Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 6
Актуальность проблемы...„6
Цель и основные задачи исследования 9
Научная новизна,... 10
Научно-практическое значение.. Л 3
Основные положения, выносимые на защиту.. ..14
ГЛАВА 1. ИССЛЕДОВАНИЕ ОБОНЯТЕЛЬНЫХ РЕЦЕПТОРНЫХ ОТВЕТОВ
(ЭОГ) У МЛЕКОПИТАЮЩИХ НА ДЕЙСТВИЕ ЗАПАХОВ РАЗЛИЧНОЙ
ПРИРОДЫ... 15
1.1 Условия отведения ЭОГ от изолированного препарата обонятельного органа
млекопитающих.... 17
1.1.2. Изменчивость высоты эпителия и амплитуды электроольфактограммы у
лабораторных мышей.. .25
1.1.3. Морфометрическое исследование структурной организации
обонятельного органа лабораторных мышей.. .29
1.1.4. Выбор экспериментального объекта исследования...32
1.2. Специфическая аносмия к запаху изовалериановой кислоты в рецепторном
отделе обонятельного анализатора самцов мышей C57BL /6....33
1.2.1. Морфометрические исследования структурной организации основного обонятельного органа у лабораторных мышей линии В6 и АК.. .39
1.3. Рецепция запахов и нейрогенез в обонятельном эпителии.
Экспериментальная аносмия у лабораторных мышей.... 44
1.3.1. Морфо функциональное исследование обонятельного органа мыши
после воздействия сульфата цинка...45
1.3.2. Взаимосвязь между нейрогенезом и электрическими ответами
обонятельных рецепторов на запахи, различной природы...53
1.4. Гормональный контроль рецепции запахов в обонятельном эпителии
млекопитающих... .63
1.4.1. Влияние половых гормонов на морфологические характеристики
обонятельного эпителия и рецепцию запахов.. .65
1.4.2. Влияние гонадоэктотомии и последующих инъекций тестостерона на
обонятельное поведение самцов мышей.. .72
1 1.4,3. Особенности рецепции запахов у циклирующих самок мышей... 84
Возрастные изменения обонятельной чувствительности к запахам...91
Основные принципы рецепции биологических запахов,., 100 ГЛАВА 2. МОЛЕКУЛЯРНО-СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ПОВЕРХНОСТИ ОБОНЯТЕЛЬНОГО ЭПИТЕЛИЯ ПОЗВОНОЧНЫХ И РЕЦЕПЦИЯ ЗАПАХОВ... 101
^ 2.1. Метод послойных препаратов для изучения молекулярно-структурной
организации поверхности обонятельного эпителия... 104 2,2. Белковые комплексы поверхностных структур обонятельного эпителия. 1
Водорастворимые белки поверхностных структур обонятельного эпителия... 110
Гликопротеиновые компоненты поверхностных структур обонятельного эпителия. ..113
Участие в обонятельной рецепции белков поверхности обонятельного органа.. .123
2.3. Ферментные системы поверхности обонятельного эпителия
I молекулярные механизмы возбуждения обонятельной клетки. ..124
2.3.1. Ультраструктурная локализация стимул - зависимой АЦ... 126
* 2.3.2. Система АТФ - эктоАТФазы обонятельного эпителия. ..131
2.3.2.1. Экспериментальные подходы к изучению энзиматической активности поверхности обонятельного эпителия. ..132
Свойства поверхностной АТФазы обонятельного эпителия лягушки... 143
Влияние кальция и магния на активность экто-АТФазы обонятельного эпителия лягушки. ..150
Идентификация экто-АТФазы поверхностных структур обонятельного эпителия некоторых позвоночных животных... 154
2.3.2.5. Содержание АТФ в обонятельном органе лягушки и ее участие в
рецепторном процессе... 167
2.3.2.6. Роль системы АТФ - экто АТФазы в обонятельной рецепции.... 176
2.3.3. Щелочная фосфатаза в обонятельном эпителии позвоночных и
обонятельная рецепция... 178
Методы исследования ЩФ в обонятельном эпителии... 179
Локализация и активность щелочной фосфатазы в обонятельном эпителии... 182
Молекулярные формы щелочной фосфатазы обонятельного эпителия... 194
Биохимические исследования активности щелочной фосфатазы и ее участие в рецепции запахов...202
2.3.4. Перспективы исследований роли щелочной фосфатазы и экто-АТФазы в
обонянии... 204
ГЛАВА 3. НАЗАЛЬНЫЙ ПУТЬ В ЦЕНТРАЛЬНУЮ НЕРВНУЮ СИСТЕМУ: ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ТРАНСПОРТА ВЕЩЕСТВ...210. 3.1 Анатомо-функциональные основы интраназального транспорта
веществ...213 3.2. Обонятельная система как транспортный канал для поступления фармакологических препаратов в ЦНС ...219
3.2.1. Физиологические основы транспорта веществ через ткани
обонятельной системы.. .223
Экспериментальные доказательства транспорта различных веществ в структуры головного мозга через обонятельную систему.. .226
Влияние препарата экзогенного гистона на внутривидовую агрессию самцов мышей при интраназальном введении...232
