Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 9
Общие свойства опиоидных рецепторов 9
Типы опиоидных рецепторов 16
Онтогенез опиоидной системы мозга 22
Опиоидные свойства (3-казоморфинов 26
Экзорфины не-молочного происхождения 31
Материалы и методы исследования 41
Результаты исследования 47
Острое и хроническое введение рубисколина -5 47
Острое и хроническое введение экзорфина С 73
Острое и хроническое введение цитохрофина-4 90
Обсуждение результатов 111
Влияние острого введения экзорфинов на тревожность, исследовательскую активность и проявления депрессивности 111
Влияние острого введения экзорфинов на обучение детенышей крыс 125
Эффекты хронического введения экзорфинов и их возможные механизмы 129
Заключение 153
Выводы 158
Список литературы 159
- Общие свойства опиоидных рецепторов
- Типы опиоидных рецепторов
- Острое и хроническое введение рубисколина
- Влияние острого введения экзорфинов на обучение детенышей крыс
Введение к работе
Актуальность проблемы. Показано, что пептидные фрагменты, полученные при энзиматическом гидролизе пищевых белков, обладают биологической активностью и способны воздействовать на многие системы организма, включая пищеварительную, иммунную, нервную (Hartmann, Meisel, 2007). Некоторые из таких фрагментов характеризуются опиоидными свойствами и, поскольку поступают в организм извне, названы «экзорфинами». К этой группе относят пептиды, выделенные из гидролизатов пшеничного глютепа (экзорфины А, В и С), казеинов молока (казоморфины), белка зеленых листьев РУБИСКО (рубисколины). Сюда же примыкают пептиды, образующиеся в ходе ферментативной деградации гемоглобина (геморфины), цитохрома b (цитохрофины) и ряд других.
Данные о функциональных характеристиках большинства экзорфинов отрывочны и фрагментарны. В настоящий момент относительно хорошо изучены лишь (3-казоморфины (Brantl et al., 1979). Известно, что их присутствие в молоке характерно, прежде всего, для млекопитающих, чьи детеныши рождаются зрячими. Пептиды группы р-казоморфинов обладают анксиолитическими свойствами, обуславливая лучшую адаптацию новорожденных к стресогенной окружающей среде и усиливают их потребность находиться в тесном контакте с матерью (Meisel, 1997; Ивлева, 2004). Хроническое введение р-казоморфинов в ранний постнатальный период оказывает выраженное адаптогенное действие на мозг детенышей, которое сохраняется в течение длительного времени (Малиновская, 2001). В основе подобной активности р-казоморфинов, по-видимому, лежит их способность влиять на образование факторов роста нервной ткани либо самим функционировать в качестве нейротрофических факторов (Sakaguchi et al., 2003). По общему мнению, Р-казоморфины в раннем постнатальном периоде выполняют роль своеобразных «экзогормонов», и онтогенез мозга многих млекопитающих (в том числе, человека) предполагает их поступление в организм в первые недели и месяцы жизни (Teshemacher, 2003).
Экзорфины не-молочного происхождения (рубисколины, фрагменты глютена и др.) отличаются от производных казеина по первичной структуре и специфичности связывания с разными типами опиоидных рецепторов (Yoshikawa et al., 1993; Freeman, Young, 2000; Yang et al., 2003). Можно предположить, что, по крайней мере, некоторые из них в ходе эволюции стали играть роль аллелопатических факторов, защищающих растения от поедания животными (по аналогии с непептидными алкалоидами, например, морфином). Так, показано, что среди целого ряда опиоидных лигандов различной природы наиболее выраженное действие на защитную реакцию насекомых оказывает именно рубисколин-5 (Грицай с соавт., 2008).
Однако, если принять гипотезу об аллелопатической функции некоторых не-молочных экзорфинов, можно ожидать, что их применение приведет к развитию целого ряда негативных эффектов. В диетологии уже более 20 лет дискутируется проблема безглютенового питания, причем не только по поводу целиакии (иммунологической непереносимости белков злаков), но и в связи с присутствием экзорфинов в составе молекул глютенов. При этом опиоидные фрагменты как пшеничных, так и других пищевых белков рассматриваются в качестве факторов, способствующих развитию аутизма и даже синдрома внезапной остановки дыхания (Kidd et al., 2002).
