Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Строение, функции и химический состав костной ткани в норме 9
1.1.1. Структурно-функциональные особенности костей 9
1.1.2. Клеточное строение 10
1.1.3. Внеклеточный матрикс костной ткани 14
1.1.3.1. Коллаген 14
1.1.3.2. Протеогликаны 15
1.1.3.3. Минеральные компоненты костной ткани 24
1.2. Скелетогенез и ремоделирование костной ткани 28
1.2.1. Развитие скелета в норме 28
1.2.2. Ремоделирование костной ткани 30
1.3. Патогенетические механизмы развития остеопороза 31
1.3.1. Факторы риска 31
1.3.2. Классификация остеопороза 34
1.3.3. Теории патогенеза остеопороза 36
Резюме 38
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования
2.1. Лабораторные животные 40
2.2. Экспериментальные модели 40
2.3. Методы исследования 43
2.3.1. Двухэнергетическая рентгеновская абсорбциометрия \ 43
2.3.2. Биохимические методы 45
2.3.2.1. Выделение протеогликанов костной ткани 45
2.3.2.2. Аналитические методы 46
2.3.2.2.1. Определение содержания уроновых кислот 46
2.3.2.2.2. Определение содержания сульфатированных ГАГ 47
2.3.2.2.3. Определение содержания белка 47
2.3.2.2.4. Расчет концентраций уроновых кислот, сульфатированных ГАГ и белка 48
2.3.2.3. Качественное определение вида ГАГ в ПГ костного матрикса 49
2.3.3. Определение макро- и микроэлементов в костной ткани 49
2.3.4. Статистическая обработка результатов 51
ГЛАВА 3. Результаты исследования
3.1. Возрастные изменения костной ткани крыс Wistar 52
3.1.1. Минеральная плотность костной ткани 52
3.1.2. Содержание протеогликанов в минерализованном матриксе... 52
3.1.3. Макро- и микроэлементный состав костной ткани 66
Резюме 67
3.2. Структурно-функциональные особенности костной ткани крыс OXYS 69
3.2.1. Минеральная плотность разных отделов скелета 69
3.2.2. Содержание протеогликанов в минерализованном матриксе... 69
3.2.3. Содержание макро- и микроэлементов в плечевой кости 84
Резюме 87
3.3. Влияние остеотропного вещества на костную ткань 88
3.3.1. Влияние дибутилдитиофосфорнокислого натрия на минеральную
плотность костной ткани 88
3.3.1. Содержание протеогликанов в костном матриксе 88
3.3.3. Макро- и микроэлементный состав костной ткани 102
Резюме 104
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов
4.1. Анализ формирования костного матрикса крыс Wistar 105
4.2. Сравнительный анализ структурно-функциональных изменений костной ткани крыс при остеопорозе 109
4.2.1. Анализ формирования костного матрикса крыс OXYS 109
4.2.2. Сравнительный анализ остеопороза, вызванного введением остеотропного вещества 113
Выводы 118
Список литературы 120
- Строение, функции и химический состав костной ткани в норме
- Двухэнергетическая рентгеновская абсорбциометрия
- Возрастные изменения костной ткани крыс Wistar
- Сравнительный анализ структурно-функциональных изменений костной ткани крыс при остеопорозе
Введение к работе
Актуальность темы. Всемирная организация здравоохранения причисляет остеопороз к основным болезням современной цивилизации. Ряд ученых давно называет его «эпидемией экономически развитых стран» -Европы, Америки, Японии и России (Рожинская Л.Я., 2000; Gullberg В. et al., 1997; Martyn C.N., Cooper С, 1999). Частота заболеваемости остеопорозом увеличивается с возрастом, а связанные с ним проблемы нарастают вместе с увеличением продолжительности жизни населения этих стран (Беневолевская Л. И., 1998), поскольку заболевание является разрушительным и непрерывно прогрессирующим (Downey Р.А., Siegel M.I., 2006). Ситуацию усугубляет тенденция последних лет: резкое увеличение доли людей молодого и среднего возраста с этим диагнозом (Cheng I.C.Y. et al.,2000).
