Содержание к диссертации
Введение. Общая характеристика работы 5
Глава 1. Обонятельная система животных основных филогенетических групп. 10
Обзор литературы. 10
1.1. Происхождение билатерального мозга 11
1.2. Metazoa 17
1.2.2. Хеморецепция кишечнополостных. 17
1.2.3. Хеморецепция гребневиков. 18
1.3. Lophotorochozoa. 19
1.3.1. Хеморецепция плоских червей. 19
1.3.2. Хеморецепция аннелид. 20
1.3.3. Обонятельная система моллюсков. 21
1.3.3.1 Осфрадий. 27
" 1.3.3.2. Апикальный сенсорный орган. 29
1.3.3.3. Трансдукция химического сигнала метаморфоза у личинок моллюсков и балянуса. 30
1.4. Ecdysozoa. 32
1.4Л. Обонятельная система нематод. 32
1.4.1.1. Роль химически сигналов в жизненном пространстве немадоды. 3 6
1.4.2. Обонятельная система насекомых. 37
1.4.3. Обонятельная система десятиногих раков. 42
1.5. Chordata 44
1.5.1. Ланцетник. Примордиум обонятельной системы. 44
1.5.2. Разделение обонятельной системы у тетрапод. 47
1.5.2.1. Вомероназальная система. 47
1.5.2.2. Септальный орган. 50
1.5.2.3. Основной обонятельный орган. 52
1.5.3. Структурные элементы хемосенсорного пути в обонятельном эпителии и обонятельной луковице у рыб. 52
1.5.4. Молекулярные компоненты трансдукции обонятельного сигнала. 55
1.5.4.1. Одорант связывающие белки. 55
1.5.4.2. Рецепторные белки. .57
1.5.4.2.1. Рецепторы одорантов. 57
1.5.4.2.3. Рецепторы вомероназального органа. 59
1.5.4.2.4. Гуанилат циклаза D - возможный рецептор феромонов. 61
1.5.4.2 Глава 2.
,5. G-белки. 62
Материал и методы исследования. 66
Электрофизиологические исследования 66
Спектрофотометрическое определение ферментативной активности. 67
Подготовка ткани к гисто- и цитохимическим исследованиям. 68
Гистохимическое определение ферментативной активности. 69
Гистохимическое определение АХЭ и БХЭ. 69
Гистохимическое определение НАДФН диафоразы. 69
Цитохимическое определение АХЭ, ХАТФ и НАДФН диафоразы. 70
Определение транспорта ионов хлора с помощью 3бС1. 70
Определение натрия, калия и ионов хлора. 70
Препаративные методы: дифференциальное центрифугирование и ультрафильтрация через миллипоровые фильтры. 71
Определение скорости синтеза АХЭ экспериментальные данные 73
Защита обонятельного эпителия рыб от неблагоприятных факторов внешней среды 73
Обзор литературы 73
Роль опорных клеток 76
Роль секреторных клеток 80
Ионные механизмы трансдукции обонятельного сигнала у рыб. 86
Ионный состав слизи обонятельного эпителия амфибий и млекопитающих. 86
Обзор литературы. 86
Ионный состав слизи обонятельного эпителия пресноводных рыб. 92
Глава 5.Ионные механизмы трансдукции желчно- и аминокислотного обонятельного сигнала у рыб.
Принципиальная схема обонятельной трансдукции с участием цАМФ и ИЗФ.
