы альтернативного каскада комплемента в реакциях с бактериями проявляется неодинаково. Межштаммовая вариабельность более выражена, чем межвидовая. Возможна реализация только опсонической или опсонической и литической функций альтернативного каскада комплемента в отношении бактерий рода Proteus.
-
Исследование активности лизоцима слюны выявило различие в активности фермента у здоровых детей и детей, страдающих кариесом.
-
Метод СЗМ позволяет исследовать изменения морфологии нейтрофильных гранулоцитов in vitro в режиме реального времени, а исследование фиксированных препаратов методом СЗМ не требует длительной предварительной подготовки образцов, но искажает морфологические параметры (объем и высоту) клеток.
-
В процессе фагоцитоза нейтрофильными гранулоцитами образование псевдоподий и активация респираторного взрыва являются дискретными, разобщенными во времени процессами.
-
Ригидность мембран нейтрофильных гранулоцитов составляет 2,1 ± 0,7 кПа при измерении методом СЗМ и расчете модуля Юнга.
-
Нейтрофильные гранулоциты реагируют однотипной реакцией набухания на значительное механическое давление, на изменения рН среды и на внесение некоторых биохимических агентов (липополисахарида). Наблюдается периодическое колебание параметров клетки (изменения высоты и объема) и механических свойств (ригидности клеточной мембраны). Гибель клеток под влиянием разных токсических агентов (липополисахарид, квантовые точки, пчелиный яд, экзогенный пероксид водорода в токсической концентрации) реализуется по разным механизмам, но всегда сопровождается резким падением респираторной активности нейтрофильных гранулоцитов.
-
Функциональные тесты (реакция люминолзависимой хемилюминесценции) в отношении исследования токсической активности пчелиного яда являются более чувствительными, чем морфологические. Угнетение респираторного взрыва происходит быстрее в том случае, если клетка активирована. И морфологические и функциональные тесты свидетельствуют о наличии у гепарина протективной активности в отношении малых доз пчелиного яда (1 – 10 мкг/мл).
Апробация работы. Основные положения работы были доложены и обсуждены: на 4 сессии молодых ученых (г. Дзержинск, 1999), на 5 сессии молодых ученых (г. Дзержинск, 2000), на 5 Международной конференции по фундаментальным наукам «Ломоносов-2000» (г. Москва, 2000), на II Всероссийском симпозиуме «Хроническое воспаление» (г. Новосибирск, 2000), на Международном «Workshop Scanning Probe Microscopy» (г. Нижний Новгород, 2001), на Международном «Workshop Scanning Probe Microscopy» (г. Нижний Новгород - Казань, 2004), на Международном EMBO/FEBS Workshop AFM applications in Biology (г. Оейраш, Португалия, 2004), на научной конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (г. Казань, 2004), на IV сессии научной молодежной школы-семинара «Промышленная безопасность и экология» (г. Саров, 2004), на международном форуме NSTI-Nanotech 2005 (г. Анахейм, США, 2005), на Международном FEBS-конгрессе «Molecules in Health and Diseases» (г. Стамбул, Турция, 2006), на международном симпозиуме «Topical problems of biophotonics» (г. Нижний Новгород – Москва, 2007), на II Международном съезде общества цитологов (г. Санкт-Петербург, 2007), на II Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (г. Казань, 2008), на 12-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (г. Пущино, 2008), на Международной конференции «Нанотехнологии в онкологии» (г. Москва, 2008), X Международном форуме «Высокие технологии XXI века» (г. Москва, 2009).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на ___ страницах и состоит из введения, 2 глав обзора литературы, материалов и методов исследования, 8 глав собственных исследований, выводов, библиографического указателя. Список цитируемой литературы содержит ___ источников, из которых ___ на русском и ___ на иностранных языках. Диссертация иллюстрирована 16 таблицами и 88 рисунками.