Все это доказывает актуальность изучения как острых, так и отставленных эффектов введения экзорфинов экспериментальным животным (прежде всего, новорожденным). Представляется важным, во-первых, исследовать саму способность экзорфинов оказывать влияние на поведение детенышей млекопитающих; во-вторых, попытаться оценить баланс положительных и отрицательных последствий их применения на разных этапах постнатального развития.
Цель и задачи исследования. Целью представленной диссертационной работы явился анализ поведенческих эффектов ряда экзорфинов при однократном и хроническом системном введении детенышам белых крыс. В работе были поставлены следующие задачи:
изучить действие острого введения рубисколина-5, экзорфина С и цитохрофина-4 па исследовательскую активность, уровень тревожности и поведенческие проявления депрессивиости детенышей;
изучить действие хронического (1-14 дни жизни) введения рубисколина-5, экзорфина С и цитохрофина-4 на те же параметры поведения экспериментальных животных;
исследовать действие острого введения рубисколина-5, экзорфина С и цитохрофина-4 на способность детенышей крыс к обучению с положительным и отрицательным подкреплением;
исследовать действие рубисколина-5, экзорфина С и цитохрофина-4 на способность детенышей крыс к обучению в случае их хронического применения (1-14 дни жизни);
сопоставить обнаруженные эффекты с влиянием острого и хронического введения Р-казоморфинов на поведение экспериментальных животных. Научная новизна. Опиоидные фрагменты белков пищевого
происхождения являются мало изученной группой регуляторных пептидов. В связи с этим практически все полученные нами результаты можно квалифицировать как новые и не имеющие аналогов в литературе.
В работе впервые показано, что при однократном введении детенышам крыс рубисколин-5 способен вызывать увеличение тревожности, ухудшение обучения с положительным подкреплением, снижать проявления депрессивиости. Цитохрофин-4 оказывал в наших опытах анксиолитическое и продепрессантное действие, ухудшал обучение с положительным и отрицательным подкреплением. Влияние экзорфина С при однократном введении было мало выражено. Полученные результаты указывают на индивидуальный паттерн физиологической активности исследованных пептидов как в сравнении друг с другом, так и по отношению к ранее изученным р~ казоморфинам. Причиной этого, по-видимому, служат различия их первичной структуры и разная селективность по отношению к опиоидиым рецепторам р,-, 5-
и к-типов; в большинстве случаев эффекты рубисколина-5 и цитохрофина-4 были зависимы от пола.
Впервые обнаружено, что при хроническом введении детенышам крыс
рубисколин-5 и экзорфин С способны вызывать снижение тревожности, рост
исследовательской активности, улучшение обучения с положительным
подкреплением; фрагмент РУБИСКО, кроме того, ослаблял поведенческие
проявления депрессивности. Введение цитохрофина-4 привело к снижению
тревожности и росту исследовательской активности, улучшению обучения с
отрицательным подкреплением и незначительному ухудшению обучения с
положительным подкреплением. Полученные данные указывают на сходство
эффектов и, по-видимому, общность механизмов влияния опиоидных пептидов
пищевого происхождения, хронически вводимых в раннем постнатальном
периоде, на поведение детенышей белых крыс (по крайней мере, в случае
рубисколина-5, экзорфина С и Р-казоморфинов); отставленные эффекты
исследованных пептидов были зависимы от пола. '
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты позволяют значительно расширить представления о физиологической роли опиоидных фрагментов пищевых, белков. На примере детенышей крыс нами проанализирована ситуация, в которой находится нервная система каждого новорожденного, получающего с питанием экзорфин-содержащие протеины (что справедливо и в отношении человека). Опиоидные фрагменты РУБИСКО, глютена и цитохрома b при попадании в организм новорожденных млекопитающих способны оказывать существенное нейротропное (изменяющее поведение) действие. В значительной части случаев это действие имеет отставленный характер, проявляется через несколько недель после окончания введения пептида и сохраняется в течение длительного времени. В целом можно заключить, что входящие в питание новорожденных опиоидные пептидные компоненты являются физиологически значимыми факторами, от наличия либо отсутствия которых зависит реализация многих важнейших (в смысле выживания и полноценного развития) поведенческих реакций детеныша. В
первую очередь, это относится к уровню исследовательской активности, тревожности, а также способности к обучению.
