Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 7
1.1. Множественные формы белков и их тканевая специфичность 7
1.1.1. Генетические механизмы возникновения и эволюции изоферментов 7
1.1.2. Внутриклеточная и тканевая специализация некоторых белковых систем у карпа 9
1.2. Генетический полиморфизм и наследование некоторых белков у карпа 17
1.2.1. Наследование аллельных вариантов ряда белковых систем у карпа 17
1.2.2. Полиморфные белковые системы в породных группах карпа 21
1.3. Применение электрофоретических белковых маркеров в рыбоводстве 26
1.3.1. Связь полиморфных белковых систем с хозяй-ственно-важными признаками прудовых рыб 26
1.3.2. Применение белковых систем в качестве маркеров в рыбоводстве 30
2. Материал и методика 33
2.1. Материал 33
2.2. Методика сбора образцов тканей, приготовления белковых экстрактов и проведения электрофореза 35
2.3. Методика окрашивания белков. Регистрация результатов 37
2.4. Математическая обработка данных 39
3. Эксжриментальная часть 40
3.1. Лактатдегідрогеназа » 40
3.2. Малатдегидрогеназа 46
3.3. Изоцитратдегилрогеназа 53
3.4. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа . 56
3.6. Ксантиндегидрогеназа . 67
3.7. Фосфоглюкомутаза 73
3.8. Эстеразы 80
3.9. Анализ сцепления генов некоторых полиморфных ферментов 85
4. Обсуждение 93
4.1. Гетерогенность ферментных систем у карпа . 93
4.2. Внутриклеточная и тканевая специализация изученных белков у карпа 94
4.3. Закономерности наследования некоторых ферментных систем у карпа 102
4.4. Генетическая характеристика различных породных групп карпа 109
Выводи из литература
- Множественные формы белков и их тканевая специфичность
- Наследование аллельных вариантов ряда белковых систем у карпа
- Методика сбора образцов тканей, приготовления белковых экстрактов и проведения электрофореза
- Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа
Введение к работе
Генетика изоферментов является одним из наиболее быстро развивающихся разделов современной генетики. Электрофоретический метод позволяет регистрировать гетерогенность белков и открывает новые возможности в выявлении и изучении отдельных генов, контролирующих синтез белковых молекул. Методы электрофоретическо-го разделения наследственно обусловленных вариантов белков широко используются в популяционной и эволюционной генетике, а также при проведении селекционных исследований.
Карп Cyprinus carpio является важнейшим объектом рыбоводства в СССР. Сравнительное генетико-биохимическое изучение пород карпа дает важные сведения о генетических процессах, протекающих в стадах культурного карпа. Электрофоретическиеварианты полиморфных белков широко применяются в качестве генетических маркеров в селекции. Поэтому обнаружение полиморфизма по белковым локусам у карпа, исследование генетической детерминации вариантов полиморфных белков, выяснение количества генов, определяющих синтез того или иного белка и тканевой специфичности действия этих генов, а также сбор материалов по частоте встречаемости различных генетических вариантов белка в разных породных группах карпа имеет важное теоретическое и практическое значение.
В задачу нашей работы входило:
Изучение тканевой специфичности некоторых ферментных локусов у карпа.
Выявление работающих в различных тканях карпа генов некоторых ферментных систем и нахождение ферментных систем, год- ных для популяционно-генетических и селекционных исследований.
3.Выяснение закономерностей наследования полиморфных белков у карпа и анализ сцепления генов, определяющих синтез этих белков.
4. Составление генетической характеристики ропшинской, местной краснодарской и казахстанской породных групп карпа.
