Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Аллозимные спектры глюкозо-6-фосфат изомеразы у полидорид (Polychaeta: spionidae) и возможные механизмы их формирования Панькова Виктория Владимировна

Аллозимные спектры глюкозо-6-фосфат изомеразы у полидорид (Polychaeta: spionidae) и возможные механизмы их формирования
<
Аллозимные спектры глюкозо-6-фосфат изомеразы у полидорид (Polychaeta: spionidae) и возможные механизмы их формирования Аллозимные спектры глюкозо-6-фосфат изомеразы у полидорид (Polychaeta: spionidae) и возможные механизмы их формирования Аллозимные спектры глюкозо-6-фосфат изомеразы у полидорид (Polychaeta: spionidae) и возможные механизмы их формирования Аллозимные спектры глюкозо-6-фосфат изомеразы у полидорид (Polychaeta: spionidae) и возможные механизмы их формирования Аллозимные спектры глюкозо-6-фосфат изомеразы у полидорид (Polychaeta: spionidae) и возможные механизмы их формирования Аллозимные спектры глюкозо-6-фосфат изомеразы у полидорид (Polychaeta: spionidae) и возможные механизмы их формирования Аллозимные спектры глюкозо-6-фосфат изомеразы у полидорид (Polychaeta: spionidae) и возможные механизмы их формирования Аллозимные спектры глюкозо-6-фосфат изомеразы у полидорид (Polychaeta: spionidae) и возможные механизмы их формирования Аллозимные спектры глюкозо-6-фосфат изомеразы у полидорид (Polychaeta: spionidae) и возможные механизмы их формирования
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Панькова Виктория Владимировна. Аллозимные спектры глюкозо-6-фосфат изомеразы у полидорид (Polychaeta: spionidae) и возможные механизмы их формирования : spionidae) и возможные механизмы их формирования : дис. ... канд. биол. наук : 03.00.15 Владивосток, 2006 108 с. РГБ ОД, 61:07-3/101

Содержание к диссертации

Введение

2. Обзор литературы 8

2.1. Общепринятая концепция изоферментов 8

2.1.1. Аллельные изоферменты 8

2.1.2. Изоферменты, определяемые разными генами 10

2.1.3. Гибридные изоферменты II

2.1.4. Вторичные изоферменты 12

2.2. Новые механизмы генерирования множественности белковых изформ 14

2.2.1. Альтернативный сплайсинг 14

2.2.2. Использование альтернативных сайтов инициации транскрипции и полиаденилирования 20

2.2.3. Редактирование мРНК 22

2.2.4. Альтернативная инициация трансляции 22

2.3. Альтернативный сплайсинг ферментных генов 23

3. Материалы и методы 30

4. Результаты 35

4.1. Изоферментные спектры ГФИ полидорид 35

4.1.1. Polydora brevipaipa 39

4.1.2. Polydora calcarea 45

4 Л .3. Polydora manchenkoi 49

4.1.4. Polydora limicola 50

4.1.5. Polydora glycymerica 53

4.1.6. Polydora cornuta 56

4.1.7'. Dlpolydora commensalis 59

4.1.8. Dipolydora bidentata 63

4Л.9. Dipolydora carunculata 66

4 Л .10 Dipolydora cardalia 68

4.2. Доля идентичных аллозимных спектров ГФИ-1 и ГФИ-2 70

Обсуждение 72

5.1. Трудности интерпретации изоферментных спеюров ГФИ полидорид с позиций общепринятой концепции изоферментов 72

5.1.1. Характер аллозимной изменчивости изоферментов ГФИ-1 иГФЙ-2 72

5.1.2. Сопряженность экспрессии изофермента ГФИ-2 с полом и тканепецифичность экспрессии изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2 73

5.1.3. Большое электрофоретическое различие изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2 76

5.1.4. Формирование межлокусных гибридов ГФИ-1/ГФИ-2 76

5.2. Альтернативный сплайсинг - механизм, способный генерировать изоферментные спектры ГФИ, наблюдаемые у полидорид 78