Практическая значимость представленной работы связана с оценкой роли различных белковых компонентов смесей, используемых для питания новорожденных. Полученные результаты свидетельствуют о важности учета наличия либо отсутствия в заменителях молока как избытка, так и недостатка опиоид-содержащих протеинов (в том числе растительного происхождения).
Апробация работы. Апробация результатов представленного диссертационного исследования успению прошла на 2-м съезде Российского Научного Общества фармакологов (Москва, 2003), Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, 2003), Международной конференции FENS (Лиссабон, 2004), 8-м Международном съезде ECNP (Москва, 2005), 2-м Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Санкт-Петербург, 2005), конференции «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005), 3-м Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, 2007), 20-м съезде физиологического общества имени И.П. Павлова (Москва, 2007), а также на заседаниях кафедры физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 172 страницах, содержит 19 рисунков и 30 таблиц. Список литературы включает 245 источников, из них 22 отечественных.
Общие свойства опиоидных рецепторов
Все классические типы опиоидных рецепторов (ц.-, 5-, к-) имеют одинаковую базовую структуру. Они состоят из N-концевой и С-концевой областей, 7-ми трансмембранных доменов и соединяющих их экстра- и внутриклеточных петель. За связывание с лигандом отвечают как трансмембранные домены, так и экстраклеточные петли. Для первых показана высокая степень консервативности. Связывания с трансмембранными участками (в первую очередь, Ш-м и VII-м) достаточно для проявления активности неселективных лигандов (Lavecchia et al., 2000).
Зона захвата лиганда опиоидного рецептора условно делится на участки селективности и карман связывания. Первые расположены преимущественно выше наружной поверхности мембраны и сформированы аминокислотными остатками внеклеточных петель и верхушек трансмембранных доменов (Mansour et al., 1997). Карман находится ниже наружной поверхности мембраны. Он ограничен спиральными петлями трансмембранных доменов (Befort et al., 1996). В присоединение относительно крупных лигандов пептидной природы вовлечены как участки селективности, так и карман связывания. Алкалоиды и их дериваты контактируют с рецептором преимущественно в области кармана. При этом заряженный азот молекулы лиганда (имеются в виду, прежде всего, морфин и его производные) вступает во взаимодействие с остатками ароматических аминокислот полипептидной цепи рецептора.
Углублению теоретических представлений о механизмах связывания лигандов опиоидных рецепторов способствовало внедрение методов клонирования. В частности, значительное количество информации получено посредством создания химерных конструкций. В этом случае полипептид формировался из фрагментов, принадлежащих рецепторам различных типов: (І/5, 5/ц, 5/к и т.д. (Chaturvedi et al., 2000). Подобный подход дал возможность определить конкретное участие внеклеточных петель и трансмембранных доменов в связывании тех или иных агонистов и антагонистов (Jordan, Devi, 1998). Иными словами, исследования химерных рецепторов позволили выявить участки, ответственные за формирование селективности к различным лигандам Однако путем изучения химерных рецепторов невозможно определить ключевые аминокислоты, отвечающие за связывание. Поэтому следующим шагом стало изучение вклада отдельных аминокислотных остатков. Для этого проводилось клонирование мутантных рецепторов, в которых направленно заменяли одну или несколько аминокислот. Оценивались функциональные характеристики рецептора (по параметрам связывания радиолигандов и по активности систем трансдукции); кроме того, осуществлялось компьютерное моделирование участка рецептирования (Pepin et al., 1997).