Лизоцим как гуморальный фактор неспецифической резистентности местного иммунитета
Основной ареной для факторов неспецифической резистентности являются барьеры, непосредственно граничащие с окружающей средой. Особенно важной представляется функция слизистых оболочек, которые должны решать две взаимоисключающие задачи: с одной стороны создать достаточно «прозрачный» барьер для того, чтобы обеспечить проникновение во внутреннюю среду необходимых организму молекул (например, нутриентов через слизистую желудочно-кишечного тракта, или дыхательных газов через слизистую дыхательных путей), а с другой стороны этот барьер должен быть непроницаем для различного рода патогенных или травмирующих агентов. Поэтому система местного иммунитета слизистых оболочек, сформировавшаяся в процессе длительного эволюционного развития, хотя и связана неразрывно с общим иммунитетом организма, вместе с тем функционирует относительно независимо от системного иммунитета (Ипатов и др., 1997). Это проявляется и в особенном наборе эффекторов местного иммунитета. Хотя и здесь встречаются факторы, функционирующие в системе общего иммунитета (например, Ig А, но даже структура типичного гликопротеина оказывается видоизмененной, исходя из специфики местного иммунитета) (Wines, Hogarth, 2006). Комплекс факторов неспецифической резистентности слизистых разных систем органов может отличаться. Например, особенностью местного иммунитета легких является наличие таких гуморальных факторов, как легочные белки-сурфактанты — SP-A (surfactant protein) и SP-D: в сочетании с липидами они снижают поверхностное натяжение эпителия, выстилающего легкие, сохраняя дыхательные пути свободнопроходимыми (Takahashi et al., 2006). Белки относятся к семейству коллектйнов: их лектиноподобные домены связываются с углеводными структурами на поверхности микробных клеток, а коллагеновый остов имеет сродство к рецепторам профессиональных фагоцитов, т.е. коллектины могут выступать в роли своеобразных опсонинов, облегчающих фагоцитоз на слизистых (Chaby et al., 2005).
Остановимся подробнее на реализации неспецифической резистентности в желудочно-кишечном тракте, поскольку именно его слизистые оболочки подвергаются наибольшей антигенной нагрузке. Большая роль в формировании неспецифических и некоторых специфических защитных факторов принадлежит ротовой жидкости, которая обладает выраженными защитными свойствами. Она содержит все необходимые для защиты компоненты (секреторный IgA, лизосомальные протеолитические ферменты), способные защитить ткани полости рта. Немаловажную роль играют эпителиоциты, ограничивающие инвазию оральных микроорганизмов и, тем самым, способность вызывать патологические изменения (Борисов, 2002). Основными факторами неспецифической резистентности полости рта являются муцин, лактоферрин, лизоцим, пероксидаза, гистамин, гистатины, факторы комплемента и нейтрофилы (Brown, Kloppel, 1990). Ротовая жидкость включает в себя две формы муцина: Mgl (mucins glycoprotein) и Mg2. Mgl обладает преимущественно обволакивающим свойством, Mg2 — вяжущим (Ligtenberg et al., 1992). Участие муцина и других гликопротеинов в бактериальной адгезии является комплексным: когда гликопротеины слюны адсорбируются на твердой поверхности, они могут связывать бактерии, повышая бактериальную агрегацию, а когда находятся в свободном состоянии — способны предотвращать бактериальную колонизацию посредством связывания с их адгезинами или посредством агглютинации бактерий в ротовой полости (Murray et al., 1992; Scannopieco, 1994). Лактоферрин представляет собой железосвязывающий белок. Основа его антибактериальной активности заключается в конкурентном связывании ионов железа, в результате чего при недостатке железа у бактерий (например, Streptococcus ти tans) подавляется метаболическая активность (Arnold et al., 1981; Arnold et al., 1981; Souka et al., 1993). Гистатины - группа из шести родственных видов богатых гистидином белков. Доказана присущая им противокандидозная активность (Oppenheim et al., 1988). Они могут также ингибировать коагрегацию между Porphyromonas gingivalis и Streptococcus mitis (Murikami et al., 1991), препятствуя развитию воспалительных процессов полости рта и зубов, а также ингибировать рост Streptococcus mutans (Payne et al., 1991).