В ходе этой работы нами были изучены новые полиморфные ферментные системы m и s МДГ, ol-ШД и КДГ. Исследование МДГ методом электрофореза в полиакриламидном геле позволило значительно расширить сведения о гетерогенности этой ферментной системы у карпа и выделить четыре локуса s -МДГ, два из которых полиморфны. Впервые был обнаружен полшлорфизм по одному из локу-сов митохондриальной малатдегидрогеназы. Модификация методики окрашивания позволила выявить дополнительные изоферменты фосфо-глюкомутазы. Получены дополнительные сведения о множественных формах других ферментов - ДЦГ, ИДТ, Г-6-ЩД и эстераз. Впервые был проведен анализ наследования генов s-Мдг-І, 8-МДГ-4, Г-6-фд, ос-Гфд-1, Кдг. Впервые исследовано сцепление генов ЛдгС-2, s-Мдг-І, а-Мдг-4, с^-Гфд-I, Кдг. Впервые получены данные о полиморфизме ряда ферментных локусов в породных группах местных краснодарских и казахстанских карпов, а также по некоторым ферментным локусам ( т-Мдг-2, б-Мдг*1, s-Мдг-4, d^-Гфд-І, Кдг) в группе ропшинских карпов.
Аллельные варианты изученных нами полиморфных белковых локусов могут быть использованы для маркирования племенного и селекционного материала, а также в популяционно-генетических исследованиях. Генетическая характеристика генофондов разных породных групп позволяет определять степень родства и филетичес-кие связи исследуемых пород.
ОБЗОР
ЛИТЕРАТУРЫ ЇШАЗЩЩ ЕАІЩД
Согласно классическому определению, плазмида - это внехромосомальный генетический элемент (15). Лаконичность определения подразумевает большое разнообразие свойств плаз-мид. При описании внехромосомальных генетических элементов используют следующие характеристики: особенности репликации, способность осуществлять собственный конъюгационный перенос, присутствие на шіазмиде специфических маркеров. Для удобства можно представить некую универсальную плазмиду, содержащую основные признаки внехромосомальных элементов:
Рис. I Универсальная плазмида из грам-отрицательиых бактерий. - б -
Диссертация написана на 133 страницах машинописного текста и иллюстрирована 30 рисунками и 25 таблицаїш. Она состоит из введения, литературного обзора, описания материала,методики, экспериментальной части, обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Список литературы включает 155 работ, из них 92 принадлежат зарубежным авторам.
В первом разделе обзора литературы рассматриваются вопросы происхождения множественных локусов ферментных систем и внутриклеточной и тканевой специализации ферментов. Второй раздел посвящен проблемам наследования некоторых белков у карпа. Третий раздел содержит сведения о практическом применении белков-маркеров в селекционно-генетической работе в рыбоводстве.
В главе, отведенной материалу и методике, описано происхождение исследованных рыб, дана методика сбора образцов, проведения электрофореза и окрашивания белков. Описаны математические методы обработки данных, использованных в работе.
Множественные формы белков и их тканевая специфичность
Один и тот же фермент в организме присутствует по большей части в виде нескольких вариантов - изозимов, или изоферментов. По своему происхождению изоферменты подразделяются на две основные группы: первичные и вторичные. Первичные изоферменты являются генетическими вариантами, то есть продуктами активности разных генов (собственно изоферменты) или разных аллелей одного и того же гена (аллоферменты) (Markert,Moller,1959;Prakash et al.,1969). Вторичные изоферменты представляют собой посттрансляционные модификации фермента (Салменкова,1973; Корочкин и др.,1977; Rother, 1980). Существование нескольких первичных изоферментов в организме обеспечивается наличием двух или более генов для синтеза одного и того же белка. Множественные гены возникают в результате полишюидизации генома или тандемных дупликаций отдельных участков хромосом. Дупликации, как правило, являются, следствием или неравного перекреста, или же разрыва хромосомы с последующей вставкой фрагмента хромосомы и воссоединением концов, дупликации играли большую роль в эволюции рыб и других организмов, являясь одним из основных источников обогащения генома новыми генами. Не меньшее значение у рыб имела в возникновении множественных генов белков полиплоидизация, так как при полишюидизации удваиваются не только структурные, но и регуляторные гены; это способствует самостоятельной эволюции дуплицированных генов. В дуплицированных генах со временем накапливаются различные для каждого гена мутации, давление естественного отбора оказывается для таких генов разнонаправленным, что может привести к постепенной их дивергенции.