Было показано, что ключевыми аминокислотами кармана связывания служат гистидин, глутаминовая и аспарагиновая кислоты (Surratt et al., 1994; Spivak et al., 1997). Li с соавт. (1999) установили, что в связывании налтрексона важную роль играет отрицательно заряженная карбоксильная группа аспартата-147 (трансмембранный домен III) р.-рецептора. Взаимодействие происходит, между карбоксилом аспартата-147 и протонированным азотом-17 налтрексона. Замена аспартата-147 на аспарагин или аланин, которые не имеют карбоксильной группы, резко понижала аффинитет рецептора к антагонисту. С другой стороны, мутанты с глутаматом-147 (имеется карбоксил) мало отличались от рецепторов "дикого" типа. При этом аналог налтрексона, не обладающий протонированным азотом, характеризовался очень низким сродством к рецептору, а его антагонистическая активность в сравнении с прототипом была слабее в 100 раз.
Для 5 рецепторов показана важность наличия в 3-ей экстраклеточной петле гидрофобной области, заканчивающейся лейцином-300, а также аргинина в позиции 291. Замена любой из этих аминокислот приводит к практически полной блокаде присоединения 5-селективных лигандов (Pepin et al., 1997).
Структура кармана связывания опиоидного рецептора способна модулироваться аминокислотными остатками, расположенными на некотором удалении от него. К примеру, замена лизина-108 в первой внеклеточной петле на аспарагин сопровождалась многократным снижением аффинитета 5-рецептора к налоксону. Первая экстрацеллюлярная петля не участвует в формировании кармана связывания, с которым взаимодействует антагонист. Следовательно, в этом случае замена лизина-108 ведет к каскаду определенных (весьма серьезных) внутримолекулярных перестроек рецептора (Minami et al., 1996).
Основная функция опиоидных рецепторов связана с пресинаптическим торможением передачи сигнала в различных нейромедиаторных системах. Соответственно, опиоиды, как правило, оказывают ингибирующее действие на высвобождение нейротрансмиттеров. Ингибируется выброс как медиаторов-аминокислот глутамата и ГАМК (Kavaliers et al., 1997; Napier, Mitrovic, 1999; Waldmeier et al., 2000), так и моноаминов - дофамина, норадреналина, серотонина (Heijna et al., 1992; Speciale et al., 1993; Tao et al., 1998; Yilmaz, Gilmore, 1999;), а также ацетилхолина (Sandok et al., 1992).
Известно, что большинство клонированных типов опиоидных рецепторов сопряжены с С1/о-белками, чувствительными к пертуссин-токсину (Беспалов, Звартау, 2000). В свою очередь, 0,-белки реализуют свое действие через подавление активности аденилатциклазы, что приводит к уменьшению количества цАМФ и изменению состояния протеинкиназ. В результате снижается Са2+-проводимость пресинаптической мембраны и уменьшается количество высвобождаемого медиатора (схема 1, внизу).
Типы опиоидных рецепторов
Доказательство существования 3-х классических типов опиоидных рецепторов (д.-, к- и б-) является результатом большого количества работ, выполненных в 70-80-х годах прошлого века.
Опиоидные рецепторы широко распространены в мозге и периферических тканях всех животных, хотя встречаемость конкретных типов различна у разных видов и в разных анатомических регионах. Этот вопрос довольно подробно рассмотрен в обзоре Девойно и Ильюченок (1993). Авторы отмечают, что особенно большое количество ц-рецепторов имеется в стриатуме, бледном шаре, поводке, таламусе, спинном мозге, фронтальных и цингулярных областях коры. Меньше рецепторов этого типа обнаруживается в миндалине, гиппокампе, мамиллярных телах, моторной и первичной сенсорной коре, центральном сером веществе среднего мозга, голубом пятне. Наличие 8-рецепторов выявлено в неостриатуме, обонятельных бугорках и обонятельных луковицах, миндалине, таламусе, спинном мозге. В коре больших полушарий 5-рецепторы также хорошо представлены и распределены более равномерно, чем д.-рецепторы. В целом распределение мест связывания опиоидных пептидов подчиняется следующим отношениям: в коре - к 5 д.; в стриатуме - 8 к д; в стволе мозга и спинном мозге - д 5 к.
