Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время внимание исследователей привлекают биологические свойства оксида азота. Несмотря на многочисленные работы но изучению влияния N0 на физиологические функции организма и выяснению его роли в патогенезе заболеваний, до сих пор не существует четких представлений о значении этой молекулы в регуляции защитных систем организма (Проскуряков С.Я., и др., 2000; Akaike Т., etai., 2001; Саго А.А., et al., 2001.). Известно, что иммунитет, гемостаз и неспецифическая резистентность организма составляют единую интегралыгую оеточно-гуморальную систему, связующим звеном в которой выступают цитокины. Показано, что при многих заболеваниях, в том числе и воспалительных, на фоне повышения продукции интер-лейкинов одновременно изменяется течение иммунных реакций и гемостаза (КузникБ.И. и соавт., 1988 - 2002; Витковский Ю.А. исоавт., 1995-2002). Однако за последние годы появились сведения о том, что такие цитокины, как ИФ-у, ИФ-сс, ИЛ-lp4, ИЛ-4 и другие, являясь модуляторами воспалительных реакций, потенциируют синтез индуцибельной формы TslO-синтазы, и, тем самым, стимулируют продукцию NO (Nathan С, 2002; Xu L. etai., 1999,2001). Некоторые из них, например, ИФ-р, селективно снижают активность синтазы окиси азота (Ниа L.L. et al., 1998,2000; Van DerMeideP.H., 2000).
Несмотря на разрозненные сведения, до сих пор не существует четких представлений о клеточно-опосредованном влиянии оксида азота на механизмы гемостаза. Так, изучено и обосновано ингибирующее влияние NO на агрегацию тромбоцитов (Sabetkar М.., at al., 2001.). Однако становиться нерешенным вопрос, почему при атеросклерозе на фоне высокого содержания оксида азота развиваются нарушения циркуляции крови, а также выявляются изменения со стороны иммунной системы (Tarkowski Е. et al., 2000; Castillo J. et al., 2000.). При онкологических заболеваниях, несмотря на высокую концентрацию NO, утрачивается способность опухолевых клеток к апоптозу и очень рано проявляются иммунные и гемостатические реакции, во-многом определяющие особенности опухолевого роста (Tarkowski Е. et al., 2000; Castillo J. et al., 2000; Maeda H., 2001.).
Поскольку любые отклонения в продукции оксида азота, в частности, нарушения функциональной интеграции эндотелия, макрофагов, лимфоцитов, гранулоцитов и других компонентов, включенных в механизмы биомодуляции, биоамплификации, биоаттенуации или функциональной интеграции сосудисто-тромбоцитарного звена, свертывания крови и фибрино-лиза могут индуцировать состояние гиперкоагуляции и целый спектр тром-ботических или геморрагических осложнений, то становится понятным важность комплексного изучения этих реакций в норме и патологии. В связи с вышеизложенным выявление роли оксида азота в регуляции систем иммунитета и гемостаза является актуальным в теоретическом и практическом отношениях.
Цель исследования
Исследовать роль оксида азота в регуляции иммунитета и гемостаза в норме и при некоторых патологических состояниях.
Задачи исследования
-
Изучить влияние оксида азота на агрегацию тромбоцитов, свертывание крови и фибринолиз в опытах in vitro.
-
Определить эффекты цитокинов ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-8, ИЛ-10, ФНОа, ИФа, ИФу, на продукцию оксида азота клетками периферической цельной крови.
-
Исследовать влияние N0 на экспрессию тканевого фактора моноцитами периферической крови и его действие на лимфоцитарно-тромбоцитар-ную адгезию.
-
Определить концентрацию оксида азота у здоровых людей в возрастном аспекте и выяснить его уровень у молодых женщин в связи с различными фазами менструального цикла.
-
Исследовать влияние куРения на продукцию оксида азота у молодых мужчин.
-
Исследовать продукцию оксида азота, уровень цитокинов и экспрессию тканевого фактора в крови больных атеросклерозом, вирусным гепатитом С и раком гортани.
-
Изучить уровень оксида азота и цитокинов в цереброспинальной жидкости детей с разными формами менингита.
Научная новизна
Впервые установлено, что оксид азота, угнетает клеточно-опосредованную прокоагулянтную активность крови за счет торможения агрегации тромбоцитов и снижения экспрессии тканевого фактора, тормозит лимфоцитарно-тромбоци-тарную адгезию.
Впервые показано, что присутствие в окружающей среде ИЛ-1(3, ИЛ-8, ИЛ-10 и ИФу приводит к повышению, а ИЛ-4 и ИФа - к снижению продукции оксида азота лейкоцитами крови. Отмечена зависимость между фазой менструального цикла и продукцией оксида азота у здоровых женщин. Выяснено, что уровень оксида азота у мужчин увеличивается пропорционально стажу табакокурения.
Впервые комплексно оценена продукция оксида азота, уровень провоспа-лительных цитокинов крови и экспрессия тканевого фактора у пациентов с острым проявлением атеросклероза (инсульт), вирусного гепатита С и рака гортани. Показано, что оксид азота появляется в цереброспинальной жидкости у детей в острый период гнойного и серозного менингита и зависит от присутствия про-воспалительных цитокинов ИЛ-ір, ИЛ-8, ФНОа.