Однако, несмотря на столь широкое представительство факторов неспецифической резистентности полости рта, основная роль по-прежнему отводится лизоциму. Он является одним из наиболее древних в филогенезе факторов противомикробной защиты (обнаруживается у всех форм живой материи от бактериофагов до человека). Помимо полости рта у человека он обнаруживается практически во всех секретах: слезах, околоплодных водах, материнском молоке и других биологических жидкостях, а также в тканях внутренних органов. В норме он отсутствует в моче и спинномозговой жидкости. Наибольшая концентрация лизоцима наблюдается в тех зонах, где организм тесно соприкасается с генетически чужеродными агентами и в местах, где в связи с большой физиологической нагрузкой наиболее интенсивно протекают процессы метаболизма, в том числе в местах активного клеточного деления и пролиферации тканей (Ипатов и др., 1997). Основным источником лизоцима в организме являются полиморфноядерные лейкоциты, моноциты и их зрелая форма — макрофаги (Баранов, Дорофейчук, 1999). Содержание лизоцима в организме меняется в зависимости от возраста, времени года, питания, витаминного баланса и других факторов (Бейер и др., 1984). Он является одним из наиболее распространенных ферментов пищеварительного тракта и обнаруживает устойчивость к действию протеолитических ферментов. Наибольшее его содержание отмечается в слюне, которая обволакивает поступающую пищу, предохраняя слизистую оболочку рта от антигенного раздражителя. Ежесуточно в ротовой полости человека выделяется большое количество лизоцима вместе со слюной (объем слюны достигает 2 литров). При этом количество его в слюне превышает содержание в сыворотке крови по некоторым данным в 50 раз (Рудык, Лобанова, 1980). Наиболее высоко содержание лизоцима в ротоглоточном секрете детей первого года жизни. Вообще пищевой тракт ребенка оказывается защищенным лизоцимом в самый критический период жизни: новорожденный получает лизоцим с молоком матери, где его концентрация в 3 000 раз превышает концентрацию в коровьем молоке (Ипатов и др., 1997). В возрасте 1 — 6 лет содержание фермента понижается почти в 3 раза, к 7 - 15 годам жизни количество лизоцима снова повышается, но не достигает уровня свойственного младенцам (Баранов, Дорофейчук, 1999). Антимикробная активность лизоцима и механизмы ее литического, бактерицидного и бактериостатического действия проявляются в следующем: природными субстратами для лизоцима являются длинноцепочечные мукополисахариды, служащие главными составными частями клеточной стенки бактерий. Лизоцим расщепляет (31-4 гликозидные связи в мукополисахаридах в составе оболочки чувствительных грамположительных микроорганизмов и, в отдельных случаях, может вызывать бактериолиз.
Нейтрофильные гранулоциты, их функциональная активность и морфологическая неоднородность
Основным эффектором острого воспаления и одним из ведущих факторов неспецифической резистентности является нейтрофильный гранулоцит. Он, как и другие форменные элементы крови, образуется из гемопоэтических стволовых клеток-предшественниц (Morley, 1966). Уникальность этих клеток подчеркивается многочисленными группами исследователей. Во-первых, нейтрофилы являются постмитотическими клетками (т.е. последний раз к синтезу ДНК и митозу клетка способна на стадии миелоцита при созревании в1 костном мозге, но, начиная со стадии метамиелоцита, митотические циклы не осуществляются) (Магу, 1985). Во-вторых, нейтрофил имеет достаточно интересную морфологию: сегментированное ядро и многочисленные гранулы (Olins et al., 2008). Однако эта особенность не является исключительной для нейтрофильных гранулоцитов: сходная морфология обнаружена для эозинофилов и базофилов крови, хотя клетки легко отличаются друг от друга благодаря применению классических методов цитогистохимии (Козинец и др., 1998). Кроме того, у нейтрофильного гранулоцита отмечается обычно наличие 3-4 сегментов ядра, тогда как для базофилов и эозинофилов характерны 2 сегмента (Campbell et al., 1995). В-третьих, все клетки организма характеризуются сбалансированным обменом с периодическими незначительными отклонениями гомеостаза и быстрыми возвратами к положению равновесия (исключения составляют только необратимые сдвиги за пределы физиологической нормы, ведущие к гибели клеток). Нейтрофил представляет собой клетку, превращенную эволюцией в хранилище разрушающих и токсичных веществ (исключение составляют только биооксиданты, образующиеся уже в зрелом активированном нейтрофиле) (Серов, Пауков, 1995). Поэтому все сдвиги метаболизма приводят к активации клетки и реализации богатого биоагрессивного потенциала, что неизбежно влечет за собой нарушения локального гомеостаза (в результате которого может произойти и гибель самого нейтрофила), но, в конечном итоге, направленного на поддержание общего гомеостаза организма. Четвертая особенность нейтрофилов также является общей для клеток, принимающих участие в миграции., рекогносцировке и кооперации для осуществления общих защитных функций: нейтрофилы являются зависимыми от рецептор-опосредованных реакций. При этом весь богатый эффекторный потенциал нейтрофила реализуется благодаря экспрессии и присутствию на плазмолемме определенных групп белков, их группировок, и их связи с соответствующими лигандами.