5.2.1. Согласованность аллозимной изменчивости альтернативных изоферментов 78

5.2.2. Большое электрофоретическое различие альтернативных изоферментов 83

5.2.3. Тканеспецифичность экспрессии альтернативных изоферментов и возможная роль альтернативного сплайсинга в детерминации пола полидорид 83

5.2.4. Гибридизация альтернативных изоферментов 86

5.3. Возможное ретропозонное происхождение изофермента ГФИ-2 87

Выводы 88

Список литературы 89

Введение к работе

Актуальность проблемы. Изоферменты - множественные молекулярные формы одного и того же фермента, давно и успешно используются в качестве маркеров генов в различных областях биологии и медицины. Наиболее широкое применение они нашли в популяционной генетике для исследования генетической изменчивости природных популяций и видов. Ключевым моментом в использовании изоферментов как маркеров генов является ясная генетическая интерпретация результатов ферментного электрофореза. Однако, в литературе описано много необычных изоферментных спектров, не нашедших обоснованного и убедительного объяснения. К числу таких случаев относится недавно описанный необычный электрофоретическии спектр димерного фермента глюкозо-6-фосфат изомеразы (ГФИ) у полихеты Polydora brevipalpa (Polychaeta: Spionidae) (Manchenko, 2001). Анализ таких спектров, трудных для традиционной интерпретации, представляется важным и своевременным.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в выяснении молекулярных механизмов формирования изоферментных спектров ГФИ у полидорид (Polychaeta: Spionidae).

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

  1. Исследовать изоферментные спектры ГФИ у десяти видов полидорид (Polychaeta: Spionidae).

  2. Исследовать сопряженность экспрессии изофермента ГФИ-2 с полом у десяти видов полидорид.

  3. Исследовать тканеспецифичность экспрессии изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2.

Научная новизна работы. Проведено электрофоретическое исследование изоферментных спектров глюкозо-6-фосфат изомеразы (ГФИ) у десяти видов полидорид родов Polydora и Dipolydora (Polychaeta: Spionidae), ранее не исследованных в этом отношении. Установлено, что у всех исследованнных видов полидорид экспрессируется два изофермента (ГФИ-1 и ГФИ-2), один из которых (ГФИ-2) экспрессируется только у самцов. Проведено исследование тканеспецифичности экспрессии изоферментов ГФИ. Показано, что изофермент ГФИ-1 экспрессируется преимущественно в соматических тканях у особей обоих полов и в незначительных количествах в диплоидных сперматогенных клетках самцов. Изофер-

мент ГФИ-2 экспрессируется в диплоидных сперматогенных клетках самцов. Установлен факт гибридизации изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2 у всех исследованных видов. Показано, что у каждого из исследованных видов полидорид, среди особей, экспрессирующих оба изофермента, преобладают те, которые имеют идентичные аллозимные спектры ГФИ-1 и ГФИ-2. Впервые сделана оценка доли таких особей у 10 исследованных видов.

Впервые получены данные, свидетельствующие в пользу гипотезы о том, что альтернативный сплайсинг (АС) способен генерировать изоферменты, которые на электрофоретических гелях могут быть неотличимы от классических изоферментов, определяемых разными генными локусами.

Теоретическая и практическая ценность работы. Полученные данные, говорящие о том, что изоферменты ГФИ полидорид генерируются АС, послужат важной предпосылкой для формулирования положений новой концепции изоферментов, учитывающей важную роль АС в их генерировании. Это составит основу для ясной генетической интерпретации электрофоретических данных и подтвердит для изоферментов статус надежных генных маркеров.