В связи с увеличением продолжительности жизни и ростом заболеваемости трудоспособного населения проблема остеопороза будет становиться все серьезнее на фоне возрастающей частоты остеопоротических переломов, возникающих даже при минимальной травме (Новик А.А. и др., 2001; Беневолевская Л.И., 2003; Цыган Е.Н., Деев Р.В., 2005).
Одним из современных направлений исследования патогенеза остеопороза является изучение метаболических процессов в органическом матриксе костной ткани. Большой интерес представляет изучение структуры одного из компонентов матрикса кости — протеогликанов (ПГ), поскольку эти вещества являются не только структурными компонентами внеклеточного матрикса, но и обладают биологической активностью (Raman R. et al., 2005; Taylor K.R., Gallo R.L., 2006). В зависимости от своей химической структуры ПГ могут тормозить или ускорять пролиферацию клеток, влияя на репликацию ДНК и митозы (Lamoureux F. et al., 2007). Такое влияние может осуществляться за счет взаимодействия ПГ со специфическими рецепторами на клеточной мембране и генерации сигнала внутри клетки с последующей передачей информации к ядерному аппарату синтеза ДНК
5
(Neame P J., Kay K.J., 2000). ПГ обладают микрогетерогенностью -
структурной нерегулярностью строения, что характерно для соединений,
выполняющих регуляторные и информационные функции. Такая
нерегулярность строения прежде всего свойственна сульфатированным
гликозаминогликанам (хондроитинсульфатам, гепарансульфатам,
кератансульфатам), определяющих углеводную составляющую ПГ (Sugahar К., Kitagawa Н., 2000). Известно, что ПГ участвуют в формировании кости: концентрируясь в фокусе кальцификации, они инициируют минеральный рост, вовлекаясь в формирование внеклеточного матрикса, коллагеновых фибрилл (Pins CD. et al., 1997; LamoureuxF. et al., 2007). Они принимают участие в развитии остеобластов из стромальных клеток костного мозга (Neilsen K.L. et al., 2003; Chen X.D. et al., 2004). Благодаря способности поддерживать ферментативную активность катепсина К протеогликаны вовлечены в процессы дегенерации костной ткани (Li Z. et al., 2002; Yasuda Y. et al., 2005; Selent J. et al., 2007).
Скелет, как важнейшая структура минерального обмена, депонирует макро- и микроэлементы, придающие кости прочность и определяющие ее функциональные особенности. Известно, что существует ряд элементов (кальций, фосфор, цинк, медь, марганец), пониженное содержание которых свидетельствует о нарушении остеогенеза и о развитии остеопороза (Авцын А.П. и др., 1991; Скальный А.В., 2004; Ilich J.Z., Kerstetter J.E., 2000; Hambidge М., 2003). Количество и соотношение этих элементов в костной ткани зависят от многих причин: одноименности заряда элементов, взаимоотношения гормональных систем, активности щелочной фосфатазы и наличия органических компонентов в матриксе костной ткани (ПГ, коллаген, остеонектин, тромбоспондин, фибронектин, остеопонтин, костный сиалопротеин и кислый гликопротеин) (Cowles Е.А. et al., 1998; Downey Р.А., Siegel M.I., 2006).
Расширению представлений о метаболизме костной ткани и особенностях этиопатогенеза остеопороза на современном этапе может
6 способствовать создание адекватных биологических моделей. Подобной моделью остеопороза может стать линия преждевременно стареющих крыс OXYS, созданная в 70-е годы прошлого века в Институте цитологии и генетики СО РАН селекцией и инбридингом крыс Wistar (Соловьева Н.А. и др., 1975; Колосова Н.Г. и др., 2003).
Известно, что развитию остеопороза способствуют не только генетические и социальные, но и экологические факторы среды обитания (Карпов А.Б. и др., 2003). К числу остеотропных факторов, вызывающих специфическую патологию, относится дибутилдитиофосфорнокислый натрий, введение которого лабораторным животным раннее использовалось при экспериментальном моделировании вертебральной патологии (Садовой М. А., 1994).
