Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Клинические и эпидемиологические особенности рассеянного
склероза 10
1.2. Ключевые аспекты этиологии и патогенеза PC 14
1.3. Основные стратегии генетического поиска при PC 23
1.3.1. Анализ регионов сцепления 25
1.3.2. Ассоциации генетических маркеров с подверженностью к рассеянному склерозу 26
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 47
2.1. Характеристика групп больных и контроля 47
2.2. Молекулярно-генетические методы исследования 50
2.2.1. Выделение ДНК из лейкоцитов венозной крови 50
2.2.2. Определение полиморфизма генов IL1B, ILIRN, IL12B, IL12RB1, IL10, TNFA, VDR 51
2.3. Генетико-статистические методы 56
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 58
3.1. Полиморфизм генов /LIB, ILIRN, IL12B, IL12RB1, ILIO, TNFA у больных PC 59
3.2. Полиморфные варианты гена VDR у больных PC 85
3.3. Гаметическое неравновесие между парами исследуемых
признаков. Влияние гаплотипов VDR на риск развития PC 99
Заключение : 105
Выводы по
Список литературы
- Основные стратегии генетического поиска при PC
- Ассоциации генетических маркеров с подверженностью к рассеянному склерозу
- Выделение ДНК из лейкоцитов венозной крови
- Полиморфные варианты гена VDR у больных PC
Введение к работе
Рассеянный склероз (PC) - заболевание с неясным механизмом развития и высокой гетерогенностью клинических проявлений. Как заболевание PC был выделен полтора века назад [Hafler et ah, 2005]. Ключевые моменты патогенеза - обязательное участие иммунной системы и влияние наследственных механизмов на развитие заболевания были отмечены Шарко еще в конце XIX века [Charcot, 1877]. Несмотря на значительный рост медицинских знаний за прошедшее время, до сих пор нет полного понимания этиологии и патогенеза этого заболевания. На сегодняшний день PC представляет собой серьезную медико-социальную проблему, приводящую к инвалидизации в молодом возрасте около 0,1 % белого населения Земли [Sadovnick, Ebers, 1993; Ebers, 2001; Murray, 2006].
За прошедшее время накоплено много данных о гетерогенности PC — разные типы и формы течения болезни, различные иммунопатогенетические механизмы развития, разные генетические профили при заболевании. При этом задачей исследователей при изучении данной патологии является понимание не только самого механизма развития, но и факторов, определяющих ту или иную форму заболевания, тип течения, клинические особенности проявления и даже ответ на проводимую терапию [Ebers, 2001; Oin, Duquette, 2003; Завалишин, Захарова, 2004; Frohman et ah, 2006; Murray, 2006].
Значительный вклад в изучение патогенеза PC внесли исследования на модели экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЭАЭ) и исследование роли системы главного комплекса гистосовместимости (HLA) в развитии болезни. Вместе с тем, сегодня становится все более ясным, что объяснить патогенез PC только лишь аутоиммунитетом и нарушениями работы системы HLA невозможно [Бойко, Фаворова, 1995; Chaudhuri, Behan, 2004; McElroy, Oksenberg, 2008; DeLegge, Smoke, 2008].
Co времени первых близнецовых исследований, доказавших роль наследственных факторов в развитии PC, генетика этого заболевания остается в фокусе научного интереса многих научных кругов [Гусев и др., 2001; Baranzini et al, 2002; Hafler et al, 2005; McElroy, Oksenberg, 2008]. Однако сегодня все больше ученых сходятся во мнении, что при PC возможность найти и выделить «главный» ген или гены «средней силы» минимальна [Chataway et al, 1998, Sawcer, 2008]. Необходимо отметить, что попытки поиска «главных» генов продолжаются до сих пор, однако большинство находок либо не специфичны для данного заболевания (например, гаплотипы HLA или недавно выявленные кластеры рецепторов интерлейкина-2 и 7) либо обладают спорной достоверностью (например, гены белков миелина или гены многих цитокинов) [Schmidt et al, 2007; The International Multiple Sclerosis Genetics Consortium, 2007]. В целом, накопление теоретических знаний и развитие генетических методов исследования все более подтверждает тезис, что только комплексная оценка генетических, эпигенетических и средовых факторов с использованием современных, мощных методов исследования позволят продвинуться к пониманию патогенеза рассеянного склероза [Baranzini et al, 2002; Ebers, 2008; Sawcer, 2008; Oksenberg et al, 2008].