Апробация работы и публикации. Основные положения работы докладывались на IV Региональной конференции по актуальным проблемам морской биологии и экологии (Владивосток, 2001); Международной конференции: «Evolution, Genetics, Ecology and Biodiversity» (MAPEEG) (Владивосток, МБС «Восток», 2001), VII Дальневосточной молодежной школе - конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, МЭС ТИБОХ, 2003) и ежегодных научных конференциях Института биологии моря (Владивосток, 2004, 2006). По теме диссертации опубликовано 9 работ.

Структура и объем работы. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 209 ссылок. Диссертация изложена на 108 страницах, содержит 4 таблицы и 43 рисунка.

Общепринятая концепция изоферментов

Первые обобщения генетических основ и молекулярных механизмов формирования изоферментов были сделаны еще в середине 60-х годов (Shaw, 1965), а к концу 70-х формирование генетической концепции изоферментов было практически завершено (Harris and Hopkinson, 1976; Корочкин и др., 1977). Согласно этой концепции, основными факторами, определяющими изоферментные и алло-зимные спектры, выявляемые у диплоидных организмов, являются: (1) число генов, определяющих фермент, (2) гомо- или гетерозиготное состояние электрофо-ретически выявляемых аллельных вариантов этих генов, (3) субъединичная структура ферментных молекул, (4) способность изоферментов формировать гибриды in vivo и (5) постгрансляционные модификации, приводящие к возникновению вторичных изоферментов.

Более детальное описание возникновения разнообразных типов изоферментов, выявляемых с помощью электрофореза, дано ниже.

Аллельные изоферменты или аллозимы представляют собой варианты одного и того же фермента, определяемые разными аллелями одного генного локуса. Аллозимные спектры, выявляемые на зимограммах при электрофоретическом анализе выборки особей одного вида, определяются состоянием аллелей соответствующего генного локуса (гомо- или гетерозиготным), а также субъединичной структурой ферментных молекул (мономерной, димерной, тримерной, тетрамер-ной т.д.). У гомозигот, независимо от субъединичной структуры фермента, формируется (и выявляется на зимограмме) один аллозим (Рис. 1). У гетерозигот, у которых экспрессируется два разных аллеля, синтезируется две формы полипептидов. В случае мономерных ферментов аллозимные спектры гетерозигот представлены смесью двух аллозимов - каждый от соответствующего гомозиготного родителя. В случае олигомерных ферментов, у гетерозигот, помимо двух гомо-мерных аллозимов, присутствует разное число гетеромерных аллозимов гибридной природы: один - если фермент димер; два - если тример; три - если тетрамер и т.д. Симметричные аллозимные спектры, как изображено на Рис.1, наблюдаются в том случае, когда аллельные гены экспрессируются в равной мере, синтезируемые ими полипептиды (субъединицы) делают одинаковый вклад в ферментативную активность и объединяются в олигомерные молекулы случайно и без ограничения. В этом случае, у гетерозигот соотношения интенсивности окрашивания аллозимов на зимограммах, будут; 1:1 -для мономеров, 1:2:1 -для димеров, 1:3:3:1 - для тримеров, 1:4:6:4:1 - для тетрамеров и т.д., т. е. они будут подчиняться биномиальному распределению, отражающему случайный характер ассоциации субъединиц, определяемых разными аллелями. Если аллели экспрессируются в разной мере, и один тип субъединиц синтезируется в меньших количествах, соотношение гибридных аллозимов будет отличаться от биноминального.

Многие ферменты кодируются не одним, а несколькими генами, расположенными в одной или даже разных хромосомах. Множественные генные локусы, определяющие похожие, но структурно отличные полипептиды, возникают в результате генных дупликаций, постоянно происходящих в ходе эволюции (Оно, 1973). Подавляющее большинство ферментов представлено двумя и более изо-ферментами. В связи с тем, что регуляция экспрессии разных генных локусов осуществляется независимо, то ферментные продукты этих генов могут экспрес-сироваться одновременно в одной клетке, но иметь разную внутриклеточную локализацию (например, митохондриальные и цитоплазматические формы ферментов), экспрессироваться в клетках разных тканей или в клетках одной и той же ткани, но на разных стадиях развития (например, лактатдегидрогеназа) (Harris and Hopkinson, 1976; Moss, 1982). Субъединицы (полипептиды) изоферментов, соответствующих разным генным локусам, как правило, сильно отличаются друг от друга по первичной последовательности (многочисленные замены отдельных аминокислот, делеции и вставки), что может отражаться в изменении их размеров и заряда. Поэтому изоферменты, определяемые разными генами, как правило, имеют большие электрофоретические различия.

