Введение к работе
Актуальность работы
Механоэлектрическая обратная связь (MEF) в сердце является причиной возникновения механоиндуцированных аритмий, нередко заканчивающихся фибрилляцией. Ключевую роль в развитии этого явления играют механоуправляемые ионные каналы (MGCs), активирующиеся растяжением клеток сердца (Kamkin et al, 2000; Kamkin et al, 2003). Среди известных соединений, прямо или опосредованно влияющих на сердце, известны некоторые цитокины. Для направления исследований цитокинов применительно к сердцу Л.В. Ковальчук и О.П. Шевченко (2010) ввели термин «кардиоиммунология». Среди цитокинов фактор некроза опухолей (TNF-a) представляет интерес по многим причинам. Главное биологическое действие TNF-a заключается в том, что он является одним из наиболее значимых провоспалительных цитокинов (см. например, Simbirtsev and Kozlov, 2011/2012). Кроме того, TNF-a представляет значительный интерес, поскольку в культуре ткани кардиомиоцитов показано увеличение его продукции при длительном цикличном растяжении клеток (см. например, Kovalchuk at al., 2011/2012), однако сам эффект TNF-a на электро-физиологические свойства кардиомиоцитов практически не исследован. Существуют лишь 2-3 работы, в которых частично затрагивается этот вопрос. Что же касается роли TNF-a в регуляции MEF, то этот вопрос вообще не изучен. Обсуждается, что некоторые цитокины могут оказывать влияние через оксид азота (NO). Недавние исследования, проведенные под руководством профессора А.Г.Камкина показали, что NO - низкомолекулярное эндогенное соединение, обладающее широким спектром физиологических эффектов - может модулировать работу MGCs клеток сердца (Казанский и соавторы, 2010; Kazanski et al., 2011). Так, в исследованиях на изолированных кардиомиоцитах показано, что доноры NO активируют MGCs недеформированных клеток, в то время как у растянутых клеток с активированными MGCs, доноры NO, напротив, вызывают их инактивацию. Связывание эндогенного NO приводит к полному ингибированию токов через MGCs. Было показано, что NO-синтаза 3 типа наиболее важна, как источник NO в реализации ответа кардиомиоцитов на растяжение. Вместе с тем,
несмотря на выраженные эффекты, полученные методом patch-clamp на изолированных клетках, отсутствуют данные о влиянии N0 на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов на тканевом уровне и участии N0 в реализации MEF в сердце с позиций возникновения механоиндуцированных аритмий. Также нет данных о влиянии TNF-a на MGCs. Поскольку в организме продукция NO активируется целым рядом эндогенных регуляторов, профессором А.Г.Камкиным было сделано предположение, что представители цитокинов, например TNF-a, могут осуществлять регуляцию работы MGCs, предположительно через цепи продукции N0, и, следовательно, могут быть природными регуляторами MEF в сердце, т.е. вызывать или ингибировать аритмии. Исследованию этого вопроса посвящена представленная работа.
Цель настоящей работы - изучение роли TNF-a в регуляции механоэлектрической обратной связи в правом предсердии крыс.
Задачи исследования
-
Физиололгическое моделирование пикообразной механоиндуциро-ванной деполяризации, которая возникает на фоне фазы реполяризации потенциала действия (hump-like stretch-induced depolarization - hump-like SID) у кардиомиоцитов предсердия крыс в ответ на его дозированное растяжение.
-
Изучение возникновения TNF-a-зависимой пикообразной деполяризации у кардиомиоцитов предсердия крыс в условиях его стандартного предрастяжения и доказательство того, что этот феномен является аналогом пикообразной механо-индуцированной деполяризации.
-
Изучение влияния растяжения предсердия крыс на TNF-a-зависимую пикообразную деполяризацию кардиомиоцитов.
-
Изучение роли NO в механизме возникновения TNF-a-зависимой пикообразной деполяризации кардиомиоцитов
5. Исследование влияния донора NO SNAP на биоэлектрическую
активность кардиомиоцитов предсердия крыс и доказательство, что
пикообразная деполяризация при генерации потенциалов действия, вызванная
SNAP, является аналогом пикообразной механоиндуцированной
деполяризацией и определяется работой MGCs.
-
Исследование зависимости активации MGCs от концентрации N0 при дискретном увеличении концентрации SNAP.
-
Исследование зависимости активации MGCs от концентрации N0 при активации NO-синтаз посредством растяжения правого предсердия крыс.
-
Исследование влияния SNAP на MGCs и MG-токи у нерастянутых и растянутых изолированных кардиомиоцитов.
9. Изучение влияния SNAP на вызванную TNF-a-зависимую
пикообразную деполяризацию кардиомиоцитов.
10. Изучение влияния TNF-a на биоэлектрическую активность
кардиомиоцитов предсердия крыс на фоне неселективного блокатора NO-синтаз
L-NAME в условиях предрастяжения и дискретного растяжения ткани.