В работе Elde с соавт. (1995) при использовании антител к выделенным аминокислотным последовательностям, входящим в состав 8-, д- и к- опиоидных рецепторов, удалось визуализировать последние в ряде структур нервной ткани. Показано, что S-опиоидные рецепторы распределяются преимущественно в аксонах и функционируют, прежде всего, на пресинаптическом уровне, д- и к-опиоидные рецепторы чаще связаны с мембранами дендритов и тел нейронов, и, соответственно, в большей мере причастны к постсинаптическим процессам. Энкефалин-содержащие терминали обнаруживаются в основном по соседству с мембранами, где присутствуют 8- или д- опиоидные рецепторы; динорфин-содержащие терминали находятся чаще вблизи к-мест связывания.
В 90-е годы были определены и клонированы гены, кодирующие д- ,к- и 8 типы рецепторов - MOR-1, KOR-1 и DOR-1, соответственно (Evans et al., 1992, Kieffer et al., 1992; Minami et al., 1993). Позже на основе данных о структурном сходстве к ним была присоединена последовательность ДНК, несущая информацию о так называемых «орфановых» рецепторах (ген ORL-1) (Mollereau et al., 1994). Степень гомологии MOR-1, KOR-1, DOR-1 и ORL-1 составляет не менее 50 %.
Эндогенными агонистами р-рецепторов являются эндорфины, которые образуются путем протеолитической деградации предшественника проопиомсланокортина, а таюке эндоморфины-1 и -2. Кроме того, в ткани мозга обнаружен эндогенный морфин. Наряду с морфином, селективными нс-пептидными агонистами .-рецепторов являются фентанил, суфентанил, оментанил. Такими же свойствами обладают аналог мет-энкефалина FK 33.824, а также синтетические пептиды DAMGO, DAGO, DAGOL. К антагонистам ц,-рецепторов относят налоксон, налтрексон, налоксазон, налоксоназин и др.
Выяснено, что у MOR-1 нокаутных мышей морфин не индуцирует антиноцицепцию и физическую зависимость (Matthes et al., 1996). У MOR-1 нокаутных детенышей снижен уровень зависимых от матери реакций (Moles et al., 2004).
В 1981 году Wolozin и Pasternak предложили дополнительное разделение \х-рецепторов на р.] и р2 подтипы на основе 2-х фазного связывания меченых ц-радиолигандов. In vivo исследования показали, что налоксоназин (в дальнейшем был определен как селективный блокатор щ-рецепторов) устраняет морфин-индуцированную антиноцицепцию, но не ингибирует вызванную морфином депрессию дыхания, а таюке развитие морфиновой зависимости (Ling et al., 1985). Среди пептидов селективностью относительно подтипов р-рецепторов обладает Tyr-W-MIF (Tyr-Prorp-Gly-NH2). Показано, что он является агонистом ц-2- и антагонистом р.]-мест связывания (Gergen et al., 1996). Более высоким сродством к р2-рецепторами обладает, видимо, сходный с этим пептидом эндоморфин-1 (Tyr-Prorp-Phe-NH2). Во всяком случае, антиноцицептивное действие эндоморфина-1 не блокировалось налоксоназином (Sakurada et al., 1999).
Вместе с тем, хотя фармакологически выделено несколько подтипов ц-рецептора, в настоящее время известен всего один ген MOR-1 (Pan et al., 2005). У мышей, крыс и человека его продукты проходят альтернативный сплайсинг. Например, открыто 10 сплайсинговых вариантов человеческого гена MOR-1. Все они содержат экзоны 1, 2 и 3, но отличаются друг от друга сплайсингом после 3 экзона, что в итоге приводит к разным аминокислотным последовательностям. Полученные белки принадлежат к семейству ц.-рецепторов, однако изучение связывания ГТФ и активности аденилатциклазы выявило значительную разницу между ними. Различия аффинности и эффективности обнаруженных вариантов по отношению к конкретным агонистам и антагонистам, по-видимому, и лежат в основе выделения в более ранних исследованиях подтипов опиоидных рецепторов (Pasternak, 2005).