В контексте комплексного исследования патогенеза PC важное место отводится роли генов цитокинов - растворимых регуляторных факторов, наряду с системой HLA определяющих генетический контроль иммунного ответа [Заргарова, Фаворова, 1999; Noseworthy et al, 2000; Коненков, Смольникова, 2003]. Участие цитокинов разнонаправленного действия в патогенезе PC многократно показано в экспериментальных исследованиях. При этом обсуждается их роль в развитии различных типов заболевания, скорости прогрессирования, интенсивности воспалительной реакции и других важных клинико-патогенетических характеристик PC [Calabresi, 2004].
Представляет интерес система витамина D — одного из немногих средовых факторов, чье влияние на развитие и протекание PC обосновано и доказано [Ebers, 2008]. Участие витамин D-зависимых механизмов в развитии данной патологии показано в эпидемиологических, клинических и экспериментальных исследованиях [Garcion et al., 2003; Munger et al, 2006; Brown, 2006; Islam et al, 2007; Cutolo, Otsa, 2008]. Наиболее вероятно, что воздействие витамина D на PC обусловлено его иммунорегуляторными свойствами, оказывающими влияние на патогенез болезни [Griffin et al, 2003; Cantorna et al, 2004]. Исследование полиморфных вариантов генов, вовлеченных в метаболизм витамина D, актуально при PC с позиций комплексного взгляда на патогенез болезни. Цель исследования:
Оценить вовлеченность полиморфных вариантов генов-модуляторов иммунного ответа в патогенез и клинический полиморфизм рассеянного склероза. Задачи исследования:
1. Изучить распространенность полиморфных вариантов генов-модуляторов иммунного ответа (IL1B, IL1RN, IL12B, IL12RB1, IL10, TNFA, VDR) у больных PC и здоровых русских Томской области.
2. Провести анализ ассоциации полиморфных маркеров указанных генов с PC и различными типами течения заболевания у мужчин и у женщин.
3. Провести анализ ассоциации изученных полиморфных вариантов с клиническими и лабораторными признаками у больных PC.
4. Сравнить структуру гаметического неравновесия по аллельным вариантам исследуемых генов у больных PC и в группе контроля.
5. Изучить распределение гаплотипов гена VDR у здоровых русских и у больных PC, провести анализ ассоциации гаплотипов VDR с PC.
Научная новизна:
Впервые проведена оценка влияния полиморфных вариантов комплекса генов иммунного ответа на риск развития PC, формирования типов его течения, а также клинических и патогенетических особенностей проявления болезни. Впервые выявлена ассоциация аллеля С полиморфного маркера А1188С гена IL12B с рассеянным склерозом и неблагоприятным течением заболевания. Полиморфный вариант С27250Т гена IL12RB1 впервые изучен при PC. Выявлена ассоциация данного полиморфизма с показателями, характеризующими воспалительный процесс при PC. Впервые при PC проведена оценка роли гаплотипов гена VDR как фактора, предрасполагающего к заболеванию. Исследована частота гаплотипов VDR у русских, установлен рисковый гаплотип (Bft) и протективный (bfT). Научно-практическая значимость;
Полученные данные об особенностях распределения частот аллелей и генотипов генов иммунного ответа у больных PC лиц дополняют фундаментальные сведения о генетической компоненте этого заболевания. Обнаруженные ассоциации генетических вариантов с самим заболеванием и его патогенетическими признаками служат основой для дальнейшего изучения механизмов воспаления, цитотоксичности и апоптоза в развитии PC. Установленные различия в распределении аллельных вариантов изученных генов у мужчин и женщин дополняют знания о тендерных особенностях возникновения и течения болезни.