Таким образом,, в настоящее время изучение изменений в структуре протеогликанов и макро-, микроэлементов костной ткани позволит расширить знания об этиопатогенезе остеопороза.
Цель исследования. Изучить роль протеогликанов и минерального состава костной ткани у крыс в норме и при развитии остеопороза.
Задачи исследования:
1. Изучить структурные особенности протеогликанов костной ткани,
содержание макро-, микроэлементов и плотности костной ткани крыс Wistar
разного возраста;
2. Определить структурно-функциональные изменения костного
матрикса крыс OXYS в сравнении с контрольной линией Wistar разного
возраста;
3. Изучить влияние остеотропного вещества
дибутилдитиофосфорнокислого натрия на структурные особенности костной
ткани крыс линий Wistar и OXYS.
4. Выявить общие структурные изменения протеогликанов костной
ткани и особенности содержания макро-, микроэлементов у крыс Wistar и
OXYS при развитии остеопороза.
7 Научная новизна состоит в том, что впервые:
изучены количественные и качественные особенности структуры протеогликанов костного матрикса у крыс Wistar разного возраста, проведена корреляционная взаимосвязь этих изменений с минеральными компонентами и плотностью костной ткани;
определены структурно-функциональные изменения протеогликанов крыс OXYS при развитии остеопороза, выявлены корреляционные взаимосвязи с макро- и микроэлементным составом костной ткани;
- установлено влияние дибутилдитиофосфорнокислого натрия на
структурно-функциональные изменения в протеогликанах и минеральных
компонентах костной ткани у крыс линий Wistar и OXYS.
Теоретическое и практическое значение. Полученные данные способствуют более.точному пониманию механизмов развития остеопороза, участия в этом процессе органического и минерального матрикса костной ткани. Результаты исследования выявляют особенности структурно-функциональных изменений в различных отделах скелета с возрастом и при патологии, что впоследствии может быть использовано как основа для разработки новых методов лечения остеопороза.
Положения, выносимые на защиту:
В процессе онтогенеза у крыс Wistar к 8-месячному возрасту происходит увеличение минеральной плотности костной ткани, характеризующееся уменьшением количества ПГ с изменением их качественного состава - исчезновением дерматансульфата и появлением кератансульфата при параллельном накоплении в кости кальция, меди и цинка.
У крыс линии OXYS (соответствующего возраста) развивается остеопороз, связанный с избыточным накоплением ПГ и качественными изменениями их структуры — увеличением хондроитинсульфата, дерматансульфата и отсутствием кератансульфата, что является причиной
8 снижения минеральной плотности костной ткани и содержания в ней кальция, фосфора, меди и цинка по сравнению с контролем.
3. Остеотропное вещество дибутилдитиофосфорнокислый натрий в концентрации 1 ПДК вызывает остеопороз у крыс Wistar и OXYS, снижение количества макро-, микроэлементов в костной ткани. Степень количественных и качественных изменений ПГ зависит от исходного их содержания у интактных животных соответствующей линии.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения,
четырех глав, включающих обзор литературы, материалы и методы
исследования, результаты исследования и их обсуждение, выводы. Список
литературы содержит 212 источников, из них 177 зарубежных. Работа
изложена на 143 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц и 40
рисунков. ....
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на II Российском конгрессе по остеопорозу (Ярославль, 2005); IV Всероссийской научно-практической конференции «Биологическая наука и образование в педагогических вузах» (Новосибирск, 2005); III конференции с международным участием «Проблема остеопороза в травматологии и ортопедии» (Москва, 2006); XLIV Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2006); конференции «Осенние зоологические сессии памяти И. И. Шмальгаузена» (Новосибирск, 2006); Всероссийской конференции, посвященной памяти и 100-летию со дня рождения В. А. Пегеля «Механизмы индивидуальной адаптации» (Томск, 2006); на заседаниях кафедры анатомии, физиологии и безопасности жизнедеятельности Института естественных и социально-экономических наук Новосибирского государственного педагогического университета.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ, из них 3 - в ведущих рецензируемых научных журналов и изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Строение, функции и химический состав костной ткани в норме
Костные ткани по структуре делят на кортикальную (компактную) и губчатую (спонгиозную). Внутри этой классификации кортикальная и губчатая костные ткани могут состоять из перепончатой ретикулофиброзной (первичной) или из пластинчатой (вторичной) кости. Кортикальная и губчатая костные ткани имеют схожую структуру и состав матрикса, но различаются по массе, причем в кортикальной кости отношение массы к объему больше (Buckwalter J.A. et al., 1996; Downey P.A., Siegel M.I., 2006).