Роль аминокислот и желчных кислот в коммуникации рыб. Хлор-зависимые процессы в рецепторном отделе обонятельного эпителия Роль вторичных мессенджеров в восприятии минокислотного обонятельного сигнала
5.4. Восприятие амино- и желчных кислот карпом при аклимации к низкокальциевой среде 111
5.5. Локализация ферментов обмена ацетилхолина и оксида азота в обонятельном эпителии 113
5.5.1 Локализация АХЭ в обонятельной выстилке карпа 113
5.5.2. НАДФН диафораза в обонятельной выстилке карпа. 119
Глава 6. Холинергическая организация афферентного входа в обонятельную луковицу рыб 122
6.1. Влияние холинергических веществ на электрическую активность обонятельной луковицы рыб. 122
6.2. Локализация ацетилхолинэстеразы в обонятельной луковице карпа 127
6.3. Локализация НАДФН диафоразы в обонятельной луковице карпа 127
6.4. Ультраструктурная локализация холинергических ферментов в клубочковом слое обонятельной луковицы рыб 132
6.4.1. Синаптическия организация клубочкового нейропиля обонятельной луковицы рыб 132
6.4.2. Ультраструктурная локализация ацетилхолинэстеразы в клубочках и в нейронах обонятельной луковицы карпа 135
6.4.3. Ультраструктурная локализация холинацетилтрансферазы в клубочковом слое обонятельной луковицы карпа 138
6.5. Роль эндогенного ацетилхолина и ацетилхолинэстеразы обонятельной луковицы в сенсорных процессах 143
6.6. Локализация АХЭ и БХЭ в обонятельной луковице осетра. 146
Заключение 152
Выводы 155
Список цитированной литературы 157
Введение к работе
Актуальность проблемы. Обонятельная система (ОС) формировалась как сигнальная система. В отличие от других сенсорных сигнальных систем (зрительной, акустической), перед ней стояла труднейшая задача: воспринять множество значительно различающихся по химической структуре веществ, выделить из них определенную группу в виде обонятельного образа, запомнить и в дальнейшем узнавать его, какое бы ни было химическое окружение. Для решения столь сложной задачи в геноме млекопитающих отведено только на кодирование обонятельных рецепторньгх (ОР) белков 3% генов (одна тридцатая генома!), что сравнимо только с иммунной системой (Mombaerts, 1999а,б, 2001). Сложнейшая задача восприятия и расшифровки мира запахов обусловила консервативность стратегии построения ОС в филогенезе животных (Ache, 1994; Krieger, Breer, 1999).
Принцип организации ОС у животных филогенетически далеких таксонов (моллюски, насекомые, десятиногие раки и позвоночные) одинаков. Столь удивительная общая морфологическая схожесть ОС, не гомологичной по происхождению, у этих животных определяется, во-первых, каскадом генов раннего развития и транскрипции — Нох, Dlx и Pax, которые у них гомологичные (Franco et al., 2001; Ledje et al., 2002; Long et al., 2003), и, во-вторых, - конвергентной адаптацией (Eisthen, 2002). Построение ОС у животных различных phyla подобное, но не идентичное. Различия наблюдаются как на молекулярном, так и на морфологическом уровне. К настоящему времени накоплено много примеров, показывающих, что у очень далеких таксонов молекулярное обеспечение и морфологическое построение ОС близко, а у филогенетически родственных несколько отличается (Krieger, Breer, 1999; Zufall et al., 2000; Scott et al., 2001; Sullivan, Beltz, 2001; Eisthen, 2002).
Среди позвоночных животных большой интерес представляют костистые рыбы вследствие их филогенетического положения и адаптивных возможностей. Это самая большая группа позвоночных, включающая приблизительно 24 000 видов и составляющая больше, чем 99 % Actinopterygii, лучеперых рыб (Taylor, 2001; Christoffels, 2004).
Несмотря на большое сходство у позвоночных двух филогенетических линий, Actinopterygii и Sarcopterygii, построение ОС несколько различается анатомически, морфологически и, по-видимому, нейрохимически, что связано с задачами системы и средой обитания. ОС Sarcopterygii, особенно у млекопитающих, изучена более подробно, чем первой группы. Прогресс ОС в обеих группах в первую очередь связан с увеличением количества генов рецепторньгх белков. Это привело к усложнению морфологической организации обонятельной луковицы (ОЛ). Хотя слоистость ОЛ у костистых рыб выражена менее ярко, чем у млекопитающих, синаптическая организация клубочкового нейропиля не уступает им (Satou, 1990). Однако нейрохимическая организация ОЛ рыб только начинает исследоваться (Edwards, Michel, 2002, 2003), а отдельные работы по исследованию распределения холинергических ферментов ОЛ рыб показывают, что холинергическая система в ОЛ рыб может существенно отличаться от амфибий и млекопитающих. Ионные и молекулярные механизмы трансдукции у рыб также менее изучены (Kaneko et al., 2001).
