Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 16
1.1. Влияние загрязнений окружающей среды продуктами 16
нефтепереработки на живые системы
1.2. Кариологический анализ в эколого-генетических исследованиях 22
1.3. Врожденные морфогенетические варианты как индикатор загрязнения окружающей среды
1.4. Оценка полиморфизма генов для определения чувствительности организма к различным факторам
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 54
2.1. Объекты исследования 54
2.1.1. Населенные пункты 54
2.1.2. Эколого-географическая характеристика районов исследования 56
2.2. Методы определения загрязнения почв 56
2.2.1. Отбор проб почвы 56
2.2.2. Анализ проб почвы на содержание нефтепродуктов 57
2.2.3. Анализ проб на содержание тяжелых металлов 57
2.2.4. Анализ проб на содержание бенз(а)пирена 58
2.3. Исследование фитотоксичности почв, загрязненных нефтепродуктами
2.3.1. Объекты исследований 58
2.3.2. Исследование мутабельности у растений 59
2.3.3. Исследование соматических мутаций на тест-системе «Соя lycine max. (L.) Meril L.»
2.4. Тестирование исследуемых образцов почв на мутагенность в тесте Эймса
2.5. Методы оценки цитогенетического статуса детей 64
2.5.1. Формирование групп детей для обследования 64
2.5.2. Кариологический анализ буккального эпителия 65
2.7. Методы выявления, учета и оценки врожденных морфогенетических вариантов у детей
2.7. Анализ генов-кандидатов 68
2.7.1. Выделение ДНК 68
2.7.2. Полимеразная цепная реакция 69
2.8. Статистическая обработка результатов 71
ГЛАВА 3. Результаты исследования и обсуждение 73
3.1. Оценка состояния территории Чеченской Республики 73
3.1.1. Эколого-географическая характеристика региона 73
3.1.2. Уровень загрязнения почвы в изучаемых населенных пунктах Чеченской Республики
3.2. Определение генотоксичности нефтезагрязненной почвы 81
3.2.1. Определение цитотоксичности нефтезагрязненной почвы с использованием дикорастущих растений
3.2.2. Определение генотоксичности нефтезагрязненной почвы с использованием дикорастущих растений
3.2.3. Определение генотоксичности нефтезагрязненной почвы с использованием растительной тест-системы Соя Glycine max (L.) Merill.
3.2.4. Определение генотоксичности нефтезагрязненной почвы с использованием теста Эймса
3.3. Исследование цитогенетического статуса детей 102
изученных районов Чеченской Республики
3.3.1. Кариологические показатели буккального эпителия 103
3.3.2. Анализ взаимной сопряженности кариологических показателей с использованием корреляционного анализа
3.3.3. Влияние уровня нефтехимического загрязнения на показатели цитогенетического статуса детей Чеченской республики
3.3.4. Прогностическая оценка кариологических показателей в 127
качестве биомаркеров загрязнения среды
3.3.5. Формирование групп риска детей с учетом цитогенетического статуса
3.4. Исследование частоты врожденных морфогенетических вариантов у детей Чеченской Республики
3.4.1. Влияние загрязнения окружающей среды нефтепродуктами на формирование ВМГВ у детей
3.4.2. Зависимость врожденных морфогенетических вариантов от уровня загрязнения окружающей среды нефтепродуктами
3.5. Оценка полиморфных вариантов генов детоксикации ксенобиотиков, репарации и оксидативной защиты в Чеченской Республике
3.5.1. Изучение полиморфных вариантов генов детоксикации, репарации и оксидативной защиты у детей чеченской популяции
3.5.2. Однолокусный анализ сопряженности полиморфизма исследованных генов и цитогенетических показателей
3.5.3. Сопряженность ВМГВ с полиморфными вариантами генов детоксикации, репарации и оксидативной защиты
Заключение 166
Выводы 172
Использованная литература
- Врожденные морфогенетические варианты как индикатор загрязнения окружающей среды
- Эколого-географическая характеристика районов исследования
- Определение генотоксичности нефтезагрязненной почвы
- Зависимость врожденных морфогенетических вариантов от уровня загрязнения окружающей среды нефтепродуктами
Врожденные морфогенетические варианты как индикатор загрязнения окружающей среды
Показано, что небольшие дозы нефтяных загрязнений могут оказывать определенное стимулирующее действие на некоторые растения, что может зависеть также от характеристик почвенного состава (Зильберман и др., 2005).