С практической точки зрения, приводимая в работе информация может быть использована в генетической эпидемиологии PC. Сведения о связи полиморфных маркеров изученных генов с клиническими и патогенетическими проявлениями PC могут быть использованы для оценки характера течения патологического процесса у больных PC. Положения, выносимые на защиту;
1. Полиморфные варианты VNTRIL1RN, АГ188СIL12B, G(-308)A TNFA и T/t VDR являются одними из факторов риска развития рассеянного склероза у русских; маркеры G(-308)A гена TNFA и T/t гена VDR ассоциированы с PC только в группе мужчин, а маркер А1188С гена IL12B — только в группе женщин. Полиморфные варианты Al 188С1Ы2В и G(-308)A TNFA ассоциированы с показателями клинического течения PC (продолжительность первой ремиссии, степень инвалидизации) и параметрами, характеризующими воспалительный процесс при заболевании (IgG, IgM, СОЭ); с показателями воспаления также ассоциированы варианты VNTR IL1RN (IgG), С27250ТIL12RB1 (IgA, IgM, количество моноцитов), F/fn B/b VDR (IgG, СОЭ, количество CD 16+ клеток); полиморфный маркер T/t VDR ассоциирован с количественными признаками, характеризующими воспаление (количество HLA-DR+ клеток), цитотоксичность (количество эозинофилов, показатели НСТ-теста) и апоптоз (количество CD95+ клеток) при рассеянном склерозе. 3. Носители гаплотипа Bft гена VDR имеют повышенный риск развития PC. Апробация работы;
Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на IX Всероссийском съезде неврологов (Ярославль, 2006), 13-м конгрессе по приполярной медицине (Новосибирск, 2006), Межрегиональной научно-практической конференции «Молекулярно-клеточные аспекты патологии человека на Севере» (Якутск, 2007), Ежегодной конференции Европейского общества генетики человека (Барселона, Испания, 2008), Межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы неврологии» (Томск, 2008), межлабораторных научных семинарах ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН (Томск, 2005, 2007, 2008). Публикации.
По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 5 статей в рецензируемых журналах (из них 2 в журналах списка ВАК), 1 статья в сборнике, 5 тезисов в материалах отечественных конференций, 1 - в зарубежных.
Основные стратегии генетического поиска при PC
Можно выделить две основных стратегии для идентификации генов, определяющих генетическую предрасположенность к комплексным заболеваниям, таким как PC (рис 3). Первая - это проведение полного геномного сканирования с использованием панели анонимных генетических маркеров с известной хромосомной локализацией для идентификации областей генома, вовлеченных в развитие заболевания, с последующей идентификацией генов. Вторая - выяснение роли потенциального гена-кандидата, выбранного исходя из функции его белкового продукта в патогенезе заболевания [Пузырев, Степанов, 1997; Compston, 2000; Баранов и др., 2000; Baranzini et al, 2002].
Если между больными и здоровыми обнаруживаются статистически і достоверные различия по частоте генетического маркера, этот маркер считается ассоциированным с заболеванием. Однако, помимо прямой связи между исследованным локусом и наследственной патологией, в основе ассоциации может лежать неравновесие по сцеплению между маркерным локусом и локусом болезни [Сергеев и др., 2001]. Анализ сцепления прямо показывает роль генетического маркера в предрасположенности к заболеванию. Анализ сцепления проводится в семьях с пораженными сибсами. При этом оцениваются вероятности за и против сцепления в данной семье. Количественным показателем сцепления является логарифм отношения шансов за и против сцепления - лод-балл (от английского "logarithm of odds ratio"). Сцепление считается подтвержденным, если лод-балл превышает значение 3.0, что соответствует шансам в пользу сцепления 1000:1 [Пузырее, Степанов, 1997]. Более чуствительными для анализа сцепления являются TDT-тест (transmission-disequilibrium test), основанный на анализе передачи маркерного гаплотипа от гетерозиготных родителей больным и здоровым детям [Chataway et al, 1998] и исследования «по-примеси» (admixture scan), основанные на межпопуляционных отличиях кандидатных маркеров [Reich et ah, 2005].