Из-за недостаточной изученности ОС костистых рыб не возможно делать выводы о причинах (адаптация к условиям среды, анцестральные признаки или положение животного в эволюционном ряду) различий в морфологической и молекулярной организации ОС Actinopterygii и Sarcopterygii.
В связи с этим исследования по таким проблемам, как нейрохимическая организация ОЛ, первичные механизмы трансдукции обонятельного сигнала, гомеостаз ионного окружения апикальной части обонятельных рецепторных нейронов и защита её от неблагоприятных эндогенных и экзогенных факторов у костистых рыб, являются актуальным направлением в сенсорной и эволюционной физиологии.
Цель работы: установить особенности структурно-функциональной организации обонятельной выстилки и луковицы костистых рыб и выяснить обуславливающие их причины.
Для достижения цели решались следующие_задачи:
1. На гисто- и цитологических уровнях исследовать морфологию и сенсорные функции обонятельного эпителия при воздействии низких значений рН и сублетальной концентрации ксенобитика, 0,0-диметил-0-(2,2-дихлорвинил) фосфата (ДДВФ).
2. Установить концентрацию основных ионов (Na+, К+, С1-) в слизи на поверхности обонятельной выстилки, выяснить механизм, создающий ионный гомеостаз в слизи и установить участвующие в этом процессе структуры.
3. Установить роль ионов натрия, калия и хлора в генерации рецепторного потенциала.
4. Провести исследование влияния холинергических и NO-ергических веществ на рецепторный потенциал (ЭОГ) у интактных рыб и адаптированных к следовым. концентрациям кальция.
5. Провести биохимическое, гистохимическое и итохимическое исследование распределения ацетилхолинэстеразы (ацетилхолин ацетилгидролаза, АХЭ; К.Ф. 3.1.1.8) и холинацетилрансферазы (ацетил-КоА: холин-О-ацетилтрансфераза, ХАТФ; К.Ф. 2.3.1.6) в обонятельной луковице у рыб из различных систематических групп и выяснить роль эндогенного ацетилхолина обонятельной луковицы в процессах восприятия запаха.
6. Сопоставить полученные результаты с имеющимися в литературе данными по затронутой проблеме на других филогенетических группах животных и установить, какие особенности организации ОС костистых рыб обусловлены конвергентной адаптацией, а какие - анцестральными признаками.
Научная новизна. В работе впервые рассмотрена холинергическая нейрохимическая организация ОС рыб. Впервые установлено, что удельная активность АХЭ в ОС рыб зависит от обонятельной способности как вида, так и особи. Показано, что распределение АХЭ в ОЛ асимметрично: в медиальной части этого фермента больше, чем в латеральной. В этих же частях луковицы АХЭ потенциируется одорантами различных классов. Впервые установлена зависимость удельной активности АХЭ обонятельной луковицы рыб от состояния афферентного входа. Впервые выявлено, что в ОЛ рыб имеются АХЭ-позитивные митральные клетки и веретеновидные клетки. Активность фермента в них зависит от афферентного входа. Внутриклеточная ультраструктурная локализация АХЭ свидетельствует, что эти клетки могут синтезировать ацетилхолин. Впервые показано, что в некоторых асимметричных синапсах АХЭ локализуется на пре- и постсинаптических мембранах. Исходя из их морфологии и расположения в ОЛ, можно предположить, что они относятся к аксо-дендритным синапсам между рецепторными аксонами и дендритом митральной клетки, а также к денро-дендритными между интернейроном и релейным нейроном. Впервые установлено, что в ОЛ рыб содержатся ХАТФ-позитивные нейроны и синапсы. Впервые показано, что в О Л рыб имеются Ml и М2 холинорецепторы (ХР). Функциональная активность подтипа М1-ХР проявляется только при запоминании запаха (долговременная посттетаническая потенциация после тетанизации обонятельного нерва), в то время как М2-ХР осуществляют модулирующее влияние на релейные нейроны, участвуя, скорее всего, в первичной обработке обонятельного сигнала. Предлагается гипотеза, что обонятельная луковица рыб, независимо от степени развития обоняния, имеет собственную холинергическую систему. Впервые установлено, что в обонятельном эпителии рыб имеются специализированные микровиллярные клетки, ответственные за защиту ОВ от ксенобиотиков. Впервые определено, что у пресноводных рыб концентрация ионов хлора в обонятельной слизи сравнима с их содержанием в плазме. Поддержание столь высокой концентрации ионов в слизи, которая непосредственно контактирует с пресной водой, осуществляется специализированными ионтранспортирующими клетками. Впервые установлено, что в возникновении рецепторного потенциала (ЭОГ) ведущая роль принадлежит ионам хлора и кальция и показано, что при дефиците ионов кальция во внешней среде в процессах трансдукции обонятельного сигнала может участвовать Са2+ из внутриклеточных депо кальция.