При концентрации нефти в почве ниже 1% может усиливаться рост корневой системы, при этом отмечается увеличение ее объема, ассимиляционной поверхности, водоудерживающей способности, а также содержания хлорофилла в листьях. Повышение концентрации нефти от 1 до 5% приводит к ухудшению прорастания семян, при концентрациях нефти 6 - 8% семена пшеницы не прорастают. С увеличением концентрации нефти в почве снижается урожайность зерна и содержание в нем сырого протеина (Киреева и др., 2006; 2007).
По данным Чугуновой с соавт. (2011) показано, что содержание нефти в почве менее 0,6 л/м2 стимулировало рост овса полевого (Avena sativa). При этом наблюдалось достоверное увеличение биомассы выросших в первый вегетационный сезон растений почти в 3 раза, по сравнению с контролем. Последующее увеличение дозы нефтяного загрязнения (3,5 и 8,5 л/м2) привело к резкому достоверному угнетению растений – на 70 и 85% соответственно (Чугунова и др., 2011). Помимо непосредственного токсического воздействия компонентов нефти, одной из главных причин торможения развития растений, в частности, почвенных водорослей, и их гибели в загрязненных нефтью почвах является нарушение поступления воды, питательных веществ и кислородное голодание (Кабиров и др, 1982). В результате подавляется прорастание семян, рост подземной и надземной частей растений, задерживается их цветение, а цветки редко образуют семена (Фомченков и др., 1996).
Повышение содержания нефти в почве выше 10% вызывает токсический эффект не только на прорастание люцерны, пшеницы, редиса (Киреева и др., 2004), но так же негативно влияет на численность почвенных микроорганизмов. Более низкие дозы загрязнителя способствовали росту численности бактерий и грибов вследствие бурного развития углеводородокисляющей микробиоты (Киреева, Бакаева и др., 2004)
Токсическое действие на растения и почвенные микроорганизмы связано с легкими фракциями нефти, поэтому высокотоксичной является свежая нефть (Кузяхметов и др., 1985) и ее фракции: наиболее сильное воздействие оказывает толуол; бензин и дизельное топливо проявляют среднюю активность; тяжелые фракции, такие как моторное масло и гудрон, не оказывают заметного прямого ингибирующего воздействия на прорастание семян и развитие проростков тест-растений (Халимов и др., 1996).
На рост и развитие травянистых растений влияет не только количество нефти, но и ее состав, и темпы самовосстановления почв. Чем выше содержание в нефти легких фракций, тем выше ее токсическое действие на растения в первые годы загрязнения. Нефть, содержащая большие количества тяжелых парафинов, смолисто-асфальтовых веществ при низких дозах загрязнения оказывает не столь сильное влияние на травянистые растения, но при концентрации 7-15% значительно ингибирует рост растений (Хомякова, 2003; Фахрудинов, 2005; Ибрагимова и др., 2009; Чугунова и др., 2011). Многолетние растения более устойчивы к нефтяному загрязнению, чем однолетние, а наиболее чувствительными являются сельскохозяйственные растения (Соромотин и др., 1989; Фомченков, 1996).
Высшие растения, как системы биоиндикации, широко используемые при мониторинге загрязненных территорий, можно применять не только для оценки интегральной токсичности почв, загрязненных нефтью, но и для оценки генотоксичности. Растительные тест-системы широко используются для выявления генотоксичности различных загрязнений окружающей среды в результате деятельности человека (Гераськин и др., 2010; Реутова, 2008; Джамбетова, 2012; Grant, 1998; Kan et al., 1990; Kong et al., 1999; Rossi et al., 1995). Показано, что использование традесканции (Tradescantia) (клона 02) позволило выявить генотоксичность почв, загрязненных нефтью. При этом частота мутаций в клетках растения возрастала в 3-3,5 раза по сравнению с контролем (Аниськина и др., 2001). Использование анафазно-телофазного метода на меристематических клетках первичных корешков Allium cepa (луковые) показало увеличение количества мутантных клеток с генными повреждениями в 1,7-6,1 раз по сравнению с контролем (Фединяк, 2002).