Нейтрофилы составляют 60-70% общей лейкоцитарной фракции крови (Козинец и др., 2004). Они проходят следующие фазы жизненного цикла: стадия митотического деления (миелобласт, промиелоцит, миелоцит) в костном мозге за 5 - 7 дней, , постмитотическая стадия созревания (метамиелоцит, палочкоядерный нейтрофил) за 5 дней, циркуляция зрелой клетки в крови (сегментоядерный нейтрофил) длится в среднем 7-10 часов, после выхода в ткани жизнеспособность нейтрофила не превышает двух дней (Магу, 1985). К наиболее ярким проявлениям реактивности нейтрофилов относятся: перестройка метаболизма, миграция, адгезия, поглощение, образование пищеварительных вакуолей, секреторная дегрануляция (Маянский, 1989). В реализации эффекторных функций нейтрофилов большое значение имеет кооперация как с клеточными, так и с гуморальными факторами неспецифической резистентности и адаптивного иммунитета (Quie, Mills, 1979; Sedgwick et al., 1983; Deitch et al., 1990). Например, созревание нейтрофилов в костном мозге находится под постоянным контролем Г-КСФ и ГМ-КСФ, диапедез осуществляется под влиянием хемоаттрактантов (СЗа, С5а), калликреина, тромбина и т. д. (Kajita et al., 1990). Рецепторы для разных классов хемокинов и хемоаттрактантов богато представлены на поверхности нейтрофильных гранулоцитов (Ahuja et al., 1996). Обнаружено, что воспалительное окружение стимулирует нейтрофилы к положительной регуляции рецепторов для хемокинов (Johston et al., 1999). Рецепция хемоаттрактантов и хемокинов плазматической мембраной индуцирует сложную многоэтапную реакцию, которая закрепляет пространственную ориентацию и активирует двигательный аппарат нейтрофилов (Маянский, 1989). В результате рекогносцировочных реакций клетка переходит в пристеночный (маргинальный) пул, где, связываясь с активированными эндотелиоцитами, благодаря наличию селектин-рецепторных взаимодействий, осуществляет перекатывание (роллинг) по поверхности эндотелия (в венулах перекатыванию подвергаются приблизительно 40% лейкоцитов) (Ley, Gaehtgens, 1991). На этой первой стадии взаимодействия нейтрофилов с эндотелием решающая роль принадлежит следующим воздействиям: (1) L-селектин (экспрессируется на микроворсинках не активированных ПМЯЛ) связывается с CD34 или Sgp 200, экспрессируемыми на поверхности эндотелиоцитов; (2) PSGL-1 (гликопротеиновый лиганд-1 для Р-селектина, локализованный на микроворсинках ПМЯЛ) взаимодействует с Р-селектином, который в виде конституциональных или индуцибелвных молекул присутствует на мембране клеток эндотелия и (3) ESL-1 (гликопротеиновый лиганд-1 для Е-селектина, локализованный вдоль поверхности микроворсинок ПМЯЛ) связывается с Е-селектином, присутствующим на поверхности стимулированного эндотелия (Белоцкий, Авталион, 2008). Роллинг, играющий большую роль в предактивации нейтрофилов, на L-селектине происходит со скоростью в 7 -11 раз большей, чем на Р- или Е-селектине (Puri et al., 1997). Нужно отметить, что и на этапе первичного контакта с эндотелием сосудов отмечается кооперация между различными звеньями неспецифической резистентности: в частности обнаружено, что Р-селектинзависимое взаимодействие может индуцироваться МАК комплемента (Kilgore et al., 1995). Со стороны эндотелия необходима экспрессия помимо других рецепторных комплексов белков ICAM-1, поскольку они способствуют оптимизации роллинга на L-и Р-селектинах, а в их отсутствии перекатывание происходит слишком быстро, препятствуя миграции ПМЯЛ в очаг воспаления (Steeber et al., 1999).