Сохранение значительного сходства между дочерними генами приводит нередко к образованию "гибридных" изоферментов, состоящих из разных полипептидов. Месте с тем, возникновение различий в кинетических свойствах между гомологичными (дивергировавшими) изо-ферментами делает возмолшой их онтогенетическую, внутриклеточную и тканевую специализацию (Johnson,1976; Хочачка, Сомеро,1977). Именно наличие дуплищрованных дивергировавших генов для каждого из важнейших ферментов определяет во многом высокую тканевую специфичность изоферментов и сложные процессы онтогенетической диф-ференцировки многоклеточных организмов (Оно, 1973).
Различная экспрессия специализированных ферментных локусов в разных тканях достигается за счет особых регуляторних механизмов, развивающихся в процессе эволюции вида. Это наглядно можно продемонстрировать, сравнив низших рыб с более продвинутыми в эволюционном отношении группами. Так, у многих относительно примитивных рыб локус Дпг-С работает во многих тканях, а у высших костистых рыб ген С активен только в ретине или в печени (Маг-kert et al.,1975; Fisher, Whitt,1978). Очевидно, одновременно со специализацией локуса происходит формирование регуляторних механизмов, обеспечивающих проявление специализированного локуса в соответствующей ткани. Сходные результаты получены при изучении других локусов, в частности креатинкиназы (Fisher, Whitt,1978). малатдегидрогеназы, глицерол-3-фосфатдегидрогеназы и глюкозофос-фатизомеразы (Fisher et al.,1980).
Дуплицированные в результате полиплоидизации генома гены могут дивергировать, сохраняясь затем в течение длительного эволю ционного времени. Может протекать и другой процесс - один из двух генов может быть потерян (или разрушен) в результате утраты хромосомы, в которой он расположен, или в результате накопления мутаций, инактивирующих ген; возникают так называемые "нулевые" аллели и "молчащие" гены. У рыб процесс "умолкания" одного из дочерних локусов прослежен в нескольких подвергшихся полиплоидиза-ции таксонах. У карпа количество сохранивших активность дуплицированных локусов оказалось равным 52% (Ferris, Whitt,1977а), у наиболее специализированных чукучановых рыб число таких локусов снижено до 35%, у вьюновых - до 15-30% (Ferris, Whitt,1977b, 1977с).
Наследование аллельных вариантов ряда белковых систем у карпа
Электрофоретические картины большинства ферментов у карпа сложны и могут быть расшифрованы только с помощью специальных генетических исследований. Сложность электрофоретических спектров связана с наличием у карпа дуплицированных генов. К сожалению, только по некоторым ферментам к настоящему времени был проведен гибридологический анализ, и имеются сведения о наследовании аллельных вариантов.
Дактатдегидрогеназа у карпа кодируется пятью локусами: А, В1,В2,С1,С2. Гены ВІ и В2, СІ и С2, как мы уже отмечали, представляют собой .дупликации генов В и С, имеющихся у всех диплоидных видов семейства карповых (Klose et al.,1969; Ferris, Whitt, 1977a). Некоторые авторы считают дуплицированными также ген А (Hamoir et al.,1972; Ролле,1978).
Описаны аллельные варианты генов В1,С1 и С2. По гену BI наблюдается полшяорфизм, который рассматривается как результат наличия в стадах карпа "нулевого" аллеля, ВІ (Engei et al.,1973; Па-авер,І980). Некоторые авторы рассматривают этот случай как следствие совпадения подвижности мутантного гомотетрамера В1 и гомо-тетрамера В24 (Valenta et al.,1976) и отрицают гипотезу "нулевого" аллеля, так как наблюдается отсутствие различий в активности ДЦГ у экземпляров с разными фенотипами фермента. Гибридологический анализ вариантов гена BI подтвердил менделевское наследование аллелей этого гена (Valenta et al.,1977).
По локусам СІ и С2 обнаружено несколько генетических вариантов (Иванова и др.,1973; Shaklee et al.,1973; Valenta et al.,1976; Паавер,1980). Сопоставлять эти варианты трудно, так как работы были выполнены с использованием разных гелей - крахмального и поли-акриламидного, дающих несколько различающиеся спектры ДЦГ. Анализ наследования двух аллелей СІ проведен Валентой с сотрудниками (1978) и Паавером (1980); в последнем случае генотипы родителей не были известны. Менделевское соотношение фенотипов ДЦГ наблюдалось и в том, и в другом случае.