Многочисленные исследования на растительных тест-системах показали, что нефтепродукты, попадающие в различные объекты окружающей среды, проявляют анеугенный, кластрогенный эффект, а также вызывают индукцию апоптоза клеток меристемы корешков Allium cepa (Leme et al., 2008а; 2008б;). Исследования, проведенные на некоторых видах природной флоры, показали, что продукты сгорания нефти являются генотоксичными, их воздействие приводит к стерильности пыльников, нарушениям протекания мейоза, влияет на общее развитие растений (Malallah et al., 1997; Murin et al., 1997; Sato et al., 1998).
В целом, мутагенность, генотоксичность и канцерогенность сырой нефти и продуктов ее переработки определяются содержанием в них полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) (Pelroy et al., 1979; Petrilli et al., 1980; Brooks et al., 1989; Claxton et al., 1991; Granella et al., 1991, 1995; Reddy et al., 1997; Zemanek et al., 1997; Grant, 1998), причем эти свойства усиливаются при их нитрификации (Tokiwa et al., 1987).
Эколого-географическая характеристика районов исследования
Анализ влияния полиморфизма генов глутатион S-трансферазы М1 (GSTM1), цитохрома (CYP2C9) и N-ацетил-трансферазы 2 (NAT2) на повреждение ДНК работников, контактирующих с фосфорорганическими пестицидами, показывает, что нулевой генотип GSTM1 и генотип NAT2 неактивного фермента ацетилирования с CYP2C9 3/ 3, а также нуль-генотип GSTM1 может приводить к повреждениям ДНК у рабочих (p 0,005) (Singh et al., 2012).
Рабочие дорожного строительства, имеющие GSTM1 и GSTT1 нуль-генотипы, более чувствительны к цитогенетическим повреждениям в лимфоцитах периферической крови и имеют повышенный профессиональный риск, независимо от возраста, пола, длительности воздействия компонентов горячего асфальто-бетона. Существует значительное влияние полиморфизма этих генов на цитогенетические биомаркеры, которые рассматриваются как ранние эффекты генотоксических канцерогенов (Kumar et al., 2011).
При исследовании подростков, подвергшихся длительному комплексному влиянию высоких доз природного радона и тяжелых металлов на местности обучения, была выявлена ассоциация между генотипами цитохрома 1А1 CYP1A1 и уровнем хромосомных аберраций. Установлено, что достоверно значимый высокий уровень хромосомных нарушений обнаружен у носителей хотя бы одной аллели CYP1A 1 2A (A2455G). Частота кольцевых хромосом была достоверно значимо повышена у обладателей генотипа CYP1A1 1A 1A (T3801C). У лиц с генотипом CYP1A2 1A 1A была повышена частота встречаемости множественных хромосомных перестроек (Минина, Дружинин, 2009).
Наличие мутантной формы гена цитохрома 1А1 (СУР1А1) у рабочих нефтехимических производств в Республике Башкортостан рассматривается в качестве фактора повышенного риска развития заболеваний. Выявленные комбинации генотипов по генам СУР1А1 и GSТМ1 I/I; 0 и I/У; 0, ассоциированы с повышенной индивидуальной чувствительностью рабочих к факторам нефтехимического производства. Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования полиморфных вариантов генов метаболизма ксенобиотиков в качестве молекулярных маркеров повышенной индивидуальной чувствительности к условиям труда у рабочих нефтехимических производств (Макарова и др., 2004).