Продукты разных генных локусов, определяющих олигомерные ферменты, могут ассоциировать и образовывать гибридные изоферменты. Наличие гибридных изоферментов значительно усложняет электрофоретические спектры олиго-мерных ферментов по сравнению со спектрами ферментов, молекулы которых являются мономерами.

Новые механизмы генерирования множественности белковых изформ

Стремительное развитие методов молекулярной биологии и генетики за последние 25 лет способствовало мощному всплеску исследований, направленных на изучение структуры эукариотических генов и механизмов их экспрессии. Стала очевидной важная роль этих механизмов для обеспечения структурного и функционального разнообразия белковых изоформ. Механизмы генерирования белковых изоформ можно разделить на транскрипционные (использование альтернативных промоторов или сайтов инициации транскрипции), посттранскрип-ционные (использование альтернативных сайтов полиаденилирования, редактирование РНК и альтернативный сплайсинг) и трансляционные (использование альтернативных сайтов инициации трансляции). Такая классификация условна, так как появляется все больше данных о том, что функционирование механизмов, отнесенных выше к посттранскрипционным, сопряжено с транскрипцией и что все механизмы, связанные с экспрессией генов, тесно связаны между собой (Cramer et al., 1997; Goldstrohm et al., 2001; Caceres and Kornblihtt, 2002). Для удобства изложения, мы рассмотрим новые механизмы генерирования изофер-ментов по отдельности, хотя в живой клетке их функционирование тесно сопряжено в пространстве и времени. Основное внимание будет уделено механизму альтернативного сплайсинга, который является основным источником белкового разнообразия многоклеточных эукариот (Graveley, 2001; Maniatis and Tasic, 2002; Black, 2000,2003; Stamm et al., 2005).

В 1977 году, в результате сравнительного анализа структуры ДНК и соответствующей мРНК, группой ученых, возглавляемой американскими исследователями Ричардом Робертсом и Филиппом Шарпом, было сделано открытие мозаичной структуры генов. Оказалось, что в состав эукариотических генов, наряду с кодирующими последовательностями — экзонами (от англ. expressing zone), входят некодирующие последовательности — интроны (от англ. intervening zone). Такой тип структурной организации обнаружен для большинства генов эукариот.

Было установлено, что доля генов, имеющих экзон-интронную структуру, возрастает по мере усложнения эукариотических организмов. Так, у одноклеточных эукариот (дрожжей) только 4% генов имеют экзон-интронную структуру (Lopez and Seraphin, 2000). У человека доля таких генов достигает 95% (Fedorova and Fedorov, 2003). В среднем человеческий ген содержит 5-6 экзонов. Суммарная длина интронов может превосходить суммарную длину экзонов в десятки и сотни раз. Интроны транскрибируются наравне с экзонами, так что первичные транскрипты представляют собой гигантские предшественники - пре-мРНК, которые содержат последовательности соответствующие и экзонам, и интронам. Перед выполнением своих функций эти предшественники должны претерпеть многочисленные изменения, называемые котранскрипционными и посттранскрипционными модификациями или процессингом мРНК. В ходе процессинга пре-мРНК, интроны вырезаются, а экзоны ковалентно сращиваются друг с другом «конец в конец», образуя молекулу зрелой мРНК, которая непосредственно участвует в трансляции. Процесс распознавания, удаления интронов и сшивания экзонов получил название сплайсинга (от англ. splice - соединять концами) (рис.2).

