Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
I. Пероксидазы растений 8
/./. Структура и функции пероксидаз 8
» Участие пероксидаз в процессе прорастания семян 10
Участие пероксидаз в лигнификации, суберинизации, в процессах растяжения и уплотнению клеточных стенок 12
• Участие пероксидазы в катаболизме ауксина 13
• Участие пероксидаз в защите от стрессовых воздействий 14
• Изучение экспрессии генов пероксидаз A.thaliana 15
П. Происхождение и эволюция семейства пероксидазных генов растений 18
Ш. Изучение эволюции генов с помощью анализа их внутривидового „ . полиморфизма
IV. Балансирующий отбор 28
V. Методы и результаты изучения эволюционной динамики генов растений
VI. Заключение к обзору литературы 39
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Растительный материал и условия выращивания растений 42
• Условия выращивания
• Состав среды Квитко
• Морфологический анализ
2. Определение активности и изоферментного состава пероксидаз
• Подготовка экстракта белков для электрофореза 43
• Вертикальный гель-электрофорез
3. Выделение нуклеиновых кислот
. Выделение ДНК 45
• Выделение РНК
• Синтез первой цепи кДНК Изучение транскрипции генов
• Электрофорез в агарозном геле
• Элюция ДНК из агарозного геля
4. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 41
• Праймеры
• Условия проведения ПЦР
• Секвенирование
5. Генетическое картирование с использованием ДНК-маркеров 49
6. Клонирование ПЦР-продуктов
• Получение компетентных клеток.
• Лигирование ПЦР-продукта с вектором pGENf-T 49
• Трансформация
• Рестрикция
7. Воздействие стрессовых факторов 50
8. Компьютерные методы анализа 50
9. Методы статистического анализа 51
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
I. Локализация гена PXD на молекулярно-генетической карте A.thaliana 53
II. Изучение 5 генов пероксидаз, локализованных в верхнем плече хромосомы 5
11.1.Основные характеристики генов пероксидаз AtPrx52, AtPrx53, AtPrx54, AtPrx55, AtPrx56
IL2. Изучение полиморфизма нуклеотидной и аминокислотной последовательности генов AtPrx52, AtPrx53, AtPrx54, AtPrx55, AtPrx56
Н.З. Сравнение уровня и характера полиморфизма генов пероксидаз . AtPrx52, AtPrx53, AtPrx54, AtPrx55, AtPrx56
H.4. Анализ транскрипции генов AtPrx52, AtPrx53, AtPrx54, AtPrx55, AtPrx56
III. Изучение внутривидового полиморфизма гена AtPrx53 80
I1I.1. Изучение полиморфизма нуклеотидной и аминокислотной последовательности гена AtPrx53
//7.2. Уровень и характер полиморфизма гена AtPrx53 83
III.3. Связь между аллелъным диморфизмом гена AtPrx53 и подвижностью изоформ белка 89
IV. Особенности экспрессии гена AtPrx53 и анализ функциональной Q. дивергенции гаплотипов
IV. 1. Анализ транскрипции гена AtPrx53 в разных органах на разных Q стадиях развития
IV.2. Анализ транскрипцсии гена AtPrx53 в ответ на стрессовые и гормональные воздействия
IV.3. Сравнительный анализ уровня транскрипции аллелей гена AtPrx53 и активности аллозимов, кодируемых разными аллелями 97
V.4. Проявление аллельного диморфизма гена AtPrx53 на уровне морфологических признаков
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 108
ВЫВОДЫ 111
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 112
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 114
Введение к работе
Пероксидазы растений, участвующие во многих жизненно важных реакциях, кодируются десятками паралогичных генов. В геноме Arabidopsis thaliana обнаружено 73 пероксидазных гена, распределенных по всем хромосомам (Tognolli et al., 2002; Welinder et al., 2002). Такое количество генов свидетельствует о важности выполняемой ими функции, однако, несмотря на активные исследования растительных пероксидаз, информация о функциях конкретных генов пероксидаз, а таюке о соответствии между генами и конкретными изоформами остается ограниченной.