Эндогенными лигандами этого типа мест связывания являются лей- и метэнкефалины, предшественником которых служит проэнкефалин А. Синтетические лиганды 5-рецепторов представлены такими соединениями как DADLE и DPDPE (агонисты), а также налтриндол, налтрибен, BNTX, DALCE (антагонисты). Рецепторы 8-типа участвуют в регуляции многих физиологических процессов: болевой чувствительности (в том числе на спинальном уровне), когнитивных функций, настроения, дыхания, двигательной активности. Показано вовлечение 5-рецепторов в ингибирование эвакуаторной функции кишечника.
Острое и хроническое введение рубисколина
В возрасте 21 день однократная инъекция рубисколина-5 за 10 мин до помещения в открытое поле не повлияла на пробег экспериментальных животных (табл. 1.1). Вместе с тем, общее количество отходов от стенки арены и выходов в центр поля оказалось значимо снижено в опытной группе (рис. 1.1). Так, ни один из детенышей опытной группы не отходил от стенки арены более 3 раз за все время тестирования, тогда как 5 из 23 контрольных совершили не менее 4 отходов (р=0.02 по критерию % ). Суммарное число выходов в центр арены в опытной группе составило 0.14±0.08 по сравнению с 0.67±0.22 в контроле (р=0.04 по критерию Стыодента). Основной вклад в этот эффект рубисколина-5 внесла подгруппа самцов (0.12±0.12 по сравнению с 1.67±0.56 в контроле, р 0.01 по критерию Стыодента). Кроме того, у самцов, получивших инъекции пептида, зарегистрировано снижение количества стоек на 2 и 3 мин эксперимента (р 0.05, рис. 1.2).
Использование ANOVA-метода выявило достоверное влияние фактора «препарат» (F=8.06, р=0.007), а также взаимодействие факторов «препарат» и «пол» (F=5.06, р=0.03) в случае отходов от стенки арены за все 5 мин тестирования.
Факторы «препарат» (F=13.02, рО.001) и «пол» (F=7.09, р=0.01) значимо повлияли, кроме того, на количество выходов в центр поля в течение всего эксперимента. Взаимодействие этих факторов также было достоверным (F=7.74, р=0.008, рис. 1в).
В случае пробега значимый эффект выявлен лишь для фактора «пол» (F=5.06, р=0.03). Влияние факторов «препарат» и «пол» на количество стоек за 5 мин опыта не достигло уровня достоверности (р=0.06-0.08). Вместе с тем, взаимодействие этих факторов оказалось значимым (F=4.62, р=0.04). В случае ANOVA анализа, проведенного для подгруппы самцов, влияние фактора «препарат» на уровень пробега не достигло уровня значимости(Р=3.22, р=0.10), что, по-видимому, связано с небольшой величиной экспериментальных групп.
При тестировании в крестообразном лабиринте в возрасте 28 дней (табл. 1.2) и помещении в открытое поле в возрасте 35 дней (табл. 1.3) не выявлено каких-либо достоверных изменений поведения животных под действием пептида.
Влияние острого введения рубисколина-5 на обучение и переучивание крыс в сложном лабиринте также практически отсутствовало (табл. 1.4, 1.5). Единственным значимым эффектом оказалось увеличение количества возвратов, совершенных опытными животными в 1 день эксперимента (р=0.04). Также крысы, получавшие инъекции пептида, выполнили больше возвратов в среднем за все 4 дня обучения (1.5±0.2 по сравнению с 0.9±0.2, р=0.02 по критерию Стьюдента).
Обработка данных с помощью ANOVA-метода не выявила достоверного воздействия фактора «препарат» ни на один из параметров обучения, кроме количества возвратов за 4 дня выработки навыка (F=4.77, р=0.03). Половые различия в реакции детенышей на рубисколин-5 в этом случае отсутствовали.
При формировании условной реакции пассивного избегания (УРПИ) в возрасте 42 дня достоверных отличий между контрольной и опытной группами не найдено. Вместе с тем, латентный период захода в темный отсек при проверке сохранения навыка через 4 дня был заметно увеличен у животных, получивших пептид (табл. 1.6), хотя эта тенденция и не достигла уровня достоверности (р=0.08). При проведении ANOVA-анализа значимого влияния факторов «препарат» и «пол» на параметры формирования УРПИ обнаружено не было.