Кортикальная костная ткань окружает костномозговую полость и трабекулярные пластинки губчатой кости. Она составляет до 80% зрелого скелета и формирует диафиз или тело трубчатых костей. Метафиз и эпифиз этих костей имеют более тонкие кортикальные стенки, причем эпифиз формирует луковицеобразный конец, окружающий внутреннюю губчатую кость. Короткие кости (например, кости предплюсны и запястья), позвонки, череп и кости таза также имеют более тонкие кортикальные стенки, но содержат больший процент губчатой костной ткани по сравнению с длинными костями (Pratt N.E., 1991; Buckwalter J.A. et al., 1996).
Различия в механических свойствах между кортикальной и губчатой костью связаны с особенностями архитектоники. Массивное, плотное строение диафиза длинных костей обеспечивает более высокое сопротивление кортикальной кости к скручиванию и сгибанию, тогда как губчатая кость обеспечивает большую упругость и амортизацию, как, например, в эпифизарном отделе длинных костей. Губчатая кость обычно имеет более высокий уровень метаболизма и быстрее реагирует на изменения механической нагрузки или ее отсутствие, например, при длительной иммобилизации. Это может быть связано, в частности, с тем что костные клетки в губчатой кости испытывают большее влияние прилежащих клеток костного мозга и кровоснабжения, тогда как клетки кортикальной кости глубже погружены в костный матрикс (Downey Р.А., Siegel M.I., 2006).
В кости имеются 4 вида костных клеток: остебласты, остеоциты, клетки выстилающие кость и остекласты (Buckwalter J.A. et al., 1996; Ducy P., Schinke Т., Karsenty G., 2000; Downey P.A., Siegel M.I., 2006).
Остебласты, остеоциты и выстилающие клетки происходят из мезенхимальных стволовых клеток, известных как остеопрогениторные (Риггз Б.Л., Мелтон III Л.Дж., 2000; Schecroun N., Delloye С.Н., 2003). Костные клетки, располагающиеся вдоль поверхности кости, включают: остеобласты, остеокласты и выстилающие клетки, тогда как остеоциты локализованы внутри кости (Buckwalter J.A. et al., 1996).
Остеобласты (ОБ) - клетки костной ткани, функционально ответственные за продукцию органического матрикса (белков и полисахаридов) (Holtrop М.Е., 1990). ОБ происходят из недифференцированных мезенхимальных клеток, которые находятся в костном мозге, эндосте, периосте и костных каналах. Эти недифференцированные клетки называют также «преостеобласты», они могут мигрировать из окружающих тканей или кровеносной системы (Gurevitch О., Slavin S., 2006). Мезенхимальные клетки имеют звездообразную форму, содержат относительное малое количество цитоплазмы и органелл и имеют одно ядро. Дифференцирование и пролиферация мезенхимальных клеток в остеобласты происходит в процессе как внутриперепончатого, так и эндохондриального формирования кости (Buckwalter J.A. et al., 1996; Ducy P. et al., 2000).
ОБ имеют характерные морфологические признаки, выявляющиеся на электроно-микроскопическом уровне. Активные ОБ овальны и обладают развитым шероховатым эндоплазматическим ретикулумом и обширным аппаратом Гольджи. Их единственное ядро располагается в середине клетки (Holtrop М.Е., 1990). В ОБ найдены многочисленные орган еллы — митохондрии, микротрубочки и микрофиламенты. Цитоплазма клеток резко базофильна. ОБ четко поляризованы, продуцируют и секретируют матрикс только на базальной стороне. Зрелые ОБ не способны к делению, однако любой ОБ может развиться по одному из трех возможных путей: 1) оставаться активным остеобластом; 2) быть окруженным матриксом и стать остеоцитом; 3) стать относительно неактивным и сформировать клетки, выстилающие кость (Mackie E.J., 2003).