Теоретическое и практическое значение работы. Проведенное исследование вносит несомненный вклад в решение фундаментальной проблемы эволюции развития обонятельной системы у животных. Описанные взаимодействия на клеточном, молекулярном и функциональном уровнях в обонятельной выстилке и луковице костистых рыб свидетельствуют, что у них присутствует много анцестральных признаков, различия между филогенетическими группами позвоночных обусловлены ходом эволюции и принципиальных отличий в ОС не наблюдается. Однако по организации холинергического входа в обонятельную луковицу костистые рыбы резко отличаются от Sarcopterygii и очень схожи с беспозвоночными. Это еще один пример конвергентной адаптации в развитии обонятельной системы животных.
На основании анализа собственных и литературных данных разработан простой и экспрессный способ определения функционального развития обонятельной и зрительной сенсорных систем у рыб (авторское свидетельство № 1423075).
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
1. Защиту апикальной части обонятельного эпителия от ксенобиотиков и излишка одорантов выполняют специализированные клетки эпителия - микровиллярные опорные клетки лимфоидного типа.
2. В рецепторном отделе обонятельной выстилки рыб поддержание ионного гомеостаза обеспечивают специализированные ионтранспортирующие клетки.
3. Ведущим ионом в трансдукции обонятельного сигнала у рыб является хлор. Вследствие повышенной концентрации в рецепторной клетке (за счет электрогенного транспорта) при открытии хлорных кальций-зависимых каналов он выходит из клетки и создается входящий деполяризующийся ток. Хлорными каналами в основном управляют инозитол-1,4,5-трифосфат и ионы кальция.
4. Обонятельная луковица костистых рыб имеет холинергический вход и собственную холинергическую систему, которая участвует как в первичной обработке обонятельного сигнала, так и в запоминании запаха.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Представленные в диссертации материалы были доложены на: "Всес. совещании "Сенсорная физиология морских рыб" (Мурманск, 1984); Всес. конференции "Экология и биологическая продуктивность Баренцевого моря" (Мурманск, 1986); V Всес. конференции по водной токсикологии (Одесса, 1988); VI Всес. симпозиуме "Роль циклических нуклеотидов и вторичных посредников в регуляции ферментативных реакций" (Петрозаводск, 1988); VI Всес. симпозиуме "Механизмы сенсорной рецепции"
(Москва, 1988); Всес. совещании "Хемокоммуникация животных" (Москва, 1989); X Всес. совещании по эволюционной физиологии памяти Л.А. Орбели (Ленинград, 1990); VII научной конференции по экологической физиологии и биохимии рыб (Петрозаводск, 1992); The 15th Intracenter Workshop. (Columbia, USA, 1992); I Междунар. симпозиуме "Зооиндикация и эктотоксикология животных в условиях техногенного ландшафта" (Днепропетровск, 1993); International symposium "Chemoreception in aquatic vertebrates" (Noresund, Norway, 1994); II Всероссийском совещании по поведению рыб (Борок, 1996); International symposium on Olfaction and Taste, XII and AChemS, XIX (San Diego, California, 1997); III междунар. конференции "Биологические ресурсы Белого моря и внутренних вод европейского Севера" (Сыктывкар, 2003); Междунар. научной конференции "Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов" (Петрозаводск, 2004).
ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликованы 42 научные работы.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Материал диссертации изложен на 221 страницах машинописного текста, содержит _7 таблиц, 37 схем и рисунков. Работа состоит из введения, б глав, выводов и списка цитируемой литературы (/Л9 отечественных, 7SS иностранных источников).