Проведение полного геномного скрининга является информативным для идентификации областей генома, вовлеченных в развитие заболевания. Впервые геномный скриниг для PC был проведен в 1996 году тремя исследовательскими коллективами на выборках больных из Великобритании, США, Канады [Ebers et al, 1996; Sawcer et al, 1996; Haines et ah, 1996]. Годом позже полногеномный анализ сцепления был выполнен на больных из Финляндии [Kuokkanen et al, 1997]. По итогам четырех работ регионы сцепления были найдены на 14 хромосомах. Однако, для большинства локусов наличие сцепления и/или лод-балл отличались в различных популяциях [Bell et al., 1996]. Единственный локус, показавший устойчивое сцепление с заболеванием во всех исследованиях — регион 6р21 - место расположения генов комплекса HLA [Haines et al, 1998]. Тем не менее, проведенный в след за этим мета-анализ, позволил считать перспективными для рассмотрения регионы 17q, 19q и 20q [Wise et al, 1998].
В начале нынешнего десятилетия был проведен ряд полногеномых сканирований на различных популяциях [Corradu et al., 2001; Haines et al., 2002; Vitale et al, 2002; Kenealy et al, 2004]. В целом, в большинстве исследований подчеркивалось основное влияние локуса 6р21 и минорные эффекты регионов 5q, 17q , 19q и 22q [GAMES, 2003; Sawcer, 2005]. По некоторым предполагаемым ранее регионам сцепления в более поздних публикациях ранее полученные данные не подтверждаются, как например, в случае с локусом 19р [Vyshkina, Kalman, 2008]. Многие потенциально интересные регионы сцеплены с заболеванием только в совокупности с локусами системы HLA [Herrera et al, 2007; Yeo et al, 2007]. Тем не менее, поиск новых регионов продолжается с использованием новых маркеров и вовлечением большого количества исследовательских групп [Ramagopalan et al., 2007; Datta et al., 2007]. При этом использование TDT-теста и метода «по-примеси» позволяют находить новые потенциально сцепленные с заболеванием регионы. В частности, в первом проведенном исследовании «по-примеси» потенциальным регионом интереса была обозначена 1-ая хромосома [Reich et al., 2005]. В одном из последних геномных исследований, кроме региона 6р, сцепление с PC установлено для регионов lp, 2р, 3q, 12q, 17q и 19q. Недавнее исследование на основе TDT-теста с захватом более 300 тысяч потенциальных однонуклеотидных замен на выборке более чем 2000 больных показало особый интерес к регионам генов IL2R и IL7R и подтвердило связь гаплотипов HLA с заболеванием [The International Multiple Sclerosis Genetic Consortium, 2007]. Последний проведенный мета-анализ с использованием данных всех проведенных до этого момента геномных сканирований обозначил доказанное сцепление с заболеванием для региона 6р и вероятное для регионов 10q, 18р и 20р [Hermanowski et al., 2007].
Ассоциации генетических маркеров с подверженностью к рассеянному склерозу
Необходимо отметить, что большинство ассоциативных исследований, за исключением ассоциации с генами локуса HLA, имеют довольно скромные результаты, которые часто бывают противоречивы. Не исключено, что расхождение в выводах происходит из-за этнических различий в распределении аллелей, а также из-за разной степени внешнего влияния на развитие заболевания [Chataway et al, 1998; Sotgiu, 2004; Ebers, 2008]. Хотя гаплотипы HLA пока являются единственными локусами генома, очевидная роль которых в генетической предрасположенности к PC установлена, их вклад в развитие PC, как и других аутоиммунных заболеваний, возможно, является не единственным определяющим фактором [Becker, 1998; Oksenberg etal.,2008].
Известно, что кроме HLA важное место в формировании иммунного ответа при рассеянном склерозе занимают полиморфные гены цитокинов, их антагонистов и рецепторов. Подробное изучение полиморфной структуры цитокиновой сети, бесспорно, поможет в процессах разработки критериев оценки предрасположенности и резистентности к ряду комплексных признаков, к числу которых относится и PC. На уровне организма цитокины осуществляют связь между иммунной, нервной, эндокринной и другими системами и определяют их согласованное действие в регуляции защитных процессов. При этом очевидно влияние цитокинов на пролиферацию, дифференцировку и функциональную активность различных клеток. Важнейшая роль отводится цитокинам в регуляции специфического иммунитета и дифференцировке лимфоцитов-хелперов на клоны первого и второго типов [Заргарова, Фаворова, 1999; Стлмбирцев, 2002].