Двухэнергетическая рентгеновская абсорбциометрия
В работе выполнены три серии экспериментов. 1 серия. Изучение возрастных особенностей костной ткани у крыс-самцов Wistar (табл. 3) 2 серия. В данной серии изучали особенности развития костной ткани крыс OXYS, предрасположенных к развитию остепороза. Крысы Wistar соответствующего возраста являлись контрольной группой (табл. 3).
Линия крыс OXYS создана в Институте цитологии и генетики СО РАН селекцией и имбридингом крыс Wistar, высоко чувствительных к катарактогенному эффекты диеты, богатой галактозой (Соловьева Н.А. и др., 1975; Соловьева Н.А. и др., 1987). В клетках этих животных выявлен высокий уровень перекисных радикалов, преобладающий над их обезвреживанием антиоксидантными системами (Синицкая Н.С., Хавинсон В.Х., 2002; Salganik R.I. et al., 1994). Данный генетический дефект метаболизма вызывает изменения в организме крыс OXYS, которые формируют синдром ускоренного старения (Колосова Н.Г. и др., 2003; Inbred strains of rats, 1996). Таблица З Схема экспериментов 1 серия 2 серия 3 серия
Изучение возрастных Изучение Изучение влияния особенностей костной структурно- дибутилдитиофосфорнокислого ткани крыс Wistar функциональных натрия на костную ткань крыс в возрасте особенностей костной 2,4,6 и 8 мес. ткани у крыс OXYS 2-х месячные крысы-самцы линии Wistar и OXYSв течение 4-х месяцев получали раствор ДДФКН с концентрацией 1ПДК Группы животных Крысы Wistar: Крысы OXYS: Крысы линии Wistar: 1. 2 мес; 1. 2 мес; 1. Животные контрольной группы 2. 4 мес; 2. 4 мес; получали воду 3. 6 мес; 3. 6 мес; 2. 1 ПДК ДЦФКН 4. 8 мес. 4. 8 мес. Крысы линии OXYS: Контрольная группа - 3. Животные контрольной группы крысы Wistar получали воду соответствующего 4. 1 ПДК ДДФКН возраста ] количество животных в группах по 8-10 крыс по 8-12 крыс по 10-12 крыс По сравнению с линией Wistar, у крыс OXYS снижена на 28% продолжительность жизни (Колосова Н.Г. и др., 2002), имеет место раннее снижение фертильносте, ранние инволютивные изменения внутренних органов и развитие таких заболеваний как кардиомиопатия (Лушникова Е.Л. и др., 1999), эмфизема, катаракта (Колосова Н.Г. и др., 2003; Salganik R.I. et al., 1994), повышенная частота возникновения злокачественных опухолей, артериальная гипертензия (Колосова Н.Г. и др., 2003).
Раннее проявлением инволютивных изменений в костной ткани крыс OXYS служили деформации позвоночного столба, рентгенологически напоминающие врожденный сколиоз человека с клиновидными дефектами тел позвонков (Лоскутова Л.В., Колосова Н.Г., 2000). Однако в настоящее время видимые изменения позвоночника у крыс OXYS не встречаются, но выявлены ранние нарушения минерализации костной ткани (Колосова Н.Г. и. др., 2002) и развитие остеопороза у крыс к 6 месячному возрасту (Колосова Н.Г. и др., 2002; Фаламеева О.В. и др., 2006). Последнее, позволяет надеяться, что крысы линии OXYS станут моделью остеопороза, подобно модели мышей SAM/P6, созданной в Японии (Chen Н. et al., 2005).
