Введение к работе
Прогресс, достигнутый в последние десятилетия в изучении строения веществ на молекулярном и атомном уровнях, во многом связан с развитием методов лазерной спектроскопии. Одной из тенденций в развитии современной лазерной физики является изучение закономерностей взаимодействия лазерного излучения с молекулярными системами различного уровня организации. На этой основе разрабатываются новые методы контроля и модификации материалов, способы диагностики и лечения различных заболеваний, широко исследуются молекулярная организация и механизмы функционирования биологически активных систем. К числу наиболее информативных методов исследования молекулярной структуры и межмолекулярных взаимодействий относится метод комбинационного рассеяния (КР) света, который, однако, в своем традиционном виде имеет низкую чувствительность.
Совершенно новые уникальные возможности этого метода появились после открытия в 1978 году явления гигантского или поверхностно усиленного КР. Оказалось, что при адсорбции на специфических шероховатых поверхностях металлов (Ag, Си, Аи, Pt) эффективное сечение- КР молекул может увеличиться на 5-7 порядков. Бурное развитие данного метода в последние годы позволило достичь рекордной чувствительности (до 10 "18 моля вещества) и существенно расширить круг решаемых задач. В частности, исследование спектров гигантского КР (ГКР) органических молекул, адсорбированных на специфических шероховатых поверхностях металлов, позволяет решать не только задачи, связанные с их строением, но и с взаимодействием молекул с поверхностью металла и физхимии самой поверхности. .
Наиболее важной и интенсивно развиваемой в последнее время областью применения метода ГКР являются науки биомедицинского профиля. Развитие данного метода применительно к исследованию сложных биоорганических молекул и надмолекулярных комплексов позволило уже сегодня решить многие вопросы структуры ряда белковых молекул, локализации хромофоров в них и в клетке.
Вместе с тем, в настоящее время существует целый комплекс нерешенных проблем, связанных как с физикой самого явления ГКР, так и со спецификой его применения для решения различных прикладных задач. Прежде всего необходимо отметить, что на сегодняшний день, не существует единого взгляда на природу явления' ГКР. Развитие данного метода идет по пути накопления базы данных о
спектрах ГКР различных классов органических молекул и выработке подходов к их интерпретации. В связи с этим исследование методом ГКР спектроскопии систем с различным уровнем организации от простых молекул до сложных биомолекулярных имеет важное значение для развития как самого метода, так и создания единой теории явления ГКР.
Актуальность темы диссертации.
В настоящее время сложились два подхода к объяснению явления ГКР: один исходит из локального, увеличения напряженности электрического поля возбуждающей волны благодаря шероховатости поверхности, с которой взаимодействует исследуемая молекула; второй базируется на изменении поляризуемости молекул при адсорбции. Однако ни одна из существующих моделей не позволяет даже качественно объяснить все особенности спектров ГКР.
К настоящему времени выполнено большое число исследований, посвященных изучению закономерностей формирования спектров ГКР как простых органических молекул, так и сложных молекулярных ансамблей. Известно, что усиление ГКР определяется структурой поверхности и спектром поверхностных плазмонов, характером, взаимодействия молекул с поверхностью. Однозначно установлено, что в спектрах ГКР проявляется геометрия адсорбции молекул. Показана важная роль гетероатомов и электроно-донорных заместителей в молекулах и анионов электролита в создании определенной геометрии адсорбции. Показано, что спектры ГКР зависят от потенциала поверхности; определены основные причины этой зависимости.
Вместе с тем, остается не рассмотренным ряд вопросов, связанных с особенностями усиления ГКР молекул, адсорбированных на различного типа ГКР-активных поверхностях. Очень мало экспериментальных работ, в которых в комплексе исследуются структура и оптические свойства поверхности металла и спектры ГКР адсорбированных молекул различного типа. Поэтому результаты спектральных измерений одних и тех же молекулярных систем, полученных различными авторами и в различных экспериментальных условиях, зачастую противоречивы и их трудно обобщить. Не установлены спектральные критерии проявления определенной геометрии адсорбции молекул, содержащих различного типа адсорбционные центры. Мало известно о спектральных 'Проявлениях
специфических межмолекулярных взаимодействий в адсорбционном слое.