Практическая значимость работы
Определение продукции оксида азота у пациентов носит диагностическую,
В исследованиях в качестве испытуемых принимали участие здоровые люди: 55 человек обоего пола в возрасте от 30 до 70 лет, 85 человек - в возрасте от 19 до 29 лет, 36 человек - от 5 до 18 лет.
Нами наблюдались 4 группы больных. Первая группа включала 70 человек в возрасте от 55 до 92 лет, у которых диагностирован атеросклроз сосудов головного мозга. Из них 30 человек находились в состоянии острого ишемического инсульта, 10 человек - в раннем восстановительном периоде, 20 - в позднем восстановительном и 10 человек- в периоде остаточных проявлений.
Вторую группу составили 25 больных вирусным гепатитом С в возрасте от 19 до 26 лет, у 12 из которых диагностирован гепатит в активной фазе, у 13 - в неактивной.
В третью группу входили 88 больных раком гортани Т2 Т3 Т4 стадии в возрасте от 35 до 75 лет (3 человека с Т2 стадией, 38 человека с Т3 стадией, 27 человек с Т4 стадией процесса), у 38 из них в комплексном лечении применялся рекомбинантный ИЛ-2 - ронколейкин". У всех больных диагноз злокачественной опухоли был подтвержден гистологическими исследованиями, биопсийпого и операционного материала.
Четвертая группа включала 36 детей с менингитами от 1 года до 14 лет. Из них у 8 человек диагностирован гнойный менингит в острой стадии заболевания, сопровождавшийся тяжелым течением, у 6 детей с гнойным менингитом обнаружена острая стадия процесса и среднетяжелое течение, у 5 детей установлена стадия рсконвалесценции. У 6 детей диагностирован острый серозный менингит с тяжелым течением, у 5 человек - острый серозный менингит со средней степенью тяжести, у 6 детей — заболевание в период выздоровления.
Объектами изучения были цельная кровь, плазма, цереброспинальная жидкость и сыворотка.
Методы исследования
Определение NO. Для исследования оксида азота за основу был взят модифицированный метод спектрофотометрического определения нитритов Грисса-Илосвая (Уильяме У.Дж., 1982).
Оценка лимфоцнтаріїо-тромбоцитарноіі адгезии. Определение показателя лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии проводили по методу, предложенному Ю.А.Витковским и соавт. (1999). Свежую, гепаринизированную кровь обследуемых больных наслаивали на градиент урографин-фикол (плотность 1,077) и выделяли лимфоциты как описано выше. Собирали интерфазное кольцо, содержащие клетки и кровяные пластинки, однократно промывали фосфатно-солевым буфером (рН 7,4) и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 3-4 мин. Надосадочную жидкость сливали, осадок микроскопировали в камере Горяева. Подсчитывали число лимфоцитарно-тромбоцитарных коагре-
прогностическую значимость и может быть использовано для оценки правильности и эффективности проводимого лечения.
Внедрение в .практику Материалы диссертационной работы внедрены в учебный процесс и используются при чтении лекций и проведении занятий на кафедрах патологической и нормальной физиологии.
Апробация основных положений работы Материалы представлены на XVIII конгрессе Международного общества по тромбозу и гемостазу (Париж, Фракция, 2001), на II конгрессе по биологии и химии оксида азота (Прага, Чехия, 2002), XVIII Международном конгрессе по тромбозу (Болонья, Италия, 2002). Объем її структура диссертации Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста, иллюстрирована 30 таблицами и 19 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 2 глав собственных исследований, обсуждения полученных данных, выводов и списка литературы, включающего 165 источников (19 отечественных и 146 зарубежных).
Положення, выносимые на защиту
-
Оксид азота in vitro тормозит агрегацию тромбоцитов, реакцию лимфо-цитарно-тромбоцитарного розеткообразования, угнетает клеточно-опос-редованную прокоагулянтную активность крови за счет уменьшения экспрессии тканевого фактора моноцитами и увеличивает фибринолнти-ческие свойства цельной крови. Присутствие в окружающей среде ИЛ-ір, ИЛ-8, ИЛ-10 и ИФу приводит к повышению продукции оксида азота лейкоцитами крови. Внесение же ИЛ-4 и ИФсх вызывает противоположный эффект - торможение секреции NO.
-
У здоровых женщин концентрация NO зависит от фазы менструально-овариального цикла: в секреторную фазу и во время менструации - увеличивается, а в фазу пролиферации - уменьшается. У мужчин табакокурение способствует продукции оксида азота и его уровень пропорционален стажу курения.
3. Повышение содержания оксида азота при атеросклерозе, гепатите С, раке
гортани и менингите зависит от стадии болезни и сопровождается по
вышенным содержанием провоспалительных цитокинов и экспрессией
тканевого фактора.
В работе со здоровыми и больными людьми соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской Декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki (1964,2000 ред.).