Оценка проявлений депрессивности в тесте "принудительное плавание" (возраст 49 дней) выявила в опытной группе достоверное увеличение і длительности активного плавания и латентного периода 1-ой иммобилизации. В связи с большим разбросом данных, полученные результаты были нормированы по контролю для каждого выводка детенышей (см. табл. 1.7, справа). В результате различие латентных периодов 1-ой иммобилизации оказалось значимо по критерию Стьюдента (р=0.04); различие длительностей активного плавания - по критерию х2 (р=0.02). В последнем случае количество животных, характеризовавшихся длительностью активного плавания более 200% от среднего уровня контроля, составило 5 из 36 в опытной группе; в контроле такие крысы отсутствовали. Какой-либо связи эффектов рубисколина-5 с полом крыс в случае теста «принудительное плавание» не обнаружено. Хроническое введение рубисколина-5 осуществлялось в 1-14 дни жизни. При тестировании в открытом поле в возрасте 21 день достоверное влияние пептида на поведение не зарегистрировано (табл. 1.1).
В крестообразном приподнятом лабиринте значимое отличие между опытной и контрольными группами выявлено в подгруппе самцов (табл. 1.2). Животные, получавшие хронические инъекции рубисколина, совершили 0.58±0.29 переходов из одного темного огсека в другой; в контроле такие переходы отсутствовали (р=0.03).
В возрасте 35 дней обнаружено существенно больше значимых расхождений в поведении опытных групп по сравнению с контролем (табл. 1.3). В более яркой форме они проявились в случае самок; направленность изменений можно оценить как анксиолитическую и приводящую к росту исследовательской активности. На разных минутах тестирования в открытом поле у самок опытной группы были достоверно увеличены пробег (рис. 1.36), количество стоек (рис. 1.46), число отходов от стенки арены (рис. 1.56) и выходов в ее центр (рис. 1.66). В максимально выраженной форме это проявилось на 1-й мин помещения в открытое поле, а также на 4-й мин (смена яркого освещения на свет красной лампы).
Влияние острого введения экзорфинов на обучение детенышей крыс
Хорошо известно, что даже в случае животных, не подвергавшихся каким-либо фармакологическим, стрессирующим и прочим воздействиям, мозг взрослых самок и самцов различен. Помимо морфологических и нейрохимических показателей, это проявляется на уровне поведенческих реакций. По данным Harnad (1995) самки, по сравнению1 с самцами, при тестировании в "открытом поле" проявляют меньшую тревожность и большую исследовательскую активность. Они совершают меньше ошибок в лабиринтах с пищевым подкреплением и. хуже обучаются условным реакциям пассивного и активного избегания. Половой диморфизм распространяется также на агрессивность, структуру сна, мышечный тонус (Розен, 1994).
В случае опиоидной системы показана, более высокая чувствительность самок практически ко всем опиоидным агонистам и антагонистам (как ц- и 5 -, так и к-селективным) (Bartok, Craft, 1997; Stoffel et al., 2005). Чувствительность зависит от фазы эстрального цикла, становление которого происходит уже к 30-му дню жизни. Овариоэктомия снижает реакцию самок на опиоиды до уровня самцов.
Нейроэндокринная система, как и эндогенная опиоидная система мозга, к моменту рождения созревает не полностью. Однако половые стероиды очень рано получают возможность влиять на экспрессию и плотность опиоидных рецепторов. Показано, что специфические андроген- и эстроген-связывающие макромолекулы присутствуют в преоптической области гипоталамуса крыс в-продолжении всего критического периода половой дифференцировки мозга (Vito, Fox, 1981). Концентрация эстрогеновых рецепторов увеличивается примерно в 6 раз в течение последней недели внутриутробного развития, достигая взрослого уровня к моменту рождения. Концентрация андрогеновых рецепторов растет в поздние сроки эмбрионального развития незначительно; ее уровень постепенно повышается до взрослого в течение нескольких недель после рождения.