При PC характер воспалительного процесса более направлен в сторону Тхі-типа, однако, по всей видимости, иммунопатогенез этого заболевания более широк, чем только лишь Txl -обусловленное воздействие. Активное влияние на течение патологического процесса оказывают как цитокины, продуцируемые Txl (IL-1, 2, 12, IFNy, TNF а и р), так и Тх2 (IL-4, 5, 10, 13) [Calabresi, 2004; Mihailova et al, 2005].
Наиболее часто полиморфные варианты встречаются в интронных областях генов цитокинов, напрямую не изменяя аминокислотную последовательность, влияние этих участков может быть обусловлено изменением функциональных сайтов, контролирующих транскрипцию, созревание, транспортировку мРНК, а также стабильность белкового продукта. Промоторы многих генов цитокинов и рецепторов также высокополиморфны, аллельные варианты, расположенные здесь, могут влиять на степень экспрессии контролируемого гена. Полиморфизмы генов цитокинов составляют важное звено генетического контроля над деятельностью иммунной системы [Коненков, Смольникова, 2003].
Полиморфизм генов кластера ILL IL-1 - цитокин с наиболее широким диапазоном биологических и физиологических эффектов. Равновесие между продукцией, экспрессией и ингибированием синтеза белков семейства IL-1 играет одну из ключевых ролей в развитии, регуляции и исходе воспалительного процесса [Arend, 2002; Moynagh, 2005]. При PC IL-1 принимает участие в активации цитотоксических клеток и макрофагов, что приводит к разрушению миелиновой оболочки аксонов, либо может непосредственно вовлекаться в повреждение миелина [Заргарова, Фаворова, 1999] (см. рис. 2). IL-1 состоит из двух субъединиц IL-la и IL-ip, которые кодируются двумя различными генами {ILIA и IL1B, соответственно,), расположенными на второй хромосоме в кластере 2ql4, который помимо указанных генов содержит гены двух типов рецептора к IL-1 (IL1R1 и IL1R2), ген рецепторного антагониста IL-1 (IL1RN), а также еще как минимум шесть менее изученных членов семейства IL-1, включая IL-18 [Dunn et al, 2001; Громова, Симбирцев, 2005].
Наиболее биологически активен IL-1J3, конкурирующий с IL-IRa за специфическое связывание с рецептором. Ген IL1B имеет несколько полиморфных вариантов, в кодирующей части описан полиморфизм в пятом экзоне С (+3953JT, аллель Т (А2) которого ассоциирован с повышенной экспрессией гена [Wilkinson et al., 1999; Коненков, Смольникова 2003;
Громова, Симбирцее, 2005]. В связи со способностью ингибировать стимулирующие эффекты IL-1 интересно изучение полиморфизма гена IL1RN. Во втором интроне этого гена находится полиморфизм VNTR, обусловленный тандемным повтором участка из 86 п.о. от 2 до 6 раз [Tarlow et al, 1993]. Показано, что аллель А2 (2 повтора) как в гомо-, так и в гетерозиготном состоянии приводит к повышению продукции ILIRa [Wilkinson et al., 1999; Vamvakopotdos et al, 2002; Schrijver et al, 2003].
Целый ряд исследований посвящен поиску ассоциаций между инфекционными, аутоиммунными заболеваниями и генами кластера IL-1. В частности, есть данные об ассоциации варианта С (+3953)Т гена IL1B с периодонтитом, неспецифическим язвенным колитом, ревматоидным артритом, малярией, болезнью Альцгеймера и даже с неблагоприятным исходом беременности [Cantagrel et al, 1999; Walley, 2004; Громова, Симбирцее, 2005]. Полиморфный вариант VNTR гена IL1RN в разных исследованиях связан с анкилозирующим 1 спондилитом, сепсисом, туберкулезом, остеопорозом, шизофренией, аллопецией, онкологическими заболеваниями желудка и кишечника [Bellamy et al, 1999; Walley, 2004; Glas, 2004; Громова, Сішбирцев, 2005, Al-Moundhril, 2006].