3 серия. Для изучения влияния факторов внешней среды на развитие остеопороза в работе использовали раствор дибутилдитиофосфорнокислого натрия, которым в хроническом эксперименте затравливали крыс линий Wistar и OXYS (табл. 3). Начиная с 2 месячного возраста, животным обеих линий в течение 4 месяцев 5 раз в неделю внутрижелудочно через зонд вводили водный раствор дибутилдитиофосфорнокислого натрия (ДДФКН) в концентрации 1 ПДК (0,2 мг/л). Контрольным животным вводили соответствующий объем воды (по 0,5 мл на 100г массы тела).
ДДФКН — легко диссоциирует на ионы в водном растворе. Он является одним из основных флотационных реагентов, применяемых в горнодобывающей промышленности и цветной металлургии (Трофимович Е.М., Гурвич СМ., 1985). Молекулярная формула дибутилдитиофосфорнокислого натрия:
Денситометрическое исследование минеральной плотности костной ткани (МПКТ) является в настоящее время «золотым стандартом» в диагностике остеопороза и основным методом оценки прочности скелета и определения риска возникновения переломов.
МПКТ крыс линий Wistar и OXYS измеряли методом дихроматической рентгеновской абсорбциометрии (DEXA) на рентгеновском костном денситометре «HOLOGIC Discovery-A», США (отделение лучевых методов диагностики ФГУ НИИТО) с использованием программы - «Small animals». Системные требования программы включали необходимость предоставления по каждому животному параметров: персонального номера, веса, длины тела и возраста на дату исследования. НСШЗКГ МПКТ измеряли под легким эфирным наркозом у всех животных, участвующих в экспериментах, а также в динамике развития (в 2, 4, 6 и 8 месяцев). Результат исследования МПКТ имел вид денситограммы (рис. 2). Определяли минеральную плотность всего скелета (region global), позвоночника (region R1), плечевых (region R2, R3), бедренных костей (region R4, R5) и обеих челюстей (region R6). МПКТ (показатель BMD) выражена в г/см .
Для биохимических исследований были взяты образцы тел позвонков, передних и задних конечностей и костей обеих челюстей (без зубов). Биопробы первоначально, механически очищали от остатков. мягких тканей. От каждого образца отсекался костный фрагмент, который предварительно взвешивали и помещали в сушильный шкаф (100С) на сутки для определения процента содержащейся в нем воды.
После предварительного очищения все пробы взвешивали и декальцинировали в 0,5 Н растворе соляной кислоты (Реактив, Россия) при температуре +4 С при постоянном перемешивании в течении 48 часов. Оставшийся органический материал промывали дистиллированной водой и мелко измельчали, затем обрабатывали раствором папаина (ICN, США) из расчета 0,2 мг на 1 г сырого веса ткани в Na-ацетатном 0,2 М буфере с добавлением 0,01 М ЭДТА (Медиген, Россия) и 0,01 М цистеина (Roana, Болгария) рН 5,8 в течение 18 часов при 60 С.
Из полученного раствора белки осаждали добавлением к образцам 100% трихлоруксусной кислотой (Реактив, Россия) до конечной концентрации 5% при +4С и центрифугировали в течение 15 минут со скоростью 12 тыс. об./мин. Отобранный супернатант диализовали против 50 мМ Na-ацетатного буфера рН 5,8 с 0,1 М ЭДТА (Медиген, Россия) в течение 18 часов при температуре +4 С.
Возрастные изменения костной ткани крыс Wistar
Тела позвонков. О содержании ПГ в костной ткани судили по их
углеводной части — ГАГ, которые определяли по количеству уроновых кислот и сульфатных групп на цепях ГАГ (сульфатированные ГАГ). В телах позвонков количество УК в ПГ у крыс Wistar снижалось - к 6 мес. возрасту уменьшилось в 2 раза (2,82±0,111 мкг/мг, р 0,01) (рис. 5 А). К 8 мес. данный показатель вновь возрастал (3,37+0,089 мкг/мг, р 0,01), не достигая значений 2 месячных животных.
У крыс Wistar количество С-ГАГ в ПГ к 6 месяцам уменьшилось с 6,16±0,285 мкг/мг до 2,11±0,057 мкг/мг (р 0,01) (рис. 5 Б). К 8 мес. содержание С-ГАГ возрастало до 2,43±0,031 мкг/мг (р 0,03) (рис. 5 Б).