При изучении физических механизмов гигантского КР, как правило, не затрагиваются другие виды вторичного излучения, в частности люминесценция. Вместе с тем, изучение такого явления как люминесценция имеет самостоятельную научную и практическую ценность для фотофизики адсорбированных молекулярных систем.
Среди многочисленных исследований прикладного характера с использованием метода ГКР по количеству публикаций явно превалируют работы биологического плана. В настоящее время данный метод эффективно используется при исследовании самых сложных биомолекулярных комплексов и живых клеток. Однако при решении задач биомолекулярной структуры самой серьезной и неразрешенной проблемой является вопрос о нативности молекул. Сложность здесь заключается в том, что на практике не удается осуществить независимый контроль нативности молекул в тех же экспериментальных условиях, в которых регистрируются спектры. Поэтому вопрос о взаимосвязи спектров ГКР со структурно-функциональным состоянием биомолекул в адсорбционном слое является злободневным.
Целью данной работы было исследование механизмов усиления ГКР света адсорбированных молекул поверхностью тонких пленок серебра и серебряных электродов, а также особенностей проявления в спектрах ГКР и люминесценции структурной организации находящихся в адсорбционном слое молекулярных систем (от простых органических молекул до сложных биомолекулярных . комплексов).
Достижение указанной цели предполагало решение следующих задач:
-
Модернизация существующих и разработка новых способов получения ГКР-активных шероховатых поверхностей серебра.
-
Экспериментальное исследование спектров ГКР широкого класса органических молекул различного химического строения и с различными оптическими характеристиками, адсорбированных на различного типа поверхностях.
-
Изучение зависимости коэффициента усиления ГКР от длины волны возбуждения и от расстояния между молекулами и поверхностью с различной шероховатостью и выявление таким образом основных закономерностей усиления.
-
Исследование влияния специфических межмолекулярных взаимодействий в приповерхностном слое на спектры ГКР и ГРКР органических молекулярных комплексов.
-
На основе отнесения полос спектров ГКР производных тиамина построение моделей структуры комплекса молекула-металл при различных потенциалах поверхности.
-
Исследование характера изменений спектрально-кинетических характеристик флуоресценции ряда хромофоров при их адсорбации на специфических поверхностях серебра и оценка возможности использования усиленной поверхностью флуоресценции для исследования адсорбированных монослоев биомолекул.
-
Получение и интерпретация спектров ГКР адсорбированных пируватдекарбоксилазы, алкогольоксидазы и различных форм гемоглобина и выявление спектральных критериев оценки их функционального состояния.
Связь работы с крупными научными программами, темами.
Исследования по теме были начаты в 1978 году в Гродненском госуниверситете им. Я.Купалы на кафедре общей и теоретической физики, где и были получены основные результаты. Работа выполнялась в соответствии с планами важнейших исследований РБ по программе "Спектроскопия", заданиями Министерства образованя и науки РБ и в рамках международного проекта "Новейшие спектроскопические подходы к изучению биомолекулярной структуры на молекулярном и клеточном уровнях", выполняемого совместно с Институтом биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (Россия), Йоркским университетом (Англия), Реймским университетом (Франция), Институтом химфизики Макса Планка в Мюльхейме (Германия) и Сельскохозяйственным институтом в Афинах (Греция) и поддерживаемого ассоциацией INTAS (грант № 93-1829).
Научная новизна работы заключается в том, что в ней
впервые:
1. Исследованы механизмы усиления ГКР и ГРКР для широкого класса ароматических и гетероциклических молекул с поверхностно-активными и неактивными заместителями, адсорбированных на различного типа шероховатых поверхностях серебра. На основании полученных результатов сформулирован единый подход к объяснению
причин различия спектров поверхностно усиленного и обычного КР или РКР, который основан на взаимодействии коллективных электронных резонансов поверхности с тс-электронами молекул и влиянии внутримолекулярных колебаний на эффективность этих взаимодействий.
-
Путем высокотемпературного отжига получены ГКР-активные серебряные островковые пленки с близким к синусоидальному профилем и благодаря этому имеющие в фиолетовой области полосу плазмонного возбуждения с полушириной около 90 нм; они обладают и обладающие существенно большим дальнодействием усиления ГКР. Показаны преимущества данных пленок перед традиционно используемыми для получения спектров ГКР положительно заряженных и незаряженных органических молекул, а также при работе с такими растворителями как ацетонитрил и спирты.