При исследовании ассоциаций между хромосомными нарушениями и полиморфизмом генов у работников ТЭК (г. Кемерово) было установлено статистически значимое отличие по частоте хромосомных нарушений между группой рабочих (3,89+0,15%) и контрольной группой сравнения 2,06±0, 17% (UM-W=11298,00; p 0,001). Установлено, что нарушения метафаз имели работники с с мутантным гомозиготным генотипом С/С гена цитохрома 1А1 CYP1A1; глутатион S-трансферазы М1 GSTM1 «0/0» И Т1 GSTT1 «0/0». В группе сравнения на частоту хромосомных аберраций влияние оказывал лишь генотип GSTM1. Проведенный анализ показал, что значимый вклад в образование хромосомных аберраций оказывал полиморфизм генов детоксикации ксенобиотиков CYP1A1, GSTM1 и GSTT1, вызванных влиянием неблагоприятных факторов условий труда на тепловых электростанциях (Минина и др., 2010).
Установлено, что повышенный риск воздействия бензола на генетическое здоровье рабочих нефтеперерабатывающей промышленности связан с полиморфизмом гена эксцизионной репарации ERCC1 118 генотипа ТТ (R = 3,390, р = 0,007). Наиболее уязвимой группой стали женщины (р = 0,013), не курящие (р = 0,006) и курящие более 12 лет (р = 0,035) (Xiao et al, 2013). Работники, подвергавшиеся воздействию бензола, с T/ T генотипом для гена антиоксидантной защиты NQO1 показали значительное высокие частоты микроядер и хромосомных аберраций, соответственно, по сравнению с контрольной группой с C/ C и C/ T генотипов. Рабочие с сочетанием гена миелопероксидазы MPO G/G и XRCC1 Arg/Gln или Gln/Gln показали более высокую частоту хромосомных аберрраций по сравнению с сочетанием MPOG/ и XRCC1 Arg/ Arg генотипов (Kim et al., 2008). Проведен поиск ассоциаций между полиморфизмом генов репарации ДНК и уровнем хромосомных аберраций в лимфоцитах крови в двух группах подростков: группе, состоящей из 256 доноров, подвергшихся воздействию родона в сверхнормативной концентрации ( 200 Вк/м3), и в контрольной группе, включавшей в себя 94 доноров. В группе детей, экспонированных радоном, уровень хромосомных аберраций был статистически значимо выше у носителей генотипов hOGG1 Cys/ Cys, hOGG1 Ser/ Cys, ADPRTAla/ Ala, ADPRTVal/ Ala. (Минина и др., 2011).
По данным мета-анализа 37 исследований, проведенных в различных лабораториях мира и посвященных изучению частоты микроядер лимфоцитов периферической крови и его сопряженности с полиморфизмом генов, показано, что полиморфные варианты генов репарации XRCC1 (Arg280His), эксцизионной репарации (ERCC2 Lys751Gln), цитохромов (CYP2E1 C1/ C2) и метионин синтетазы (MTR A2756G) ассоциированы с образованием микроядер. Результаты мета-анализа показали, что в формирование микроядер существенный вклад вносит генотип. (Bonassi et al., 2011).
Определение генотоксичности нефтезагрязненной почвы
Первичные данные результатов исследования за 2002 г. по отдельным населенным пунктам приведены в приложении Д.
У всех видов исследованных растений, произрастающих в загрязненной нефтепродуктами зоне, выявлен достоверно более высокий уровень мутабельности (в 4,7- 6,4 раза больше выявленных мутаций в меристемных клетках корешков семян), по сравнению с данным показателем у растений из условно-чистой зоны.
Наибольший процент мутаций выявлен у растений из селения Долинск, территория которой характеризуется максимальным уровнем загрязнения нефтепродуктами. (Приложение Е ). У проростков семян Matricaria recutita L., выросших в загрязненных зонах, уровень мутаций в 5,4 - 7,5 раз превышает этот же показатель у проростков семян растений из условно-чистой зоны. Наблюдается увеличение всех типов повреждений хромосом: так число «мостов» и фрагментов повысилось в 5,2 - 6,4 раза. Больше всего выявлено хромосомных перестроек в клетках проростков семян растений, собранных в населенных пунктах Мескер-Юрт и Долинск. Схожие данные получены и по другим видам растений. У проростков семян Rumex confertus Willd,, выросших в загрязненных зонах, уровень мутационных аберраций в 5,1 - 6,6 раз превышает уровень мутаций в клетках корешков семян растений из условно-чистой зоны. Большинство аберраций, наблюдаемых у данного растения - это наличие фрагментов, которые образуются в результате повреждений хромосом в области центромеры, приводящих к отставанию целых хромосом или их частей – фрагментов в анафазе.