Следующая группа, задействованная в процессе, интегрины и рецепторы для интегринов. Они контролируют остановку роллинга клеток в местах повреждения сосудов. Один лейкоцит может нести на поверхности до 13 различных интегринов, в частности на ПМЯЛ могут быть экспрессированы CD49b/CD29, VLA-9, CDlla/CD18, CDllb/CD18, CDllc/CD18 (Белоцкий, Авталион, 2008). Т.е. большинство представителей семейства интегриновых белков являются рецепторами для компонентов комплемента. Цитоплазматические домены интегринов связываются с субмембранными белками клеточного матрикса - талином и а-актином (Hynes, 1999), поэтому внешний физический стресс передается цитоскелету через интегрины и обеспечивает восприятие клеткой механического сопротивления со стороны внеклеточного матрикса. Это, в свою очередь, вызывает реорганизацию цитоскелета, что регулирует сократимость, протрузию (выпячивание) мембраны и приводит к поляризации и миграции клетки (Белоцкий, Авталион, 2008). Нужно сказать, что физическое сопротивление эндотелиоцитов достаточно велико (за 50 микросекунд напряжение возрастает с 10 до 100 pN), но довольно быстро сменяется релаксацией (Edmondson et al., 2005). Такое чередование физических характеристик также способствует реализации конечного звена трансэндотелиальных реакций - дйапедеза. нейтрофилов.
Использование показателя литическои активности лизоцима слюны в качестве прогностического критерия тяжести кариозного процесса у детей
У троих доноров (из 15) на апикальной поверхности клеток выявлены более мягкие по сравнению с остальной поверхностью участки мембраны клетки. Представленные данные не являются артефактом, поскольку четко воспроизводились у этих трех доноров в ходе неоднократных исследований. У всех трех доноров обсемененность буккальных эпителиоцитов лежала в пределах 20 — 50 бактериальных клеток/эпителиоцит, что соответствует нормальному естественному состоянию полости рта. Размеры мягких участков у доноров существенно различались друг от друга и варьировали от 0,1 мкм до 1,5 мкм. Помимо различий в размерах интересной особенностью выделенных областей являлся тот факт, что они не имели соответствия каким-либо структурам на изображении буккального эпителиоцита, полученного в режиме топографии (рис. 9).
Первоначально было сделано предположение, что, поскольку разные материалы имеют разные константы адсорбции, неоднородная поверхность буккальных эпителиоцитов может иметь различия в образовании адсорбционного слоя, что и обуславливало различия в контактах между зондом и поверхностью клетки. Однако такое физико-химическое объяснение не могло быть удовлетворительным, поскольку проблемы взаимодействия зонда и образца отразились бы на всех каналах сканирования (одновременно прописывалась топография клетки, микротвердость и режим латеральных сил трения), тогда как мягкие области прописывались только в одном режиме - микротвердости.
Еще одно предположение, что адгезивность мембран над мягкими участками могла быть повышена, снималось нами спектроскопическими измерениями. Над мягкими областями и другими районами клетки было произведено по 15 замеров FS-кривой и рассчитан модуль Юнга. Для мягких участков он составил 27,3 ± 3,3 N/m, а для остальной поверхности 33,8 ± 3,1.
Таким образом, различия не были статистически значимо различимы, а значит, адгезивные свойства поверхности равномерны. Согласно исследованиям Борхсениус С.Н. и др. (2002), может наблюдаться контаминация клеток микоплазмами. Размеры микоплазм (около 0,3 мкм) попадают в диапазон выявленных нами «мягких» областей. Для того, чтобы определить возможность микоплазменной, хламидиальной или вирусной контаминации, проводилось окрашивание буккальных эпителиоцитов Hoechst 33258, позволяющим выявлять ДНК. Результаты окрашивания представлены нарис. 10.