Полиморфные маркеры генов ILIA, IL1B, IL1RN исследовались и при PC, однако результаты наблюдений неоднозначны. Так, на выборке больных из Нидерландов была показана ассоциация варианта С(+3953)ТIL1B и VNTR IL1RN с тяжестью течения заболевания [Schrijver et al, 1999, 2003]. Аналогичные данные получены в итальянском исследовании, при этом авторы установили зависимость исхода лечения р-интерфероном от полиморфизма ILIRN. [Sciacca et al, 1999, 2000]. Двумя годами раньше в финской популяции ассоциации данного маркера ни с заболеванием, ни с клиническими формами не обнаруживалось [Wansen et al, 1997]. В последующем исследовании из США ассоциации с заболеванием найдено не было, но была показана связь аллеля A3 VNTR ILIRN с меньшей степенью инвалидизации при PC [Kantarci et al, 2000].
Выделение ДНК из лейкоцитов венозной крови
Выделение ДНК проводили стандартным методом с использованием фенол-хлороформной очистки \Lahiri et ah, 1992]. К 0,7 мл крови, стабилизированной ЭДТА (0,1 мл 0,5М раствора ЭДТА на 1 мл крови), в эппендорф добавляли 0,8 мл 1 SSC, перемешивали, затем центрифугировали в течение 2 минут при 12000-13000 об/мин, после чего осторожно сливали супернатант. К осадку добавляли 1,4 мл lx SSC и сильно встряхивали, чтобы разбить осадок, после чего снова центрифугировали при 12000-13000 об/мин. в течение 2 минут. После центрифугирования супернатант сливали и последнюю каплю снимали фильтровальной бумагой. К осадку добавляли 270 мкл 0,2М натрия ацетата (рН 7,0), тщательно и долго перемешивали, встряхивали до полной гомогенизации на протяжении 6-10 минут. К содержимому добавляли 30 мкл SDS, перемешивали и оставляли на 1 час в термостате при температуре 37С, периодически перемешивая. Затем добавляли фенол-хлороформ (в соотношении 1:1) в равном объеме (примерно 300 мкл) и плавно перемешивали в течение 8-10 минут, после чего центрифугировали при 130000 об/мин 8 минут. После центрифугирования водную фазу (осторожно, не захватывая интерфазу) переносили в чистую пробирку эппендорф. К супернатанту в чистой пробирке эппендорф добавляли 1 мл 96% этилового спирта комнатной температуры, затем встряхивали для осаждения ДНК, после этого вращали пробирки для накручивания ДНК саму на себя. Затем центрифугировали в течение 2 минут при 12000 об/мин, чтобы комочек ДНК прилип ко дну пробирки, после чего осторожно сливали спирт. На следующем этапе добавляли 1 мл 70% этилового спирта, перемешивали, после чего центрифугировали при аналогичных условиях, затем спирт сливали. ДНК подсушивали на воздухе в течение 5-10 минут, добавляли 50 мкл деионизованной воды и оставляли на ночь для полного растворения ДНК. Выделенную ДНК замораживали и хранили при -20 С до проведения эксперимента.
Всего исследовано 9 полиморфных вариантов 7 кандидатных генов подверженности к PC. Из них - 3 полиморфизма гена VDR: F/f, B/b и T/t. В остальных генах исследовано по одному полиморфному варианту. Характеристика исследуемых вариантов представлена в таблице 6.
Генотипирование осуществляли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе (табл. 7). Смесь для ПЦР содержала 0,5-2,0 мкл специфической пары праймеров концентрацией 1 о.е./мл, 1,2-1,8 мкл 10х буфера для амплификации с концентрацией MgCb 0,5-2,0 mM, 0,5-1,0 е.а. Taq ДНК-полимеразы («Сибэнзим», Новосибирск) и 100-200 нг геномной ДНК. Смесь помещали в 0,5 мл пробирки типа «Эппендорф», наслаивали сверху минеральное масло для предотвращения испарения и амплифицировали в автоматических минициклерах «MJ Research» (США), «Терцик» (Россия), «БИС» (Россия). Исследование полиморфного варианта С27250Т гена IL12RB1 проведено в лаборатории молекулярной генетики НИИ медицинской гентетики к.б.н. Бабушкиной Н.П.