Схематичное изображение сплайсинга. Э - экзон, И - интрон.

Сплайсинг происходит при участии сложного многокомпонентного нуклео-протеидного комплекса - «сплайсеомы», в состав которого входят пять молекул малых ядерных РНК (snRNA) и более 145 общих факторов сплайсинга белковой природы (Zhou et al., 2002). Для прохождения реакций сплайсинга, этот функциональный комплекс должен распознать на пре-мРНК места соединения интронов и экзонов, в которых происходит разрыв пре-мРНК во время сплайсинга, и точку разветвления - остаток аденозина в консервативной последовательности нуклео-тидов интрона, расположенный ближе к его З -концу (рис. 3). Места соединения интронов и экзонов, в зависимости от их положения в интроне называют 5 - или З -концевыми сайтами сплайсинга (донорный и акцепторный сайты сплайсинга, соответственно). Полигшримидиновая последовательность (Ру)п перед 3 -концевым сайтом сплайсинга существенна для правильного вырезания интронов. Большинство интронов начинается с GT и заканчивается AG (так называемые GT-AG интроны). Для некоторых генов хорошо известны исключения, когда в сайтах сплайсинга встречаются GC-AG и АТ-АС.

В настоящее время у многоклеточных известны два типа сплайсеосом: мажорный - U2 и минорный -Ш2. Сплайсеосомы Ш гипа распознают интронные сайты сплайсинга, содержащие GT-AG (и GC-AG) последовательности. Сплайсеосомы Ш2-типа распознают интронные сайты сплайсинга, содержащие АТ-АС и GT-AG последовательности.

Процесс сплайсинга протекает в две стадии. Сначала происходит расщепление фосфодиэфирных связей в донорном (5 ) сайте сплайсинга, что приводит к отделению З -конца экзона 1 от молекулы РНК. Освободившийся в результате разрыва 5р-конец интрона ковалентно соединяется с аденином - точкой разветвления (branch point), образуя петлю (структура типа «лассо» (lariat)). На втором этапе, происходит ковалентное соединение экзонов и освобождение интрона с петлей на 5 -конце (Maniatis and Tasic, 2002).

Сплайсинг, который приводит к образованию одного типа мРНК, содержащих все экзоны данного гена, получил название «конститутивного». Однако, в подавляющем большинстве случаев, в результате сплайсинга пре-мРНК эукариот образуются мРНК, различающиеся по своей первичной структуре. Такой тип сплайсинга получил название «альтернативного» (АС).

Выделяют пять различных классов событий АС (Рис. 4): 1) Альтернативное использование кассетных экзонов. Кассетные экзоны могут включаться или не включаться в состав мРНК, но окружающие их интроны неизменно удаляются в течение сплайсинга. 2) Использование взаимоисключающих экзонов. В состав мРНК попадает какой-то один из пары экзонов, но никогда оба. Однако оба экзона никогда вместе и не исключаются из состава мРНК. 3) Использование альтернативных донорных (5 ) сайтов сплайсинга. Для сплайсинга используются 5 -сайты сплайсинга, находящиеся внутри последовательностей экзонов или интронов. Сплайсинг по таким сайтам приводит к укорочению экзона или включению в состав мРНК части смежного интрона. 4) Использование альтернативных акцепторных (3 ) сайтов сплайсинга. 5) Сохранение интрона. Случай, когда интрон является «необязательным» для сплайсинга и оставляется в мРНК.

Изоферментные спектры ГФИ полидорид

Электрофоретические исследования изоферментных и аллозимных спектров ГФИ проведены на 10 видах полидорид (Таблица 1). У всех исследованных видов выявлены спектры ГФИ, которые имеют ряд общих характеристик:

1) Электрофоретический спектр ГФИ представлен двумя изоферментами щ ГФИ-1 и ГФИ-2.

2) Изоферменты ГФИ-1 и ГФИ-2 демонстрируют аллозимную изменчи вость, типичную для димерных ферментов. Аллозимные спектры гомозигот представлены одной зоной, а спектры гетерозигот - тремя (рис. 7).