Количество фрагментов хромосом в клетках проростков семян, собранных в загрязненных районах, превышает их уровень, отмеченный в условно-чистой зоне в 5,2 - 6,7 раз. Наибольший процент выявленных мутаций наблюдается в населенном пункте Долинск.
Меньше всего оказались подвержены влиянию загрязнителей почвы проростки Plantago major L., по сравнению с другими исследуемыми видами. Однако уровень генотоксического воздействия в различных загрязненных зонах неодинаков, в наиболее загрязненной зоне (с. Долинск) он превышает таковой в условно-чистой зоне в 10,2 раз. Вместе с тем не обнаружено одиночных или двойных мостов в клетках проростков Plantago major L. из условно-чистой зоны.
Таким образом, у клеток проростков всех изученных видов растений, произрастающих в районах загрязнения, отмечен повышенный уровень мутабельности по сравнению с растениями из условно-чистой зоны. Ацентрические фрагменты хромосом были наиболее частыми из всех типов учитываемых нарушений в клетках проростков всех видов растений. Среди изученных видов наиболее чувствительным оказался Matricaria recutita L., так, как в проростках семян у него отмечен наибольший уровень хромосомных аберраций. Самый высокий уровень хромосомных аберраций наблюдается у растений из окрестности села Долинск, которое расположено в самой неблагоприятной по загрязнению территории. В 2012 г. нами были проведены повторные исследования генотоксичности почв на Taraxacum officinale Wigg. S.l. В таблице 3.9 представлены сравнительные данные по уровню хромосомных аберраций в меристемных клетках корешков семян одуванчика лекарственного в исследованиях , проведенных в 2002 и 2012 г. Полученные результаты за 2002 и 2012 гг. показали, что на исследуемых территориях отмечается положительная тенденция к улучшению состояния среды обитания. Как было отмечено выше, в связи с ликвидацией мини-заводов по кустарной переработке нефти и закрытием большинства горящих нефтяных факелов, концентрация нефтепродуктов и бенз(а)пирена в почве снизилась, что привело к снижению уровня мутаций, в частности, в клетках одуванчика лекарственного, произраставшего в изученных населенных пунктах. (табл. 3.9). В условно-чистой зоне различия в уровне мутаций статистически не значимы, что позволяет предполагать, что эти данные (2,1 - 2,3%) отражают спонтанный уровень мутаций.
Во всех населенных пунктах, включая с. Гойты (у.ч.з.), на светло-зеленых листьях число желтых пятен больше относительно темно-зеленых и парных, обусловленных прямыми генными мутациями.
Во всех загрязненных зонах по сравнению с условно-чистой, на светло-зеленых листьях увеличивается число всех типов пятен. Количество желтых пятен, являющихся результатом прямых генных мутаций или делеций увеличивается в 2,7 - 3,9 раз. Количество темных-зеленых пятен (обратные генные мутации) - в 4,5 - 6,0 раз, и количество парных пятен (митотический кроссинговер) в 3,5 - 6,0 раз.
На желтых листьях во всех загрязненных населенных пунктах по сравнению с условно-чистой зоной примерно одинаково (в 4 - 5 раз) увеличивается количество светло-зеленых пятен, которые могут быть вызваны обратными генными мутациями.
Зависимость врожденных морфогенетических вариантов от уровня загрязнения окружающей среды нефтепродуктами
Врожденные морфогенетические признаки аномального развития могут проявляться на различных участках тела. В связи с этим мы определяли среднее число признаков в соответствии с их локализацией (табл. 3.32.). Согласно полученным результатам, наибольшее число выявленных ВМГВ локализовано на коже и туловище (219), примерно одинаковое количество ВМГВ выявлены в области рта (161) и в краниофасциальной области (155), меньшее число отмечается в области глаз и ушей. Минимальное количество вариантов морфогенеза выявлены на верхних и нижних конечностях.
