Введение к работе
Актуальность проблемы. Большинство хозяйственно ценных признаков домашних животных имеют сложный полигенный тип наследования и контролируются многами генами, расположенными в локусах QTL (quantitative trait loci). Изучение комплексной молекулярной архитектуры QTL представляет интерес с точки зрения общей генетики (Mackay, 2001). Кроме того, данные о QTL могут быть использованы в практическом животноводстве для селекции с помощью молекулярных маркеров (marker assisted selection, MAS) (Tankey, 1993; Georges et al., 1995; Phillips, 1999; Зиновьева, 2009).
В предшествующие годы нами проведен ряд экспериментов по позиционному клонированию двух районов хромосомы 4 домашней курицы, содержащие QTL толщины скорлупы на 53 неделе жизни (ST53). Методом гибридологического анализа косегрегации микросателлитных ДНК-маркеров и количественных признаков определены маркеры интервалов генетической карты (районов хромосом), контролирующих QTL ST53. С использованием баз данных компьютерной сети Интернет показана локализация количественного признака ST53 в пределах интервала, ограниченного микросателлитными локусами MCW0114 и ADL0241. Определены координаты тринадцати клонов, имеющих гомологию последовательностей ДНК вставки с микросателлитными локусами MCW0114 и ADL0241. Проверка клонов на предмет наличия искомой последовательности методом ПЦР с использованием праймеров для микросателлитных локусов MCW0114 и ADL0241 позволила установить соответствие девяти ВАС-клонов локусу MCW0114 и четырех ВАС-клонов локусу ADL024I. Методом флуоресцентной гибридизации ДНК-ДНК in situ (FISH) установлена внутрихромосомная локализация ВАС-клонов, содержащих микросателлитные локусы. Установлено следующее положение микросателлитных маркеров локуса ST53 на GGA4(xpoMocoMa курицы 4): MCW0114 - 17.834.202-17.834.699 п.н. и ADL0241 - 16.643.314-16.643.645 п.н. Полученный интервал величиной 1,2 млн.п.н. является критическим для признака ST53.
Представленная работа посвящена анализу экспрессии и выявлению аллельных вариантов генов-кандидатов количественного признака толщина скорлупы яйца домашней курицы.
Цели и задачи исследования. Целью данной работы является анализу экспрессии и выявлению аллельных вариантов генов-кандидатов количественного признака толщина скорлупы яйца на 53-ей неделе жизни (ST53) курицы-несушки.
Поставлены следующие задачи:
изучение профилей экспрессии в тканях яйцевода 20-ти генов, являющихся позиционными кандидатами для количественного признака толщина скорлупы яйца на 53-ей неделе жизни (ST53) курицы-несушки
выявление корреляций экспрессии генов-кандидатов с толщиной скорлупы
ПЦР-амплификация регуляторних и кодирующих последовательностей генов, экспрессия которых связана с толщиной скорлупы
выявление сайтов мононуклеотидного полиморфизма (SNP) в пределах регуляторных и кодирующих последовательностей генов, экспрессия которых связана с толщиной скорлупы, путем секвенирования их последовательностей
поиск сайтов связывания транскрипционных факторов в выявленных полиморфных районах
анализ частот встречаемости аллелей выявленных полиморфных сайтов в группах с тонкой и толстой скорлупой
сравнение толщины скорлупы в различных генотипических классах по выявленным полиморфным сайтам.
Научная новизна работы. Амплификация на матрице кДНК из тканей яйцевода позволила установить наличие экспрессии 12 из 20 возможных генов-кандидатов на уровне разрешения ПЦР в реальном времени. Методом ПЦР в реальном времени проведен анализ экспрессии 12-ти генов-кандидатов. Выявлены достоверные на уровне значимости 0,01 двукратные различия между группами с тонкой и толстой скорлупой по уровню экспрессии последовательности CR523443. Коэффициент корреляции уровня экспрессии этого гена и толщины скорлупы составил 0,85. Выявлено 6 сайтов мононуклеотидного полиморфизма (SNP) в пределах последовательности CR523443, из них 5 - в регуляторной области (S2_I, S3_l, S3_2, S33 и S3_4) и 1 — в кодирующей (S6_l). Для всех полученных SNP выявлены сайты связывания транскрипционных факторов, присутствующие только в одном из аллельных вариантов, что дает основания считать их rSNP - регуляторными мононуклеотидными полиморфными сайтами. Методом ПЦР с использованием аллелеспецифических праймеров проведен анализ влияния обнаруженных rSNP на толщину скорлупы домашней курицы.
Теоретическая и практическая ценность работы. Результаты представленной к защите работы использованы при составлении баз данных по
генетическим и физическим картам хромосом КРС и сравнительным картам человека, мыши и КРС () и банка данных нуклеотидных последовательности! () в сети Интернет. Материалы диссертации используются при чтении лекций на кафедре естествознания и географии Ленинградского государственного университета им. А.С. Пушкина в рамках курсов «Генетика с основами селекции» и «Молекулярная биология».
Апробация работы. Материалы работы были представлены на международной научной конференции «Достижения в генетике, селекции и воспроизводстве сельскохозяйственных животных» (Санкт-Петербург, 2009), научно-практической конференции «Научные основы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных» (Ярославль, 2009), конференции "Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в АПК России" (Сергиев Посад, 2009), международной конференции «Функциональная геномика в повышении качества продукции животноводства» (Варшава, 2009). Результаты периодически докладывались на семинарах отдела молекулярной генетики и биотехнологии ГНУ ВНИИГРЖ РАСХН. Исследования проводили в соответствии с планом научно-исследовательской работы ГНУ ВНИИГРЖ РАСХН по теме «Разработать систему молекулярно-генетических маркеров, обеспечивающих повышение эффективности селекции сельскохозяйственных животных» (номер государственной регистрации 01.200.118843).
Публикация результатов. Материалы, представленные в диссертации, были опубликованы в научных журналах «Достижение науки и техники АПК», «Animal Science Pampers and Reports»" и "Russian Journal of Genetics". Всего no теме работы опубликовано 4 печатные работы, из них 3 статьи и 1 тезис.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста, включает 15 таблиц, 6 рисунков и состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материал и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы», «Практические предложения» и «Список литературы». Список цитированной литературы насчитывает 8 русских и 108 иностранных названий.
![Аллельные варианты генов-кандидатов подверженности туберкулезу у русского населения Западной Сибири [Электронный ресурс]](/i/i/4282/196247.png "Аллельные варианты генов-кандидатов подверженности туберкулезу у русского населения Западной Сибири [Электронный ресурс] Колоколова Ольга Валентиновна")