По характеру аллозимной изменчивости исследованные виды можно условно разделить на две группы. Первая группа представлена видами, все особи которых имеют идентичные аллозимные спектры, т.е. демонстрирующими согласованную аллозимную изменчивость изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2 (рис. 9). Вторая группа включает виды, которые имеют особей с неидентичными алло-зимными спектрами ГФИ-1 и ГФИ-2, и таким образом, демонстрирующие независимую аллозимную изменчивость (рис. 10).

В соответствии с общепринятым в генетике изоферментов представлением (Корочкин и др., 1977; Harris and Hopkinson, 1976; Richardson et al., 1986; Buth, 1990; Murphy et al., 1996), аллозимная изменчивость двух изоферментов считается независимой, если хотя бы одна особь в исследуемой выборке конспецифич-ных особей, демонстрирует разные аллозимные спектры у разных изоферментов.

Такое представление базируется на существующей генетической концепции изоферментов, в соответствии с которой независимую аллозимную изменчивость могут проявлять только изоферменты, определяемые разными генами. Результаты настоящей работы показывают, что генетическая изменчивость изоферментов ГФИ, выявленная у большинства видов полидорид, не может быть удовлетворительно объяснена, если исходить из принципов существующей концепции изоферментов (см. раздел Обсуждение).

Ниже приведены типичные зиммограммы ГФИ и отличительные характеристики спектров для каждого из исследованных видов.

Проанализированы спектры ГФИ у 1051 половозрелой особи (542 самца и 509 самок). Типичная зимограмма ГФИ P. brevipalpa представлена на рисунке 11. На зимограмме видно, что у самок спектр ГФИ представлен одним изоферментом ГФИ-1 (дорожки 5-9), а у самцов - ГФИ-1 и ГФИ-2 (дорожки 10, 11,13- 19). У некоторых самцов между изоферментами ГФИ-1 и ГФИ-2 были выявлены зоны гибридных молекул (ГФИ-1/ГФИ-2) (рис.11, дорожка 13). Исследование тканес-пецифичности экспрессии изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2 показало, что в препаратах соматических тканей самцов выявляется только изофермент ГФИ-1 (рис.11, дорожка 3), а препаратах спермы - только изофермент ГФИ-2 (рис.11, дорожка 4). В некоторых случаях в препаратах спермы присутствовала слабая зона изо-фермента ГФИ-1 и зона гибридного изофермента. Аналогичный анализ самок показал, что и в соматических тканях и в яйцеклетках у них экспрессируется изофермент ГФИ-1 (рис. И, дорожки 1,2).

Среди исследованных особей P. brevipalpa были обнаружены девиантные фенотипы ГФИ - самцы, у которых отсутствовал изофермент ГФИ-2 (рис.11, дорожка 12), и самки, у которых он, наоборот присутствовал. В общей сложности было выявлено 28 девиантных особей (14 самцов и 14 самок). Спектры, выявленные у особей с девиантными фенотипами ГФИ, схематически изображены на рисунке 12.

У большинства исследованных особей P. brevipalpa изоферменты ГФИ-1 и ГФИ-2 демонстрировали согласованную аллозимную изменчивость (рис. 11). Среди 542 особей, экспрессирующих оба изофермента (528 самцов и 14 девиантных самок), 535 имели идентичные аллозимные спектры ГФИ-1 и ГФИ-2. Разные аллозимные спектры изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2 имели только 7 особей (3 самца и 4 девиантные самки). Зимограмма, демонстрирующая неидентичность аллозимных спектров ГФИ-1 и ГФИ-2 у одного из самцов P. brevipalpa представлена на рисунке 13. Спектры ГФИ, выявленные у самок и самцов, демонстрирующих согласованную аллозимную изменчивость ГФИ-1 и ГФИ-2, схематически изображены на рисунке 14, у самцов и девиантных самок, демонстрирующих несогласованную аллозимную изменчивость ГФИ-1 и ГФИ-2 - на рисунке 15.