Количество белка в ПГ снижалось к 4 мес, достигнув минимального содержания за весь период исследования (0,11 ±0,004 мкг/мг, р 0,01). К 8 мес. возрасту концентрация белка увеличилась в 10 раз (р 0,01), достигнув значения 1,12±0,041 мкг/мг (рис. 5 В). 0,35-, A 0,30 0,30 р 0,03, # - р 0,01 по сравнению с предыдущим возрастом В результате обработки растворов ПГ хондроитиназой АС с последующим электрофорезом образцов в ОД М трис-буфере (рН 7,3) выявлено присутствие ХС-АС во всех исследуемых костных образцах во все возрастные периоды (2, 4, 6 и 8 мес.) (рис. 6). После ферментативной обработки ПГ хондроитиназой ABC, обнаружен КС в телах позвонках у крыс линий Wistar только в возрасте 8 месяцев. При последовательной ферментативной обработке исходных растворов ПГ хондроитиназой АС и ABC на электрофореграмме обнаружен ДС, который определялся в ПГ только у крыс Wistar 2- и 4- месячного возраста.
Таким образом, у крыс Wistar в ПГ костного матрикса тел позвонков в 2 и 4 мес. присутствовал ХС-АС и ДС, к 6 мес. из ГАГ оставался лишь ХС-АС (исчезал ДС), к 8 мес. возрасту начинал активно накапливаться КС (табл. 4).
Обработка ПГ костного матрикса крыс Wistar хондроитиназой АС с последующим электрофорезом в трис-буфере, позволила выявить присутствие ХС-АС во всех исследуемых костных образцах в течение всего эксперимента (рис. 10). После обработки ПГ хондроитиназой ABC был выявлен КС у крыс Wistar в 6-8 месячном возрасте (табл. 6). При последовательной обработке исходных образцов двумя хондроитиназами (АС и ABC) на электрофореграмме обнаружено присутствие ДС в 2 и 4-месячном возрасте.
У крыс Wistar в ПГ костного матрикса задних конечностей в период 2-4 мес. присутствуют лишь хондроитинсульфаты (ХС-АС и ДС) (табл. 6). К 6 мес. качественный состав ГАГ изменяется: исчезает ДС и появляется КС. Таким образом, в возрасте 6-8 мес. минерализованный костный матрикс содержит в своем составе ХС-АС и КС.
Концентрация белка в возрасте 4-8 мес. возрастала: увеличившись к концу эксперимента в 7 раз (0,36+0,028 мкг/мг, р<0,01) (рис. 11 В).
Ферментный анализ ПГ с последующим электрофорезом в трис-буфере, позволил выявить присутствие ХС-АС, ДС и КС во всех исследуемых костных образцах в течение всего эксперимента с 2 до 8 мес. (рис. 12) (табл. 7). Данное обстоятельство в значительной степени отличает кости обеих челюстей от ранее рассмотренных типов костей, в которых наличие других ГАГ, кроме ХС-АВ, не было постоянным (табл. 4, 5, 6).
Сравнительный анализ структурно-функциональных изменений костной ткани крыс при остеопорозе
Экспериментальное исследование особенностей структурно-функциональных изменений костного матрикса позволило выявить взаимосвязь между качественным, количественным составом ПГ и формированием растущей МПКТ с возрастом у крыс Wistar.
В эксперименте с 2 до 8 мес. происходит снижение количества ПГ во внеклеточном матриксе костной ткани. Известно, что ремоделирование костной ткани в норме, включает в себя два разнонаправленных процесса -резорбцию и синтез внеклеточного матрикса (Риггз Б.Л., Мелтон III Л.Дж., 2000). Снижение количества ПГ к 6 месячному возрасту у крыс Wistar в телах позвонков и конечностей связано с деградацией молекул, содержащих ДС (табл. 4, 5, 6). Поэтому абсолютно логичным является уменьшение концентрации С-ГАГ, образующих ДС (Raman R. et al., 2005; Taylor K.R., Gallo R.L., 2006). Уменьшение количества УК к 6 мес. связано с качественной сменой пулов молекул ПГ в костном матриксе и сокращением в структуре новосинтезируемых молекул доли ХС-АС. Установлено, что существует отрицательная корреляционная взаимосвязь между снижением концентрации УК и С-ГАГ в ПГ с возрастающей МПКТ (г=-0,86; г=-0,92, соответственно, р 0,05) к 8 месячному возрасту (табл. 16).