Влияние на внутривидовую агрессию самцов мышей, интраназальное введение ГАМК и сиднофена. ..235
3.3 Исследование возможностей облегчения доступа лекарственных препаратов при использовании назальной доставки...241
3.3.1 Сравнительное исследование фосфолипидного состава обонятельного
эпителия и мозга домашней свиньи и серой крысы. ..2423.3.2 Получение и исследование свойств многослойных аутолипосом...247
Заключение... 250Выводы...252
Список использованной литературы 256
Введение к работе
значительной степени также тем, что, как мы полагаем в обонятельной
рецепции должно существовать несколько таких механизмов, по крайней мере два, связанных с рецепцией видоспецифических обонятельных сигналов и неспецифических для данного вида животных.
Функциональная значимость обонятельной системы продолжительное время оставалось малопонятной для ученых. Открытие, а затем и синтез феромонов, сформировали целое направление исследований, связанное с хемокоммуникацией животных. В настоящее время совершенно очевидно, что обонятельная система обеспечивает восприятие химических сигналов, связанных с различными аспектами существования в окружающей среде как беспозвоночных, так и позвоночных животных. Феромоны (биологически значимые запахи) запускают различные формы поведения социального, пищевого, территориального^ полового, материнского и другие, оформляясь в химическую коммуникативную систему, которая у одних видов достаточно хорошо изучена (насекомые, рыбы, грызуны), тогда как у других только начинает изучаться (человек). Многообразие химических сигналов определяет «химический язык» того или иного вида животных, сложившийся в ходе эволюционных изменений. Однако важно понимать, что он в значительной степени видоспецифичен, иначе функция химической коммуникации для данного вида была бы невыполнимой.
Тем не менее, основные исследования в обонянии наземных позвоночных сделаны при изучении клеток с неспециализированной чувствительностью к запахам, имеющим для человека сильный характерный запах, но никак не связанных с биологией и поведением экспериментального животного.
Другая сложность в исследовании связана с самой организацией поверхности обонятельного эпителия, исключающей получение «чистых» дифференцированных препаратов мембран обонятельных жгутиков (Мепсо, 1982). Эти сложности в структурной организации обонятельного эпителия вынуждают вести поиски других экспериментальных подходов, отличных от
тех, которые были весьма эффективно использованы, например, в расшифровке первичных механизмов зрительной рецепции (Островский, 1977). Все эти проблемы могут быть решены с помощью новых методических подходов, позволяющих интегрировать общеизвестные биохимические методы с детальными цитохимическими исследованиями и новыми функциональными моделями, для которых известны биологически значимые запахи-стимулы, так и с использованием новых принципов исследования поверхностной организации обонятельного эпителия (послойные препараты).
Исследование функций и механизмов работы периферического отдела обонятельной системы имеет важные прикладные аспекты. Известно, что обонятельные нейроны по своей природе наиболее близки к нейронам ЦНС. (Винников, 1971). При этом они способны к обновлению (Graziadei, 1973). Механизмы нейрогенеза и клеточной дифференцировки обонятельных нейронов чрезвычайно важны для понимания этих процессов у нейронов ЦНС. Включение в настоящее исследование модели экспериментальной аносмии, в которой участвуют регенерационные процессы может способствовать ряду интересных заключений по этому прикладному аспекту.
Обонятельные нейроны находятся на периферии, но связаны с корковыми отделами ЦНС с помощью обонятельных проводящих путей, обладающих различными формами аксонального транспорта (Baker, Spencer, 1986). Интраназальные формы доставки ряда белкозых препаратов (гормоны гипофиза) известны с 20х годов прошлого столетия (Su, 1986), однако они предполагали, что транспорт осуществляется только через сосудистую систему носовой полости (Su, 1986). Исследование участия в транспорте лекарственных препаратов нервных путей обонятельной системы может изменить как идеологию форм доставки лекарств, так и сами лекарственные препараты, что имеет актуальное значение для лечения заболеваний, связанных с нарушениями
в метаболизме медиаторов, нейропептидов, гормонов гипофиза и эпифиза, а также в лечении различных форм наркоманий.