-
Обнаружена активация ГКР молекулярных систем, адсорбированных на островковых пленках, неорганическими и органическими анионами. Показано, что это явление связано с усилением специфического взаимодействия молекул с поверхностью. Обнаружено, что в случае осаждения на серебряные островковые пленки молекул спиропиранов из растворов, специфические взаимодействия с молекулами растворителя и поверхностью приводят к раскрытию пиранового кольца.
-
Методом ГКР впервые исследованы структурно-конформационные состояния производных тиамина, а также специфические взаимодействия гемина с имидазалом, производных тиамина с пируватом, ионами двухвалентных металлов и аминокислотами в адсорбированном состоянии. Показано, что структура образующихся при этом комплексов зависит от потенциала поверхности.
-
Обнаружено, что функциональное состояние тиаминкиназы, алкогольоксидазы, пируватдекарбоксилазы и гемоглобина (в эритроцитарных клетках) имеет четкие проявления в характеристиках ГКР. Установлено, что адсорбированная на ГКР-активных субстратах белковая система при определенных условиях сохраняет ферментативную активность.
-
На примере связанного с сывороточным альбумином человека зонда 2-п-толуидиннафталинсульфоната показано, что в случае адсорбции белков на ГКР-активных поверхностях можно добиться усиления флуоресценции поверхностью.
Практическая значимость полученных результатов.
Выявленные спектральные особенности проявления
электромагнитных и химических механизмов усиления ГКР для различных классов (ароматические и гетероциклические) органических молекул могут быть основой для интерпретации спектров ГКР такого типа молекул, адсорбированных на различного типа поверхностях.
Созданные новые ГКР-активные субстраты с большим дальнодействием усиления в виде отожженных островковых пленок серебра могут быть широко использованы для анализа структуры органических молекул в адсорбированном состоянии, а также различных пигментов в составе белков и биомембран, находящихся вдали от их поверхности. Они уже сегодня используются для этих целей в Реймском университете (Франция) и Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина РАН (Москва).
Предложенная методика получения спектров ГКР сложных молекулярных комплексов,, а также их интерпретация могут быть использованы для изучения различных молекулярных систем в адсорбированном состоянии.
Выводы о конформационном состоянии адсорбированных молекул,
о существовании специфического взаимодействия между тиамином и
пируватом в приповерхностном слое, а также о влиянии ионов
двухвалентных металлов и гистидина на структурно-конформационное
состояние адсорбированного тиамина могут быть использованы для
моделирования микроокружения активных центров
пируватдегидрогеназного ферментативного комплекса. Кроме того,
установление специфичности вышеупомянутых взаимодействий может
быть принято за основу при разработке конкретных путей
иммобилизации ферментных комплексов на базе
пируватдекарбоксилазы.
Подобранные условия адсорбции на шероховатой поверхности серебра, при которых сохраняется активность алкогольоксидазы, могут быть использованы, во-первых, для разработки и создания биосенсоров с ГКР-регистрацией, и, во-вторых, в соответствующих областях биотехнологии для создания систем на основе иммобилизованного фермента.
Обнаруженные эффекты усиления шероховатой поверхностью серебра флуоресценции некоторых хромофоров, связанных с белками, свидетельствуют о перспективности использования таких поверхностей в иммуноферментном флуоресцентном анализе и возможности создания
нового информативного метода для детектирования структуры и динамики биомолекулярных слоев.
Экономическая значимость.
Реализация предложенных в диссертации путей практического использования результатов исследований позволит создать ряд простых высокочувствительных аналитических методик для биохимии и медицины, способных упростить или заменить дорогостоящие биохимические методики. Устаноаяенные в работе факты отщепления витаминов от природных белков при электрохимических процессах указывают на возможный путь получения витаминов из отходов биотехнологического производства.
Защищаемые положения
-
Вывод о вкладах и спектральных проявлениях электромагнитных и химических механизмов усиления ГКР для ряда ароматических и гетероциклических молекул, адсорбированных на серебряных островковых пленках и анодированных электродах, основанный на функциональной взаимосвязи между спектрами ГКР и микроструктурой поверхности.