Трудности интерпретации изоферментных спеюров ГФИ полидорид с позиций общепринятой концепции изоферментов

Согласованная аллозимная изменчивость изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2 у всех самцов D. cardalia, D. carunculata, D. commensalis, P. manchenkoi соответствует представлению о том, что оба изофермента являются продуктами одного гена, т.е. один из них (ГФИ-1) является первичным изоферментом, а другой (ГФИ-2) - вторичным изоферментом, возникшим в результате посттрансляционной модификации молекул первичного изофермента ГФИ-1. В то же время P. brevipalpa, P. calcarea, P. cornuta, P. glycymerica, P. limicola, D, bidentata демонстрируют независимую аллозимную изменчивость изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2 (т.е. имеют особей с разными аллозимными спектрами изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2), характерную для изоферментов, определяемых дуплицированными генными локу-сами. Таким образом, создается впечатление, что у близких видов полидорид система ГФИ имеет разные генетические механизмы. У одних видов система изоферментов ГФИ представлена одним генным локусом, у других - двумя. При этом генетические основы системы изоферментов ГФИ оказываются одинаковыми у видов разных родов (Potydora и Dipolydora), и в то же время принципиально разными у видов одного и того же рода. Трудно найти объяснение тому, как в процессе эволюции двух групп близких видов для детерминации одинаковой системы изоферментов, характеризующихся одинаковой дифференциальной экспрессией, могли возникнуть две разные генетические системы.

Кроме того, спектры ГФИ у видов и с согласованной, и с независимой алло-зимной изменчивостью имеют особенности, которые также не находят объяснения. Во-первых, необычным оказалось то, что первичный (ГФИ-1) и вторичный (ГФИ-2) изоферменты D. cardalia, D. carunculata, D, commensatis, P. manchenkoi способны формировать гибридные молекулы. Имеющийся эмпирический опыт показывает, что гибридизоваться in vivo способны только первичные изоферменты (см. главу 5.1.4.). Однако, первичные изоферменты, определяемые разными генными локусами, никогда не проявляют согласованной аллозимной изменчивости. Во-вторых, даже у видов с независимой аллозимной изменчивостью изофер-ментов ГФИ значительная часть особей имела идентичные аллозимные спектры ГФИ-1 и ГФЙ-2. Доля таких особей варьирует от 55% до 98% (Таблица 3). Генетическая интерпретация такой ситуации, в частности для видов с более 90% особей с идентичными фенотипами ГФИ-1 и ГФИ-2 весьма затруднительна. Трудно найти объяснение возникновению и сохранению согласованной аллозимной изменчивости в двух независимых генных локусах у подавляющего большинства особей в двух независимых генных локусах. Вероятность этого чрезвычайно мала и практически нереальна для большого числа аллелей в каждом из генных локу-сов, даже если допустить их тесное сцепление. Таким образом, полученные результаты не могут найти удовлетворительного объяснения с позиций общепринятой концепции изоферментов.

