Введение к работе
Актуальность темы. Биосинтез тетрапирролов является одним из центральных процессов у всех фотосинтезирующих организмов. Интенсивное изучение генетического контроля этого процесса у растений проводится па модельном объекте Arabidopsis thaliana, определение полной ігуклеотидиой последовательности которого стало мощным импульсом развития геномики растений, работ по молекулярно-генетическому картированию, клонированию и идентификации функции генов.
На сегодняшний день все этапы биосинтеза тетрапирролов детально исследованы. Показано что, общими предшественниками синтеза гема и хлорофилла являются порфирины, при чрезмерном накоплении которых происходит генерирование синглетного кислорода на свету, что ведет к фотоокислителыюму стрессу, блоку биосинтеза тетрапирролов и гибели растения (Beale, Weinstein, 1990; Grimm, 1998). Поэтому исследование мутантов устойчивых и чуствительных к гербицидам, способным ингибировать протопорфириногеноксидазу (РРОХ) - фермент, субстратом которого является протопорфирин IX, может пролить свет на молекулярно-генетические механизмы устойчивости к фотодннамическим гербицидам, в частности, к ацифлюофену, который широко применяется на практике. Эти исследования важны для понимания механизмов регуляции генов биосинтеза тетрапирролов.
На кафедре генетики МГУ получены мутанты A. thaliana, толерантные к ингибитору биосинтеза хлорофилла ацифлуорфену, характеризующиеся измененной окраской листа (Ежова и др., 2001). Мутационный и молекулярно-генегический анализ является эффективным подходом для идентификации генов и изучения их функции.
Целью работы является идентификация и структурно-функциональный анализ генов Arabidopsis thaliana, контролирующих устойчивость к гербициду ацифлюорфену на основе анализа мутантов из коллекции кафедры генетики МГУ.
Задачами работы являлись:
1. Морфо-фнзиологический анализ мутантов A.thaliana aciS и aci8, обладающих
повышенной устойчивостью к ацифлюорфеїгу.
Молекулярно-генетическое картирование и клонирование генов АСІ5 и АСІ8.
Сравнительный анализ уровней транскрипции генов, контролирующих биосинтез тетрапирролов у мутантов асі5, асі8 в целях изучения молекулярно-генетических механизмов толерантности к ацифлюорфену.
4. Изучение функциональных особенностей гена АСІ5 и его гомолога на основе анализа их внутри- и межвидового полиморфизма.
Научная новизна. Впервые показано что, ген СНЫ 1/АСІ5 (At4gl8480), кодирующий субъединицу СНЫ Mg-хелатазного комплекса, отвечает за устойчивость к ацифлюорфену. На основании анализа генной экспрессии установление что, причиной устойчивости мутанта к ацифлюорфену является увеличение потока токсичных порфиринов в сторону образования гема, за счет повышения уровня транскрипции генов биосинтеза гема - генов Fe-хелатазы FC1 и FC 2.
Установлено, что гомолог гена СНЫ 1/АСІ5 - ген СНЫ 2 (At5g45930) в геноме A.thaliana выполняет второстепенную функцию из-за нуклеотидных замен в 3'-терминальном конце гена. Этот ген не способен компенсировать утрату функции гена СНЫ 1/ACI5 при синтезе хлорофилла. Предполагается, что при формировании Mg-хелатазного комплекса белок СНЫ 2 из-за измененной последовательности С-конца не может конкурировать с СНЫ 1. Анализ внутривидового полиморфизма гена СНЫ 2 выявил наличие двух гаплогрупп, одна из которых идет по пути псевдогенезации, а вторая находится под действием стабилизирующего отбора.
Показано что, ген ACI8 идентичен гену ATASE 2 (At4g34740), кодирующему глютаминфосфорибозилпирофосфат амидотрансферазу (GPRAT). Таким образом впервые выявлена связь пути биосинтеза пуринов de novo с устойчивостью к гербициду. Устойчивость мутанта aci8 к ацифлюорфену обусловлена снижением уровня транскрипции гена CHLH, кодирующего лимитирующий фермент биосинтеза хлорофилла (субъединицу CHLH Mg-хелатазного комплекса).
Научно-практическая значимость работы. Изучение функциональных особенностей гомологичных генов A.thaliana СНЫ 1 и СНЫ 2 вносит вклад в создание динамичной имитационной модели системы синтеза тетрапирролов у высших растений. Выяснение механизмов устойчивости A.thaliana к гербициду ацифлюорфену открывает новые возножности для создания трансгенных растений с контролируемым путем биосинтеза хлорофиллов, гемов и фитохромобилинов, для получения линий устойчивых к фотодинамическим гербицидам. Сведения о нуклеотидных последовательностях различных природных рас A.thaliana отправлены в GenBank. Информация о CAPS маркерах aci8caps и aci8snp323, выявляющих полиморфизм между расами Dijon и Columbia, отправлена в базу данных TAIR. Апробация работы. Основные результаты работы были представлены: на Всероссийской конференции по генетике для молодых ученых (пМосква, Россия 2003), XII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых
«Ломоносов-2005» (Москва, 2005), на международной конференции ВОГиС «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (Москва, 2004), на симпозиумах «Биофизика фотосинтеза. Межклеточная сигнализация и регуляция генов в растениях» (Минск, Беларусь, 2007), «ЕІГ-Russia 7th Frame Program Symposium» (Суздаль, 2007), на Российско-Польской конференции «Биотехнология» (президиум РАН, Москва, 2008). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ. Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на ІО ( страницах, состоит из введения, обзора литературы, глав «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», заключения, выводов и списка литературы, включающего с~А* источника. Работа содержит 57рисунков и 2 ^таблиц.
Работа поддержана грантами РФФИ (проект 07-04-12077-офи), ФЦП «Ведущие научные школы» (НШ-4202.2008.4), программой РАН «Динамика генофондов растений, животных и человека».