Малатдегидрогеназа. По литературным данным, ВДГ у карпа кодируется четырьмя локусами. Два локуса, А и В, контролируют синтез митохондриальной ЦЦГ, генетических вариантов по m-МДГ у карпа не обнаружено.
Два других локуса, также обозначаемые А и В, кодируют цито-плазматическую малатдегидрогеназу, работающую в различных тканях карпа. В отличие от других тетраплоидов семейства карповых, только два гена s-ВДГ были найдены у карпа - столько же, сколько и у диплоидных видов этого семейства (Aghasaden, Hitter,1971; Engel et al.,1975; Brody et al.,1976; Valenta,1977; Ferris, Whitt,1977a).
Для "быстрого" локуса s-ЭДЦГ описан аллельный вариант с меньшей электрофоретической подвижностью аллофермента (Brody et el., 1976; Valenta,l977). Индивидуальные скрещивания показали наличие менделевского наследования аллелей этого полиморфного локуса.
Изоцитратдегидрогеназа кодируется двумя мономорфными мито-хондриальными локусами (Engel et el.,1971; Engel et al.,1975) и двумя полиморфными цитоплазматическими локусами (Quiroz-Gutier-rez, Ohno,1970). На основе изучения электрофоретических спектров s- ИДГ сделан вывод о наличии у карпа трех аллелей у "быстрого" локуса и двух - у "медленного" локуса.
Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа. Число генов, кодирующих Г-6-ФД у карпа, окончательно не установлено. Одни авторы (Shearer, Mulley,1978; Бакош и др.,1978; Brody et al.,1979) предполагают моногенное наследование, другие (Паавер,1980) считают, что синтез фермента контролируется двумя локусами, один из которых полимор-\/ фен. Гибридологический анализ исследования изоферментов Г-6-ЩЦ не проводили.
6-фосфогдюконатдегидрогеназа у карпа кодируется, как мы отмечали раньше, двумя мономорфными локусами (Bender, Ohno,l968; Klose et al.,1969; Schmidtke, Engel,1975; Ferris, Whitt,1977a). В связи с различным проявлением активности изоферментов в разных тканях авторы предполагают тканеспецифичную генетическую регуляцию действия структурных локусов б-ФГД. сс-глицерофосфатдегидрогеназа. Данных по генетической изменчивости OL-ГФД у карпа нет. Группа исследованных по этому ферменту венгерских карпов оказалась мономорфнойг(Бакош идр.,1978).
Ксантиндегидрогеназа, по-видимому, кодируется одним локусом (Ferris, Whitt,1977а). Генетические исследования ВД1 у карпа не проводились.
Методика сбора образцов тканей, приготовления белковых экстрактов и проведения электрофореза
От всех рыб из потомств индивидуальных скрещиваний брали пробы белых мышц (в передней спинной части тела), селезенки, печени, мозга, а также сердце и хвостовой плавник. У рыб из некоторых скрещиваний прижизненно отбирали шприцем кровь из хвостовой артерии, гемолизат готовили с использованием антикоагулирующего раствора Сика (Салменкова, Малинина,197б). Отмытые эритроциты лизиро-вали дистиллированной водой, строму удаляли центрифугированием в течение 20 минут при 10 000 об/мин. Кроме гемолизатов в ряде случаев готовили сыворотку крови.
У производителей, использованных для скрещиваний, брали пробы хвостового плавника и крови прижизненно.
При изучении различных породных групп карпа у рыб использова ли пробы белых мышц, печени, плавников и сыворотки крови.
Образцы тканей упаковывали в специально приготовленные полиэтиленовые пакеты и хранили в жидком азоте до начала анализа.