У всех исследуемых доноров была выявлена экстрануклеарная ДНК на поверхности буккальных эпителиоцитов. Это объясняется тем, что Hoechst 33258 окрашивает любую ДНК, в том числе и ДНК микрофлоры, колонизирующей эпителиоциты. Поэтому для окончательного решения вопроса о контаминации микоплазмами или хламидиями клетки были обработаны специфическими антителами, меченными ФИТЦ к наиболее распространенным микоплазмам и хламидиям, колонизирующим буккальные эпителиоциты. Во всех исследуемых препаратах не наблюдалось специфического свечения, характерного для ФИТЦ, что доказывает отсутствие микоплазменной и хламидиальной контаминации (результаты не приводятся). Одному из доноров была проведена ПЦР-диагностика, которая также исключила наличие микоплазм и хламидий.
Представленное исследование показывает, что, несмотря на то, что в режиме топографии не удается целенаправленно исследовать колонизацию буккальных эпителиоцитов нормальной микрофлорой, но применение сканирующей зондовой микроскопии позволяет проводить исследование морфологии данного типа клеток. В методологическом смысле буккальный эпителиоцит является достаточно удобным объектом для сканирования, поскольку хотя и не адгезируется к поверхности подложки (эта проблема полностью снимается при фиксации препаратов), но крупные размеры клеток позволяют опустить зонд на интересующий участок и начать сканирование. Кроме того, плоская поверхность клетки снимает ограничения в сканировании по оси z. Использование уникального режима микротвердости в исследовании буккальных эпителиоцитов позволяет выявить мягкие области на поверхности клеток. Их образование не является результатом контаминации микоплазмами и/или хламидиями. В работе Домарадского И.В. и др. (2002) постулируется наличие феномена транслокации бактериальных клеток через клетки эпителия. При этом буккальные эпителиоциты, также как и другие эпителиальные клетки принуждаются к фагоцитозу, поскольку они не являются профессиональными фагоцитами, в отличие от нейтрофилов, макрофагов и других фагоцитирующих клеток. И.В. Домарадский и др. (2002) приводят данные о том, что для буккальных эпителиоцитов характерен незавершенный фагоцитоз, приводящий к повреждению клетки и облегчающий транслокацию бактерий. Вероятнее всего зоны такого повреждения и были выявлены нами в режиме получение распределения микротвердости, и их скорее следует считать не столько морфологическим, сколько функциональным феноменом.
Таким образом, на клеточном уровне местного иммунитета у доноров отмечается вариабельность морфологических свойств поверхности буккальных эпителиоцитов. Отличия выявлены и в реализации барьерной функции клеток: у некоторых доноров отмечено снижение вязко-упругих характеристик над локальными участками поверхности.
Особенности функциональной активности альтернативного каскада комплемента в реакциях с грамотрицательными бактериями рода Proteus
Параллельно проводилось исследование трех штаммов Proteus mirabilis и трех - Proteus vulgaris. Инкубацию штаммов в системе АПАК проводили в течение 60 мин. Результаты АПАК-реактивности двух видов протея показали, что усредненные значения этого показателя у P.vulgaris и P.mirabilis достоверно не отличались, составляя соответственно 51,7 ± 25,1% и 74,5 ± 4,3% (р 0,05), в то время как внутривидовая вариабельность выражена четко (таблица 4). То есть отмечалась та же тенденция, что и для стафилококков.
Одной из причин «ускользания» штамма P.vulgaris 1418-1 от альтернативного каскада комплемента могло быть конкурентное экранирование активирующих центров компонентами, препятствующими сборке и стабилизации СЗ-конвертазы. Поскольку существуют работы, прямо указывающие на антикомплементарную активность поверхностных белков и сиаловых кислот, была исследована возможность участия этих факторов в снижении АПАК-реактивности штамма P.vulgaris 1418-1 (Edwards et al., 1982; Taylor, 1995).
Для устранения экранирующего эффекта поверхностных белков проводили термическую (100 С, от 10 до 30 мин) обработку бактерий, однако прогревание не оказывало существенного влияния на способность P. vulgaris 1418-1 активировать комплемент: показатели соответственно составили 14,3% ± 0,5% - до обработки и 24,0% ± 6,0% - после нее (р 0,05). Это позволяет исключить участие -термолябильных белков в коррекции АПАК-реактивности штамма.