Научная новизна
Впервые в мире на препаратах правого предсердия крыс с использованием микроэлектродной техники и техники patch-clamp в конфигурации whole-cell было показано следующее. TNF-a осуществляет эффективную модуляцию MEF в сердце, вызывает hump-like деполяризацию на уровне APD50 и APD90, которая может переходить в устойчивые аритмии, если hump-like деполяризация достигает Ес. Комплекс экспериментов показывает, что механизм, лежащий в основе подобного влияния TNF-a, может заключаться в том, что TNF-a активирует NO-синтазы, например, NOS3, в результате чего увеличивается внутриклеточная концентрация N0, что приводит к активации MGCs, а это вызывает появление hump-like деполяризации на уровне APD90, которая, достигая порога, вызывает генерацию экстра-потенциалов действия. Дальнейшее увеличение внутриклеточной концентрации N0 является ингибирующим фактором для MGCs и устраняет hump-like деполяризацию.
Положения, выносимые на защиту
(1) Растяжение ткани предсердия вызывает у кардиомиоцитов hump-like деполяризацию на уровне APD90 или на уровне APD50 фазы реполяризации потенциала действия. Если hump-like деполяризация на уровне APD90 достигает Ес, генерируются экстра-потенциалы действия. Эта hump-like деполяризация, вызванная растяжением, определяется работой MGCs поскольку ингибируется
40 мкМ/л Gd3+ и, следовательно является stretch induced деполяризацией (SID), или hump-like SID.
-
В условиях стандартного предрастяжения (1 мН) фрагмента правого предсердия крыс 50 нг/мл TNF-a через 20 мин вызывает hump-like деполяризацию на уровне APD50 и APD90, а через 25 минут устойчивые аритмии, если hump-like деполяризация достигает Ес. Hump-like деполяризация, вызванная TNF-a, является аналогом SID и определяется работой MGCs, поскольку 40 мкМ/л Gd3+ee ингибирует.
-
Дискретное растяжение ткани устраняет вызванную 50 нг/мл TNF-a hump-like деполяризацию на уровне APD90 или на уровне APD50 и в том числе аритмии, возникающие у кардиомиоцитов.
-
Эффект 50 нг/мл TNF-a реализуется через цепь NO, поскольку донор NO - SNAP в концентрации ЗхЮ"4 М/л вызывает формирование hump-like деполяризации и аритмий, аналогичных тем, которые вызывал TNF-a. Humplike деполяризация, вызванная SNAP, является аналогом SID и определяется работой MGCs, поскольку Gd3+ в концентрации 40 мкМ/л ингибировал вызванные SNAP изменения.
-
Hump-like деполяризация, вызванная повышением концентрации NO посредством введения ЗхЮ"4 М/л SNAP, устраняется дополнительным повышением концентрации NO, вызванным вторичным введением 3x10" М/л SNAP. Hump-like деполяризация, вызванная повышением концентрации NO посредством введения ЗхЮ"4 М/л SNAP, устраняется также дополнительным повышением концентрации NO, вызванным растяжением ткани, которое активирует NOS.
-
SNAP в концентрации 100 мкМ/л активирует MGCs без растяжения изолированных клеток и ингибирует, активированные растяжением MGCs у растянутых изолированных клеток.
-
50 нг/мл TNF-a активирует MGCs, вызывая hump-like деполяризацию на уровне APD50 и APD90, а последующее добавление ЗхЮ"4 М/л SNAP устраняет эффект.
-
Неселективный блокатор NO-синтаз L-NAME в концентрации 10"4 М/л ингибирует hump-like деполяризации на уровне APD50 и APD90, вызванные
введением 50 нг/мл TNF-a.
(9) Механизм, лежащий в основе влияния TNF-a, может заключаться в том, что TNF-a активирует NO-синтазы, например, NOS3, в результате чего увеличивается внутриклеточная концентрация NO, что приводит к активации MGCs, а это вызывает появление hump-like деполяризации на уровне APD90, которая, достигая порога, вызывает генерацию экстра-потенциалов действия. Дальнейшее увеличение внутриклеточной концентрации N0 является ингибирующим фактором для MGCs и устраняет hump-like деполяризацию.
Практическая значимость результатов
Исследования представляют собой существенную основу для поиска методов ранней доклинической диагностики механоиндуцированных аритмий и фибрилляции и могут быть направлением разработки принципиально новых фармакологических препаратов с целью лечения этих.
Внедрение результатов исследований
Результаты диссертационного внедрены в учебный процесс и научно-исследовательскую работу на кафедры фундаментальной и прикладной физиологии МБФ, на кафедре фармакологии и лаборатории электрофизиологии ГБОУ ВПО РНИМУ имени Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития РФ.
Апробация работы
Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены па XVIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов 2011" (Москва, МГУ им. Ломоносова, 11-15 апреля 2011 года).
Диссертация апробирована на объединенной научной конференции кафедры фундаментальной и прикладной физиологии МБФ и лаборатории электрофизиологии ГБОУ ВПО РНИМУ имени Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития РФ 20 июня 2011 года.
Публикации по теме диссертации
По теме опубликовано 5 научных работ и одна находится в печати.
Структура и объем диссертации