Исследование механизмов функционирования обонятельной рецепции
1 входят в современные основные направления фундаментальных исследованийбиологической науки - (5): 5.7. Рецепция и клеточная сигнализация. 5.12. Механизмы функционирования сенсорных и двигательных систем. 5.14. Экологические и эволюционные аспекты поведения и коммуникации. (Основные направления фундаментальных исследований, приложение к постановлению Президиума РАН № 233 от 1 июля 2003 г.)
Цель и основные задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование механизмов обонятельной рецепции биологически значимых и индифферентных запахов и установление молекулярно-структурной
* организации поверхности обонятельного органа, а также участия ряда
фрагментов этой структуры в процессах обонятельной рецепции.Конкретные задачи, определяемые целью исследования, включали следующее:
Разработка и апробация комплексного методического подхода для изучения
различий в механизмах обонятельной рецепцил биологически значимых и
индифферентных запахов, а также молекулярной композиционной
структуры поверхности обонятельного эпителия, сочетающего
электрофизиологические, поведенческие, морфологические,цитохимические и нейрохимические методы;
Поиск, апробация и исследование функциональных моделей, позволяющих демонстрировать существование специфического механизма рецепции биологически значимых запахов;
Изучение молекулярно- структурной организации поверхности обонятельного эпителия у представителей разллчных классов позвоночных
и участия определенных компонентов этой структуры в энергетическом обеспечении рецепторного и сопутствующих ему процессов; Исследование нерецепторного взаимодействия поверхности обонятельного эпителия с веществами, необладающими запаховыми свойствами, и способными транспортироваться в ЦНС по нервным обонятельным путям. Научная новизна. Настоящая работа представляет новое направление в исследовании механизма обонятельной рецепции позвоночных животных, состоящее в применении интегрированного методического подхода, позволяющего использовать поведенческие, электрофизиологические, морфологические, цитохимические и нейрохимические критерии, что дало возможность установить ряд важных закономерностей в работе обонятельного органа. Разработаны и апробированы экспериментальные модели, в опытах на которых было продемонстрировано наличие специфических рецепторных механизмов для восприятия биологически значимых запаховых сигналов. Было впервые продемонстрировано, что дефект в рецепции генетически наследуемой специфической аносмии к запаху изовалериановсй кислоты, обнаруженной у самцов мышей линии C57BL/6 в условиях поведенческих экспериментов (Wysocki et al., 1977), регистрируется на уровне ответов обонятельных рецепторов, при этом отсутствовали какие-либо морфологические нарушения в обонятельном органе этих животных. Было показано, что самки этой генетической линии мышей обладали нормальной чувствительностью к этому запаху. Опыты на гибридах продемонстрировали, что этот наследуемый признак сцеплен с половой У-хромосомой.
Впервые установлено, что в опытах с использованием модели экспериментальной аносмии, вызванной ирригацией 1% раствором сульфата цинка (Harding et al, 1977), после разрушения рецепторных клеток и их последующей регенерации в результате нейрогенеза, восстановление способности к рецепции различных по природе запахов происходит с
различной скоростью. В начале появляются ответы на неспецифические запахи, и лишь позднее - на запахи, имеющие биологическое значение для данного вида животных (домовые мыши).
Обнаружены сходные эффекты на другой экспериментальной модели: кастрации и последующей гормонозаместительнои терапии. Кастрация сопровождалась дегенеративными изменениями в структуре обонятельного эпителия, которые затрагивали, прежде всего, рецепторные клетки и процессы их обновления. При этом, в значительной мере нарушалась рецепция биологически значимых запахов, тогда как рецепция индифферентных запахов затрагивалась в значительно меньшей степени. Однако, в ходе изучения колебаний обонятельной чувствительности у самок к подобным запахам в различные периоды эстрального цикла было показано, что изменения обонятельных порогов не связано с периферическими механизмами рецепции, а регулируется центральными отделами нервной системы.
Подробно изучены морфологические и функциональные изменения чувствительности к различным типам запахов на возрастной модели. Продемонстрировано, что наиболее высокая чувствительность к запахам, имеющим биологическую значимость, у животньх наблюдается в состоянии половозрелости и уменьшается при старении, при этом у старых животных в эпителии появляются участки аносмичные к запахам, имеющим биологическую значимость, но нормально отвечающие на запахи индифферентного характера.