Сравнение числа ВМГВ в зависимости от локализации показало отсутствие значимых различий по числу данного показателя у девочек и мальчиков во всех населенных пунктах. В ряде сел (Гойты, Мескер-Юрт, Червленая) количество ВМГВ, расположенных в краниофасциальной области в 1,5 раза выше у девочек, по сравнению с числом ВМГВ у мальчиков, в остальных селах такой тенденции не отмечается.
Значимых различий по ВМГВ различной локализации не выявлено для всех условно-чистых сел: Зандак, Гойты, Шатой и Червленая (табл. 3.33.). В селах Долинск и Мескер-Юрт показатели частоты ВМГВ по локализациям примерно равны, при этом число врожденных морфогенетических вариантов, локализованных в краниофасциальной области, на коже и туловище, в области рта и глаз здесь 1,5–2 раза больше, чем в условно-чистых населенных пунктах. Анализ частоты врожденных морфогенетических вариантов, расположенных на верхних и нижних конечностях, а так же в области ушей не выявил значимых различий по всем населенным пунктам.
Согласно Котышевой (2007), наиболее достоверными являются частоты ВМГВ с популяционной частотой, превышающей 10%. В условно чистом селе Гойты частота появления отдельного признака ВМГВ не превышает 12%. Наиболее часто появляющимися признаками являются невус (родинки и родимые пятна), лентиго (коричневые пигментные пятна), две макушки, оттопыренные уши, центральная диастема (большие промежутки между передними зубами), аномальная форма зубов. В с. Зандак ряд признаков, такие, как аномальный рост зубов и центральная диастема у мальчиков, низкий рост волос на шее как у девочек, так и у мальчиков и невус у девочек, встречаются с частотой более 20%. С такой же частотой появлялись в селе Мескер-Юрт такие аномалии, как диастема, лентиго, аномальный рост зубов и высокое небо у девочек, а также высокое небо, невус и гипертрихоз (чрезмерное оволосение некоторых участков лица и тела) у мальчиков. В с. Долинск у девочек отмечены гипертрихоз, низкий рост волос на лбу и синофриз (сращение бровей), у мальчиков – высокое небо и голубые склеры. В населенном пункте Шатой каждый пятый ребенок имеет бороздки на ушной раковине и оттопыренные ушные раковины и монголоидный разрез глаз. У девочек в данном селе с частотой более 25% встречаются аномальная форма зубов и центральная диастема.
Надо отметить, что не выявлены признаки, которые встречались бы с одинаковой частотой как у девочек, так и у мальчиков, и были бы характерны для определенных населенных пунктовТаким образом, полученные результаты свидетельствуют о влиянии загрязнения окружающей среды продуктами переработки нефти на частоту врожденных морфогенетических вариантов у детей, проживающих в неблагоприятных условиях проживания. При этом отмечается отсутствие различий в группах детей в зависимости от пола. Воздействие продуктов переработки нефти на организм детей носит общий генотоксический характер.
Частота врожденных морфогенетических вариантов различной локализации у детей в изучаемых населенных пунктах (в среднем на 1 ребенка) Локализация Населенные пункты
Зависимость врожденных морфогенетических вариантов от уровня загрязнения окружающей среды нефтепродуктами Показано, что появление ВМГВ обусловлено действием мутагенов и тератогенов окружающей среды (Бочков, 1994), в связи с чем варианты морфогенеза были изучены у детей, проживающих в населенных пунктах, различающихся по уровню загрязнения нефтепродуктами.
В таблице 3.34. представлены данные по уровню загрязнения почв нефтепродуктами и среднему числу ВМГВ на 1-го ребенка в изученных населенных пунктах Чеченской Республики.
Изучаемые селения характеризуются различным уровнем нефтезагрязнения, и согласно «Порядку определения размеров ущерба…» (1993) они были разделены на две группы: в первой группе (условно чистая зона) - села Гойты, Червленая, Шатой, и Зандак, в почве которых концентрация нефтепродуктов не превышает 25 мкг/г почвы, во второй группе (загрязненная зона) - села Долинск и Мескер-Юрт, в почве которых содержание нефтепродуктов превышает 40 мкг/г почвы.
Похожие диссертации на Генетические последствия загрязнения окружающей среды нефтепродуктами в Чеченской Республике