Программа амплификации включала предварительную денатурацию при 94С в течение 5 минут, с последующими 30-35 циклами отжига при специфической для каждой пары праймеров (1 мин), элонгации цепи при 72С (40 с) и денатурации при 94С (40 с). Программу завершала финальная элонгация при 72С в течение 3 минут.
Амплификат подвергали гидролизу соответствующей рестриктазой (табл. 7) при оптимальной для фермента температуре в течение 12-24 ч. Рестрикционная смесь включала 3-5 мкл амплификата, 1,0-1,2 мкл 10х буфера для рестрикции, поставляемого фирмой-производителем («Сибэнзим», Новосибирск), и 1-5 единиц активности фермента (в зависимости от эффективности его работы).
Распределения генотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли на соответствие ожидаемым при равновесии Харди-Вайнберга (РХВ) с помощью точного теста Фишера [Вейр, 1995]. Для сравнения частот аллелей между различными группами использовали критерий %2 с поправкой Йейтса на непрерывность.
Ожидаемую гетерозиготность рассчитывали по Nei [Nei, 1987]. Относительное отклонение ожидаемой гетерозиготности от наблюдаемой (D) рассчитывали по формуле: где habS и hexp - ожидаемая и наблюдаемая гетерозиготность соответственно.
Расчеты гаметического неравновесия между парами аллельных вариантов исследованных генов производили по Хилл [Hill, 1974]. Меру неравновесия по сцеплению D рассчитывали по Левонтину [Животовский, 1983].
Для анализа ассоциации маркеров исследуемых генов с PC использовали критерий х2 Пирсона с поправкой Йейтса на непрерывность при числе степеней свободы, равном 1, или точный тест Фишера-Ирвина при ожидаемом числе значений хотя бы в одной из ячеек таблицы сопряженности менее 5. Для анализа ассоциации маркеров исследуемых генов с количественными, патогенетически значимыми для PC, признаками, проводили сравнение средних значений уровней метрических показателей у носителей разных генотипов с помощью непараметрических тестов Манна-Уитни и Краскала-Уоллиса.
Степень риска заболевания для носителей аллеля (OR - отношение шансов, odds ratio) оценивали по формуле:
А1/Б1 где А и А1 — частота встречаемости одного аллеля у больных и здоровых лиц, Б и Б1 - частота альтернативного аллеля у больных и здоровых, соответственно. Для показателя OR рассчитывался также 95% доверительный интервал (CI - confidence interval) [Лакин, 1990; Гланц, 1999]. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в исследовании принимался равным 0,05.
Полиморфные варианты гена VDR у больных PC
В таблице 16 представлены частоты генотипов и аллелей трех изученных полиморфных вариантов гена VDR. В контрольной выборке не было выявлено отклонений при расчете соответствия наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому при РХВ. В группе больных было показано отклонение для варианта T/t (% = 7,487, р 0,01) за счет недостатка гетерозигот. Наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность составили соответственно 0,341±0,003 и 0,487±0,013. Интересно, что подобное отклонение от РХВ за счет недостатка гетерозигот нашли венгерские коллеги при исследовании сахарного диабета I типа \Gyorfjy et ah, 2002]. Причем отклонение в этой работе наблюдалась и для больных, и для контрольной группы, а частота редкого аллеля t в обеих группах была близка к таковой в нашей группе больных PC (0,410 — контроль, 0,450 — больные сахарный диабет, 0,420 — собственные данные, больные PC).
При сравнении распределений генотипов и частот аллелей в выборках больных и здоровых лиц статистически значимые различия наблюдались для того же полиморфного варианта T/t (%"— 5,86, р 0,05 для сравнения частот генотипов). Причем, при делении по типам течения PC, маркер оказывался ассоциированным с РРС (х —5,98 р 0,05), в то время как при прогрессирующих типах подобной связи не наблюдалось (табл. 17). Сравнение этого аллельного варианта в зависимости от пола показало ассоциацию только у больных PC мужчин (%2= 5,67, р 0,05 для сравнения частот генотипов) (табл. 18).