Основным итогом наших исследований можно считать экспериментальные доказательства, подтверждающие наличие специфичного механизма обонятельной рецепции биологически значимых запахов. В основе такого механизма рецепции могут быть специфические белковые образования. Доказательством существования такого механизма у млекопитающих служат результаты исследования моделей генетически г.аследуемой специфической аносмии. Важным итогом также следует считать тесную связь рецепции
биологически значимых запахов с уровнем половых гормонов в крови, уменьшение этого уровня при кастрации или старении приводит к снижению способности обонятельных рецепторов воспринимать запахи подобной природы, тогда как общая чувствительность к запахам неспецифического характера снижается в гораздо меньшей степени или не изменяется.
В ходе проведенного исследования были впервые изучены особенности
* молекулярной организации поверхностных образований (обонятельная слизь и
обонятельные жгутики) обонятельного эпителия, являющихся местом
взаимодействия с молекулами запаховых веществ у представителей различных
классов позвоночных животных (рыбы, амфибии, млекопитающие).
Продемонстрирован значительный консерватизм в молекулярной организации
поверхностного отдела обонятельного эпителия у позвоночных различных1 классов. Детально изучены фосфолипидный, белковый и гликопротеиновый
состав обонятельной слизи и обонятельных жгутиков.
На поверхности наружных мембран обонятельных жгутиков и обонятельных булав выявлена стимул - зависимая аденилатциклаза, участвующая в синтезе цАМФ в ходе рецепции запаховых молекул.
Впервые продемонстрировано, что на поверхности обонятельного эпителия развертываются, сопряженные с рецепцией запахов, энергетические превращения, осуществляемые при участии различных экто-фосфогидролаз (щелочные фосфатазы, АТФазы). Детально изучены их свойства и локализация
* в поверхностных структурах обонятельного эпителия.
На основании результатов этих исследований и литературных данных было сформулировано представление о том, что в механизме рецепции пахучих соединений, не имеющих биологической значимости для определенного вида животных т.е. не входящих в систему его хемокоммуникативного «языка», могут быть задействованы молекулярные перирецепторные процессы.
Впервые была продемонстрирована возможность нерецепторного
транспорта через обонятельную систему в ЦНС в обход ГЭБ различных по
молекулярному весу незапаховых химических соединений (белки,нейропептиды, медиаторы, модуляторы ЦНС).
Научно-практическое значение. Результаты работы дают новое представление об организации поверхностности обонятельного эпителия позвоночных и роли некоторых выявленных молекулярных структур в акте обонятельной рецепции и процессах, ему сопутствующих. На основании полученных результатов были сформулированы представления о различных молекулярных механизмах рецепции запахов, имеющих биологическое значение для данного вида животных, и пахучих соединений неспецифической природы. Существование специфического механизма рецепции было продемонстрировано на млекопитающих с помощью целого ряда экспериментальных моделей. Фундаментальное значение для понимания этого механизма имеет обнаруженный факт тесной взаимосвязи рецепции запахов, участвующих в хемокоммуникативных связях, с уровнем репродуктивных гормонов в организме данного вида животных. Полученные результаты позволяют внедрить новую методологию экспериментальных подходов к моделированию молекулярных механизмов обонятельной рецепции.
Полученные доказательства нерецепторного транспорта целого ряда
веществ в ЦНС в обход ГЭБ были использованы совместно с ООО «Юпитер» в
ходе разработок прикладного характера для создания лекарственных форм с
интраназальной системой доставки. Эти результаты могут быть такжеиспользованы для решения прикладных задач по разработке систем доставки антинаркотических препаратов, а так же для лекарств нейропептидной природы, модулирующих различные функции ЦНС. В качестве системы доставки таких препаратов было предложено использование липосом из фосфолипидов обонятельного эпителия, что значительно повышало скорость
начального этапа транспорта различных лекарствегных соединений. Совместно с НПО «Биофармавтоматика» были разработаны оптимальные условия получения фосфолипидов и технический регламент получения липосом.
Результаты проведенных исследований были включены в Всесоюзную программу «Феромоны» (1980), а так же использованы при выполнении научно-исследовательских работ по постановлению директивных органов правительства (ГКНТ и ВПК СССР),
Похожие диссертации на Рецепция запахов и молекулярно-структурная организация поверхности обонятельного эпителия позвоночных