Установлено, что у всех исследованных видов полидорид изофермент ГФИ-1 экспрессируется у всех особей, независимо от пола, а изофермент ГФИ-2, почти исключительно у самцов. Манченко (Manchenko, 2001b) было показано, что эта сопряженность экспрессии изофермента ГФИ-2 с полом у P. brevipalpa не является абсолютной. Были выявлены три девиантные самки, которые экспрессировали изофермент ГФИ-2, как нормальные самцы, и один самец, у которого изофермент ГФИ-2 отсутствовал. Реципрокный характер девиантных фенотипов ГФИ у разных полов P. brevipalpa послужил основанием для предположения о тесном сцеплении гена Sex, ответственного за определение пола, и гена Exgpi2, ответственно го за экспрессию изофермента ГФИ-2. Возникновение девиантных фенотипов объяснялось редкими событиями рекомбинации между этими генами (Manchenko, 2001b). Для проверки этой гипотезы мы продолжили исследование изофермент-ных спектров ГФИ этого вида. Увеличение объема исследуемой выборки подтвердило реципрокный характер девиантных фенотипов ГФИ у разных полов, свидетельствуя, таким образом, в пользу гипотезы о рекомбинантном происхождении таких фенотипов (Manchenko and Pankova, 2001; Панькова и Манченко, 2003). Выявлено 14 девиантных самцов и 14 девиантных самок. Принимая во внимание результаты, полученные Манченко (Manchenko, 2001b), общее число особей с девиантными фенотипами составило 32 (15 самцов и 17 самок). Соотношение 15:17 находится в хорошем соответствии с соотношением 1:1, ожидаемым для случая реципрокной рекомбинации.

Исследование тканеспецифичности экспрессии изофермента ГФИ-2 у самцов пяти видов полидорид (P. brevipalpa, P. calcarea, P. glycymerica, D. bidentata, D, commensalis) показало, что этот изофермент экспрессируется только в сперма-тогенных клетках, где он практически полностью замещает изофермент ГФИ-1. В некоторых случаях в препаратах спермы выявлялась слабая зона изофермента ГФИ-1. У всех исследованных видов спектры изофермента ГФИ-2 у гетерозиготных самцов представлены характерными для димерного фермента тремя зонами. Это свидетельствует о том, что аллельные изоформы ГФИ-2 формируют гибридные молекулы, и, следовательно, их экспрессия сопряжена в пространстве и времени. Таким образом, можно сделать вывод о том, что экспрессия изофермента ГФИ-2 происходит в диплоидных сперматогенных клетках (сперматогониях или сперматоцитах I), где в каждой отдельной клетке экспрессируются продукты обоих аллелей (Панькова и Манченко, 2003). Если бы изофермент ГФИ-2 экспресси-ровался в гаплоидных клетках (сперматоцитах II, сперматидах, или сперматозоидах), то экспрессия разных аллелей была пространственно разобщена на клеточном уровне, и гибридных аллозимов не формировалось. Однако мы не исключаем, что ГФИ-2, синтезируемый в диплоидных клетках, остается функциональным и в сперматозоидах. Наличие слабой зоны изофермента ГФИ-1 и зоны межизофер-ментных гибридных молекул ГФИ-1/ГФИ-2 в спектрах, выявленных в препаратах спермы, свидетельствует о том, что слабая экспрессия изофермента ГФИ-1 также происходит в диплоидных клетках этой ткани.

Слабая зона изофермента ГФИ-2, выявленная у самок P. manchenkoi и D. commensalis (см. гл. 4.1.3. и 4.1.7), а также присутствие гибридов ГФИ-1/ГФИ-2 у самок P. cornuta, P. limicola (см. гл. 4.1.4. и 4.1.6) свидетельствуют о том, что изофермент ГФИ-2 экспрессируется и у самок, однако намного слабее, чем у самцов. Необходимо отметить, что экспрессия изофермента ГФИ-2 у самок P. manchenkoi и D, commensalis отличается от экспрессии ГФИ-2, описанной для отдельных де-виантных самок P. brevipalpa (см.гл. 4.1.1.). Самки P. brevipalpa экспрессировали изофермент ГФИ-2 с той же интенсивностью, что и самцы, о чем свидетельствует равная интенсивность окраски зон этого изофермента. При этом были также выявлены и девиантные самцы, у которых изофермент ГФИ-2 полностью отсутствовал. Тогда как у P. manchenkoi и D. commensalis, самцов, не экспрессирующих изофермент ГФИ-2, не выявлено, а активность зон изофермента у самок намного ниже, чем у самцов.

Похожие диссертации на Аллозимные спектры глюкозо-6-фосфат изомеразы у полидорид (Polychaeta: spionidae) и возможные механизмы их формирования