-
Обоснование спектральных особенностей ГКР и ГРКР сложных органических молекул с точки зрения влияния внутримолекулярных колебаний на эффективность взаимодействия локализованных поверхностных плазмонов с х-электронами молекул.
-
Заключение о спектральных критериях оценки структурно-конформационных состояний производных тиамина и ФАД, а также тиамин-, флавин- и гемсосодержащих молекулярных ансамблей и рекомендации к их практическому использованию в аналитических целях; вывод об индуцировании ГКР-активной поверхностью комплексообразования тиамина с пируватом и гистидином.
4.Спектральные особенности флуоресценции зонда 2-п-толуидиннафталинсульфоната, связанного с альбумином, и 1,3,5-трифенилпиразолина, адсорбированных на серебряных островковых пленках, проявляющиеся в результате электромагнитного усиления свечения поверхностью.
5. Способ получения новых ГКР-активных субстратов путем высокотемпературного отжига тонких серебряных пленок, увеличивающего дальнодействие усиления ГКР и селективность в детектировании положительно заряженных органических молекул.
Апробация работы.
Результаты диссертации дакладывагись: на XX Всесоюзном съезде по молекулярной спектроскопии (Киев, 1988); XII Всесоюзном совещании "Применение колебательных спектров к исследованию неорганических и координационных соединений" (Минск, 1989); VII конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1991); XXI, XXII и XXIII Международной конференции по Раман спектроскопии соответственно в Колумбии . (США, 1990), Вюрцбург (Германия, 1992) и Гонг Конге, (1994); XII, XVII и XVIII Европейском конгрессе по молекулярной спектроскопии соответственно в Загребе (Югославия, 1991), Вене (Австрия, 1992) и Эссене (Германия, 1994); Питтсбургской международной конференции по аналитической химии и прикладной спектроскопии в Атланте (США, 1993) и Чикаго (США, 1994); V, VII и VIII Международной конференции по спектроскопии биомолекул соответственно в Иорке (Англия,. 1991), Лаутраки (Греция, 1993) и Лилле (Франция, 1995); III и IV Международной конференции по лазерам в науках о жизни в Юваскула (Финляндия, 1992) и Минске (1994); I и И Международной конференции по лазерной физике и спектроскопии (Гродно, 1993 и 1995); 1-ом съезде белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Минск, 1994); Международной конференции по когерентной и нелинейной оптике (С.-Петербург, 1995).
Опубликованность результатов.
Основные результаты работы опубликованы в 33 статьях в журналах, 10 статьях в сборниках материалов международных конференций и 22 тезисах докладов конференций и совещаний.
Личный вклад автора.
В диссертации изложены результаты работ, выполненных автором лично и под его руководством вместе с учениками Н.Д. Стрекаль и Г.Т. Василюком, В.Г. Заневским. Профессор Л.Н. Кивач, являясь научным консультантом, оказывал помощь в постановке научных задач. Доценты Г.А. Гачко и А.А. Маскевич, а также ведущий научный сотрудник С.Г. Подтынченко оказывали помощь в проведении экспериментов, обработке и обсуждении полученных результатов. Ведущий научный сотрудник И.П. Черникевич, ведущий научный сотрудник Д.А. Опарин и старший научные сотрудники И.М. Арцукевич и И.Б. Заводник -сотрудники Института биохимии АН РБ готовили препараты для исследования и проводили цикл биохимических исследований,
относящихся к изучаемым объектам. Сотрудники Института
биоорганической химии РАН И.Р. Набиев, К.В. Соколов и ГТ.В.
Ходорченко оказывали помощь в освоении методики ГКР, обсуждении
результатов и проводили ряд контрольных измерений. Ведущий
научный сотрудник Отдела ресурсосбережения АН РБ И.Ф. Свекло
оказал помощь в получении изображений поверхности серебра с
помощью атомно-силовой микроскопии. Вклад автора диссертации в
указанные выше публикации заключался в определении направления и
постановке конкретных задач исследования, в разработке методик
исследования и выборе объектов, непосредственном участии в
выполнении измерений, анализе и обобщении полученных
результатов.
Структура и объем работы.
Диссертация состоит из введения, б глав, выводов и списка цитируемой литературы. Полный объем работы составляет 270 страниц, включая 96 рисунков, 13 таблиц и 282 наименования цитируемой литературы.