Изучение возможности блокирующего влияния сиаловых кислот на реактивность бактерий в системе АПАК проводили в опытах со штаммом Р. vulgaris 1418-1, обработанным нейраминидазой (Sigma, США). Показатели АПАК-реактивности до обработки нейраминидазой составили 14,3 ± 0,5%, после - увеличились до 32,0 ± 4,0% (р 0,05), т.е. показатели возрастали достоверно. Это означает, что сиаловые кислоты, как и в системе с грамположительными бактериями, действительно могут сглаживать АПАК-реактивность некоторых штаммов; но это не единственный фактор, ограничивающий активацию альтернативного каскада, т.к. не происходило увеличения активирующей АПАК способности штамма до средневидового уровня.
Если учесть, что наиболее действенным в плане активации альтернативного каскада является . липополисахарид грамотрицательных бактерий, то именно его структурные особенности могли привести к снижению АПАК-реактивности штамма. На устойчивость бактерий оказывает влияние длина полисахаридных боковых цепей О-антигена ЛПС, поскольку длинноцепочечные ЛПС препятствуют взаимодействию МАК с гидрофобными участками наружной мембраны, тем самым предупреждая цитолиз бактериальной клетки. Бактерии с ЛПС, слабо связывающим СЗ компонент комплемента, практически не фагоцитируются и являются наиболее вирулентными (Кудрина и др., 1997; Klink et. al., 1998).
Как следует из таблицы 4, пять штаммов протея обладали сходной АПАК-реактивностью, т.е. в течение 60 мин связывали одинаковое количество СЗ компонента комплемента. Представлялось интересным выяснение динамики АПАК-реактивности штаммов в зависимости от времени инкубации с сывороткой. Для исследования этого вопроса было взято четыре штамма протея, относящихся к видам P.mirabilis и P. vulgaris. Выбранные штаммы обладали идентичной реактивностью в системе альтернативного каскада при инкубации с сывороткой в течение 60 мин, однако динамика расходования компонентов альтернативного каскада комплемента во время часовой инкубации с хелатированной сывороткой (от 10 до 60 мин) у разных штаммов протея происходит не одинаково (рис. 16).
Из представленного рисунка следует, что P. mirabilis 120 практически с первых минут инкубации с сывороткой вызывал не только активацию АПАК, но и полное расходование СЗЬ компонента комплемента. Дальнейшее увеличение времени инкубации не влияло на АПАК-реактивность штамма.
Связывание СЗЬ компонента штаммами P. mirabilis 210, P. vulgaris 296, P. vulgaris 856 происходит не сразу. В течение 10-30 минут показатели АПАК-реактивности находятся на стадии плато и активация альтернативного каскада не превышает 50%, однако в. дальнейшем (при увеличении времени инкубации с 30 до 50 минут) происходит экспонициальное увеличение потребления компонентов альтернативного каскада и показатели АПАК-реактивности достигают максимума. Такое «двухэтапное» подключение АПАК могло быть обусловлено особенностями строения ЛПС штаммов протея. Можно предположить, что ряд активаторных структур (в том числе ЛПС) экранируется от связывания с ЄЗ, и этим объясняется наличие «плато» на первых 30 минутах инкубации.
Можно предположить и другую последовательность событий: АПАК вызывает сборку мембран-атакующего комплекса (МАК) на поверхности клетки-мишени и первая фаза расходования компонентов АПАК обусловлена формированием МАК. Под разрушающимся, в результате сборки МАК, липополисахаридом обнажаются новые АПАК - активирующие структуры (например, пептидогликан), который вызывает новую волну активации альтернативного каскада.
Есть свидетельства о том, что лишь небольшое число видов грамотрицательных бактерий могут лизироваться в результате сборки МАК. Поэтому возможность бактериолиза протея в системе альтернативного каскада комплемента оценивали по целому ряду реакций.
Вначале косвенную оценку проводили по стимуляции нейтрофильных гранулоцитов штаммами бактерий, обработанными в системе АПАК. Стимуляцию (или подавление) нейтрофилов оценивали по дыхательной активности клеток в реакции люминолзависимой хемилюминесценции. Использовали интактные бактерии (контроль) и бактерии, обработанные в режиме АПАК. В" качестве информативных показателей использовали определение пика хемилюминесценции (1хл) и общей светосуммы, как интегрального показателя, характеризующего активацию нейтрофилов бактериями (Бхл). Результаты представлены в таблице 5.