Пробы гомогенизировали в равном объеме 0,25 М сахарозы, приготовленной на 0,001 М Трис-HOl буфере рН =7,5. При изучении митохондриальных ферментов добавляли тритон Х-100 (1%), при исследовании Г-6-ФД - -меркадтоэтанол и НАДФ. Экстракты центрифугировали с охлаждением до 4С при 15 000 об./мин. в течение 40-60 минут в центрифуге К-24. Супернатант в количестве 0,05 мл вносили в гель.
Для разделения изоферментов применяли блочную камеру для вертикального электрофореза в полиакриламидном геле конструкции В.А.Поспелова. Толщина геля составляла 1,3 мм, число лунок равнялось II или 19.
Гели готовили по рецепту, предложенному Маурером (Маурер, 1971). Использовали несколько буферных систем.
1) 0,15 М Трис - боратный (рН = 8,9) гелевый буфер, 0,066 М Трис-боратный ( рН = 8,9) электродный буфер. Эта буферная система представляет собой модификацию системы (Та-raauchi. et al.,1975) и применялась нами при исследова ,-нии глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы, 6-фоефогглюконатдегид-рогеназы и гексозо-6-фосфатдегидрогеназы.
2) Модифицированная буферная система (Салменкова,0мельченко, 1982), включающая 0,104 М Трис-борат-ЭДТА (рН= 8,4) гелевый буфер и 0,041 М Трис-борат-ЭДТА (рН = 8,4) электродный буфер. Использовали при разделении изоферментов фосфоглюкомутазы, ,-глицерофосфатдегидрогеназы, ксантин-дегидрогеназы, эстераз, 8-малатдегидрогеназы (s-МДГ-І и в-мдр-г). . .
3) Модифицированная буферная система (Baker et al.,1975), состоящая из 0,007 М Трис-лимонного ( рН= 6,7) гелевого буфера и 0,014 М Трис-лимонного (рН= 6,7) электродного буфера. Эту систему мы выбрали для разделения изофермен-тов изоцитратдегидрогеназы. 4) буферная система, описанная Маурером (1971) под № I, применялась при изучении лактатдегидрогеназы, малатдегидро-геназы ( s-ЩГ-З, Б-ЩГ-4, т-МДГ). При приготовлении геля для исследования фосфоглюкомутазы в раствор разделяющего геля до его полимеризации добавляли около 70 ед. глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы (Harrison,1974).
Разделение всех исследованных нами изоферментов проводили в 5% полиакриламидном геле. Использовали обычно источники питания УИЇЇ-І и ИП-500. В течение первых 20 минут электрофореза напряжение составляло 150 V, затем его увеличивали до 270 V для буферной системы 4); до 340V для систем I) и 3); 350, 430 V в системе буферов 2), напряжение 430 V мы использовали только для разделения изоферментов ксантиндегидрогеназы. Разгонка белков занимала соответственно 2,5 часа, 2 часа, 1,5 часа.
Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа
Основной субстрат глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (глюкозо-б-фосфат) могут использовать и другие ферменты - гексозо-6-фосфат-дегидрогеназа и б-фосфоглюконатдегидрогеназа. Необходимо было поэтому провести анализ расположения зон активности всех трех ферментов с использованием различных субстратов для их лучшей дифферен-цировки. б-фосфоглюконатдегидрогеназа содержится во всех исследованных тканях и движется в геле к аноду быстрее изоферментов Г-б-ФД. Зоны активности двух ферментов не перекрываются. Активность гек-созо-6-фосфатдегидрогеназы обнаруживается только в гомогенатах печени и в очень слабой степени в селезенке. По подвижности зона активности гексозо-6-ЩЦ совпадает с быстрой зоной активности Г-б-ФД. Гексозо-6-ЗЩ оказалась полиморфной у карпа, что осложняет анализ полиморфизма по Г-б-ЩЦ в тканях печени (рис.12).
Зона В характерна в основном для печени, но при избыточной концентрации ткани в экстрактах ее можно найти также в тканях селезенки и плавников. "Быстрая" зона (А) Г-6-ФД при анализе печени и всех других тканей кроме мозга имеет более или менее выраженный диффузный характер. Иногда удается заметить слабо выраженную "медленную" третью зону (С) (рис.13,14). Кроме основных полос при исследовании печени нередко выявляются и добавочные, расположенные в промежутках между В и С, и еще более медленные, чем С (рис.14).