Чувствительный период, во время которого под влиянием половых гормонов происходит необратимая дифференцировка мозговых структур, у крыс начинается через несколько дней после рождения и в основном заканчивается к 10-12 дню жизни (Becu-Villalobos et al., 1997). Самки, получающие в это время андрогеиы, в значительной мере утрачивают способность к секреции гонадотропин-рилизинг-гормона в ответ на эстрогеновую стимуляцию. Тестостерон способен воздействовать на нервные субстраты и позже данного периода, маскулинизируя эндокринные и поведенческие функции (введение в 15-30 дни после рождения).
Maggi с соавторами (1991) было исследовано, как наличие либо отсутствие тестостерона в ранний постнатальныи период влияет на гипоталамические опиоидные рецепторы д-типа. Показано, что на 16 день жизни у крыс всех групп число д-рецепторов примерно одинаково. На 26 день оно значительно увеличивалось у нормальных самок. На 60 день количество .-рецепторов продолжало расти у нормальных самок, но параллельно увеличилось, достигая того же уровня, у неонатально кастрированных самцов. У нормальных самцов и андрогенизированных (получавших тестостерон) самок какие-либо изменения отсутствовали. Следовательно, можно говорить о существовании андроген-зависимого полового диморфизма, по крайней мере, в случае гипоталамических д-рецепторов.
Обнаружено также, что в медиальной преоптической области на 6-й день после рождения у самок, но не у самцов, наблюдается значительное увеличение связывания налоксона (Hammer, 1985). Неонатально кастрированные самцы демонстрируют аналогичное увеличение связывания. С другой стороны, инъекции тестостерона самкам в 1-6 дни жизни приводят к сохранению низкой плотности опиоидных рецепторов.
Таким образом, неоднородность эффектов экзорфинов, является, видимо, вполне закономерным проявлением полового диморфизма. Представляется вполне вероятным, что половые различия в эффектах пептидов могут быть обусловлены разными сроками созревания опиоидных рецепторов у самцов и самок, а таюке разным распределением рецепторов в тех или иных областях мозга (Wilson et al., 2002).
Интересно сравнить данные, полученные в результате острого введения экзорфинов. детенышам крыс, с экспериментами Грицай с соавт. (2008), в которых впервые изучено действие рубисколина-5, цитохрофина-4 и экзорфина С на поведение насекомых, а именно - защитную реакцию таракана Periplaneta americana при термическом стрессе. Параллельно оценивались эффекты мет-энкефалина, динорфина А ю, Р-неоэндорфина, морфина. Для создания термического стресса была использована, «горячая камера» (t=50C), куда помещался таракан, после чего регистрировался латентный период (ЛП) реакции избавления. Тестирование проводилось до введения препаратов, а также через 30, 60, 90, 120 и 150 мин после введения.
Обнаружено, что экзорфин С значимо ослабляет защитную реакцию таракана только в дозе 500 мкг/г; рост ЛП составил 200-300% от уровня контроля (максимум - через 90 мин после инъекции).
Введение рубисколина-5 оказало достоверное действие уже в дозе 300 мкг/г (ЛП достиг 250% от уровня контроля). В случае дозы 500 мкг/г влияние пептида было еще более выражено - 380% от уровня контроля, причем к 150 мин наблюдений признаков затухания эффекта не обнаруживалось.
В отличие от этого, цитохрофин-4 не привел к значимым изменениям защитной реакции тараканов; ЛП не превысил 130% от уровня контроля (р 0.1; доза 500 мкг/г).
Приведем таблицу, обобщающую результаты по введению опиоидов Р. americana (табл. 4.9). Как можно заметить, для формализации оценки связывания лиганда с опиоидными рецепторами в ней использована балльная шкала. Для 5- и к-рецепторов ее значения были приравнены 0 (отсутствие сродства), 1 (сродство имеется) и 2 (явно выраженная аффинность); для ц-рецепторов - 1 (слабое сродство), 2 (сродство средней выраженности) и 3 (явно выраженное преимущественное связывание).