Появление КС в костном матриксе с возрастом является следствием постепенного синтеза остеобластами новых молекул ПГ (рис. 37). Возможно, что обнаруженный КС входит в состав мирнекана. Funderburgh J.L. с соавторами, в эксперименте in vitro показал, что мирнекан (остеоглицин у человека) является остеоиндуктивным фактором - способствует активному формированию костной ткани, активации синтетичеческой деятельности остеобластов (Funderburgh J.L. et al., 1997). Поэтому мы предполагаем, что содержащийся во внеклеточном матриксе кератансульфатный ПГ, оказывает активирующее влияние на синтез коллагена (рис. 37). Небольшой пул ПГ с ХС-АС в матриксе тел позвонков и конечностей (табл. 4, 5, 6), также способствует формированию коллагеновых фибрилл (Lamoureux F. et al., 2007) и как следствие повышению минерализации костной ткани (рис. 37) (Риггз Б.Л., Мелтон III Л.Дж., 2000).
Выявлено, что существует прямая корреляционная связь между содержанием белка в ПГ костном матриксе с уровнем МПКТ (г=0,76; г=0,67 соответственно, р 0,05) (табл. 16). Как следует из результатов, в ПГ минерализованного матрикса всех исследованных образцов костной ткани в возрасте 6-8 мес. происходит накопление большого количества белка. Мы предполагаем, что данный процесс связан с синтезом ПГ с более длинным белком кора и относительно малым количеством ГАГ (ХС-АС и КС), прикрепленных к нему в костях тел позвонков и конечностей. Возможно, именно эти изменения в строении молекул ПГ способствуют дальнейшему росту костей и увеличению их минеральной плотности, поскольку еще в работах Vogel K.G. (1984) и Pogany G. (1994) предполагалось, что белок кора, связываясь с коллагеном I и II типа, будет способствовать увеличению прочностных свойств соединительной ткани.
По результатам эксперимента установлено, что на формирование высокого уровня МПКТ тел позвонков, передних и задних конечностей способны влиять накопления в матриксе костной ткани ПГ, содержащих в своей структуре КС (г=0,7, р 0,05) (табл. 16). Данный процесс связан: с опосредованным влиянием КС на остеобласты, как следствие повышения синтеза коллагена; и прямой адсорбцией минеральных компонентов на кератансульфатных ПГ (рис. 37). Известно, что КС является самым сульфатированным из ГАГ костной ткани (Roughley P.J., Lee E.R., 1994; Funderburgh J.L., 2000). Входящие в структуру КС сульфатные группы создают дополнительные отрицательные заряды, способные адсорбировать на своей поверхности большее количество катионов кальция (Bartold P.M., 1990) по сравнению с хондроитинсульфатами.
Особенностью качественного состава ГАГ костей обеих челюстей является постоянное присутствие в процессе всего исследования всех трех видов ГАГ: ХС-АС, ДС и КС (табл. 7). Количественные изменения, выявленные в костях обеих челюстей в ПГ имели те же тенденции, что и в остальных отделах скелета. Таким образом, перестройка матрикса в костях челюстей, по всей видимости, касалась соотношения разных видов ГАГ друг относительно друга.
Таким образом, особенности ПГ внеклеточного матрикса крыс Wistar способствовали активной минерализации тел позвонков, конечностей и костей обеих челюстей.
Как видно из таблицы 16, на формирование МПКТ напрямую влияет содержание в костном матриксе Са (г=0,66, р 0,05), эти результаты согласуется с представлениями большинства ученых, что минеральная плотность в первую очередь зависит от содержания в ней этого макроэлемента (Cowles Е.А. et al., 1998; Downey P.A., Siegel M.I., 2006).