Во всех случаях ассоциация с PC обусловлена более высоким количеством гомозигот tt у больных по сравнению с контролем (рис. 28). Исключение составляет немногочисленная в нашей выборке группа больных с прогрессирующими типами течения болезни. Здесь генотип и встречался практически с той же частотой, что и в контроле (14,3% и 11,5%, соответственно). В работе из Австралии ранее сообщалось о подобной ассоциации полиморфного маркера T/t с PC [Tajouri et ai, 2005]. Интересно, что в австралийском исследовании частота аллеля t и генотипа tt у больных в общей выборке, также как и в данной работе, была достоверно выше, чем у здоровых (рис. 29). Однако при этом, в отличие от данных настоящего исследования, у австралийских коллег аллель t был ассоциирован с прогрессирующими типами течения. Было показано, что вероятность прогрессии заболевания возрастает в 3 раза при наличии у индивидуума аллеля t. Не исключено, что на различия в результатах повлиял малый размер выборки больных ППРС и ВПРС в нашем исследовании (п=14). Необходимо отметить, что для оценки вклада аллеля t в прогрессию заболевания, обе группы больных - томская и австралийская — недостаточно велики.
Подчеркнем, что данные о влиянии полиморфных вариантов гена VDR на продукцию белка VDR спорны. С одной стороны, сообщалось о зависимости стабильности мРНК белка рецептора витамина D от аллельных вариантов Taq полиморфизма, о зависимости продукции белка рецептора от аллелей Fok полиморфизма и ряда новых полиморфных вариантов [Morrison et al, 1994; Whitfield, 2001; Uitterlinden et al, 2004, 2006; Ukaji et al, 2007].
В недавней работе была показана связь нового полиморфизма rs3847987 в З -UTR гена с уровнем активной формы витамина D в плазме [Ramos-Lopez, 2006]. С другой стороны, имеется много данных о слабом воздействии или даже отсутствие такового полиморфизмов VDR на белковый продукт [Zmuda et al, 2000 Uitterlinden et al, 2004; Dusso et al., 2005]. Известно, что ассоциация генов с фенотипом болезни, а также ее отдельными признаками, может быть обусловлена не только вовлеченностью белковых продуктов маркерного гена в процесс формирования патогенеза заболевания, но и неравновесием по сцеплению с другими генами. Во втором случае изучаемый ген или его продукты могут быть не связаны с возникновением и развитием заболевания и его клиническими проявлениями. Ассоциация здесь . определяется дифференциальной приспособленностью носителей сочетаний генетического маркера с известным или предполагаемым геном (генотипом) изучаемого заболевания [Сергеев и др., 2001]. Кроме того, установление связи генетического маркера с признаком может быть результатом генетической подразделенностью популяции.
Относительно связи витамина D, PC и полиморфных вариантов гена VDR выстраивается интересная закономерность. Во-первых, имеется достаточно большое количество экспериментальных и клинических данных, отмечающих возможное участие витамина D и механизмов, им опосредуемых, в патогенезе PC. Сюда относятся эпидемиологические исследования, связывающие месяц рождения, особенности питания, уровень инсоляции в детстве [Salemi et al, 2000; Brown, 2006; Islam et al, 2007]. В ряде экспериментальных работ показано предупреждение развития заболевания и уменьшение его тяжести при уже сформированном процессе при назначении витамина D [Cantorna et al, 1996; Garcion et al., 2003 VanAmerongen et al., 2004]. И, наконец, показано, что витамин D может выступать в роли биологического ингибитора патологического воспалительного процесса при аутоиммунитете, а назначение витамина в некоторых исследования давало хороший результат при РРС [Wingerchuk et al., 2005; Arnson et al., 2007]. Считается, что лица, больные PC, физиологически нуждаются в большем количестве витамина D [Mahon et al., 2003].
![Аллельные варианты генов-кандидатов подверженности туберкулезу у русского населения Западной Сибири [Электронный ресурс]](/i/i/4282/196247.png "Аллельные варианты генов-кандидатов подверженности туберкулезу у русского населения Западной Сибири [Электронный ресурс] Колоколова Ольга Валентиновна")