Зоны активности А, В и С, по-видимому, представляют собою конформационные формы фермента. "Быстрые" и "медленные" генетические варианты зон А и В, а также зоны С, если она проявляется на электрофореграмме, обычно соответствуют друг другу. "Быстрому" варианту зоны А соответствует "быстрый" вариант зоны В и С, снижение активности фермента в зоне А ведет к уменьшению ее в зоне В, вплоть до полного исчезновения зоны (рис.15).
Распределение изоферментов зоны А варьирует при сопоставлении различных тканей. На электрофореграммах экстрактов селезенки и плавников фермент располагается в тех же местах, где и Г-6-ЩЦ экстрактов печени. Изоферменты, работающие в остальных тканях (сердце, мышцы, мозг, эритроциты), имеют меньшую электрофоретическую подвижность. При электрофорезе тканей мозга на фореграммах мы видим 5 тесно расположенных полос активности, эта зона активности в мозге мономорфна в отличие от зоны А, наблюдаемой в гелях при анализе экстрактов других тканей (рис.13,14).
По подвижности в гелях изоферменты зоны А печени и плавников дают сходную картину индивидуальной изменчивости. По-видимому, в этих тканях работает один и тот же локус Г-6-ФД, два аллеля кото рого обуславливают появление трех фенотипов: ЕЕ, ES и ss (рис.Ш Эритроцитарная Г-б-ФД имеет меньшую электрофоретическую подвижность, чем Г-б-ФД печени и плавников и представлена на электрофо-реграммах несколькими слабыми полосами активности, из которых одна (самая "быстрая") выражена сильнее. Полиморфизм по этой зоне активности не совпадает по своему характеру с полиморфизмом печеночной и плавниковой Г-6-ІД у одних и тех же экземпляров (рис.17). В связи с недостаточной активностью Г-б-ФД эритроцитов генетический анализ ее вариантов не проводился.
Для подтверждения предположения о моногенном наследовании Г-б-ЗЩ плавников и печени нами были проанализированы потомства от нескольких индивидуальных скрещиваний. У родителей и потомков фермент определяли в плавниках. Расщепление, наблюдавшееся в двух скрещиваниях, в общем соответствовало ожидаемому при допущении наличия одного локуса с двумя кодоминантными аллелями (табл.б).
Нужно, однако, отметить, что диффузное проявление фермента затрудняет интерпретацию картин, наблюдаемых в гелях. По этой же причине провести сравнение породных групп карпа по частотам аллелей локусов Г-6-ЩЦ не представилось возможным. ъ-ГЩ активна в тканях селезенки, печени, плавников, мозга и мышц (рис.18). В экстрактах селезенки и мозга активность фермента очень мала, уверенно описать спектры ct-ПЭД в этих тканях трудно, но, по-видимому, они тканеспецифичны. В печени фермент представлен слабой "медленной" зоной (Д), проявляющейся также при электрофорезе других тканей, и четырьмя более "быстрыми" полосами активности; две из них имеют слабое окрашивание. Активность OL-ГФД обнаружена на электрофореграммах экстрактов плавников, видна только одна зона Д (рис.18). В плавниках эта зона наиболее активна. Достаточную активность и хорошее разделение сл-ГФД мы наблюдали при электрофорезе мышц, спектр фермента состоит здесь из четырех зон. Зона Д сходна с такой же зоной в других тканях. Зона С включает четыре близкорасположенные друг к другу полосы, самая медленная из них обладает максимальной активностью. По расположению в геле эта зона сходна с печеночной зоной С, но спектр ее более сложен. Зона В, очень слабо проявляющаяся в печени и мозге, хорошо видна в гелях при электрофорезе экстрактов мышц. При этом на электрофореграммах зона В представлена двумя вариантами изофер-мента с подвижностями 1,00 и 0,95. Хорошо выражены три фенотипа с одной и двумя полосами активности (рис.19). По-видимому, варианты с двумя полосами активности представляют собой гетерозиготи, гибридный продукт в этом случае не образуется.