Секвенирование генома модельного растения A. thaliana открыло новые возможности для анализа внутривидового полиморфизма генов, изучения на его основе эволюционной динамики генов и генных семейств. Эти исследования выявили неожиданные феномены - высокий уровень нуклеотидного разнообразия генов этого самоопыляющегося растения, сопоставимый с таковым у родственных перекрестно опыляющихся видов, отсутствие связи генетического полиморфизма с географическим происхождением, а также диморфизм ряда генов, относящихся к разным генным семействам и имеющим разную функцию. Диморфизм генов может быть как результатом истории происхождения вида, так и следствием балансирующего отбора, который может поддерживать существование разных гаплотипов, обеспечивающих локальную адаптацию к разным условиям обитания (King et al., 1993; Price et al., 1994; Innan et al. 1996, 1997). Для того, чтобы доказать действие отбора в поддержании генного диморфизма, необходимо убедиться в различии свойств гаплотипов, а также в наличии особого характера распределения сайтов синонимичных замен («молчащего» полиморфизма) вокруг мишени естественного отбора. В настоящее время этот факт можно считать доказанным лишь для единичных генов, контролирующих устойчивость к патогенам. Поиск таких мишеней действия естественного отбора открывает возможности для создания моделей эволюционного процесса и изучения эволюционной динамики видов (Orr, Coyne, 1992). Расширение исследований по молекулярной эволюции, включение в них новых генов и генных семейств, играющих важнейшую роль в развитии и адаптации к разным условиям среды, ускорит решение этой глобальной проблемы. В данной работе исследование полиморфизма проводили на пероксидазных генах. Среди 73 генов A.thaliana были выбраны гены, локализованные в хромосоме 5, где по данным ранее проведенных в нашей лаборатории исследований локализован ген PXD, предположительно контролирующий образование 3-х изоформ пероксидазы.
Целью работы является молекулярно-генетическое изучение гена PXD и анализ внутривидового полиморфизма генов пероксидаз, расположенных в районе локализации этого гена.
Задачи работы:
1. Генетическое картирование гена PXD, кодирующего анионную пероксидазу.
2. Изучение уровня и характера молекулярного полиморфизма генов, пероксидаз AtPrx52 - AtPrx56, локализованных в верхнем плече хромосомы 5.
3. Выявление связи между изоформами и генами пероксидаз у разных рас А. thaliana и мутантно й линии pxd.
4. Анализ экспрессии генов пероксидаз в разных органах растения при действии стрессовых и гормональных факторов.
Научная новизна. Впервые проведено исследование внутривидового полиморфизма генов пероксидаз. Показаны существенные различия в уровнях и характере полиморфизма 5-ти сцепленных генов пероксидаз, выявлено наличие диморфизма в гене AtPrx53 и доказана его идентичность гену PXD. На основе анализа спектра изоформ анионных пероксидаз у рас, относящихся к разным гаплотипам, установлена связь гена AtPrx53 с изоформами белка. Проведено изучение транскрипции генов пероксидаз в различных органах на разных стадиях развития растений и установлено, что ген AtPrx53 активно экспрессируется во всех надземных органах растений. Впервые показано изменение экспрессии (уровня транскрипции и активности изоформ) гена AtPrx53 в ответ на действие стрессовых факторов, установлено участие гена AtPrx53 в контроле количественных признаков (число листьев розетки, время появления цветоноса, скорость его развития, конечная высота цветоноса, число розеточных побегов, время отмирания листьев, время зацветания). Выявленные особенности полиморфизма и данные, свидетельствующие о проявлении различий между гаплотипами гена AtPrx53 на транскрипционном и фенотипическом уровне, позволяют рассматривать диморфизм этого гена в качестве новой молекулярно-генетической модели для изучения роли балансирующего отбора в адаптивной эволюции генов растений.
Научно-практическая значимость работы. Изучение генов пероксидаз имеет практическое значение, поскольку пероксидазы (прежде всего, пероксидаза хрена) являются наиболее востребованными маркерами в иммуноферментном анализе. Несмотря на огромную потребность в данном ферменте, существует проблема поиска аналогичного фермента с более высокой стабильностью и повышенной каталитической способностью. Рїменно поэтому актуален поиск аналогов пероксидазы хрена и кодирующих генов пероксидаз из других растений, разрабатываются методы их экспрессии в различных векторных системах. Одним из таких генов является исследованный в данной работе ген A.thaliana AtPrx53/PXD. Результаты работы вносят вклад в изучение функции этого гена, который может быть рекомендован для клонирования в экспрессионных векторах, используемых в генной инженерии.
Положения, выносимые на защиту.
1. Ген AtPrx53/PXD A.thaliana, являющийся гомологом гена хрена HRPA2, экспрессируется во всех органах побега и кодирует три изоформы анионной пероксидазы, участвующей в процессах развития и защиты растения от действия стрессовых факторов.
2. Ген AtPrx53/PXD A.thaliana характеризуется высоким уровнем внутривидового полиморфизма и представлен двумя основными гаплотипами (Dj и Col), которые различаются по характеру экспрессии и кодируют изоформы, отличающиеся по электрофоретической подвижности.
3. Диморфизм гена AtPrx53/PXD A.thaliana поддерживается балансирующим отбором, что позволяет рассматривать этот ген как модель для изучения роли балансирующего отбора в адаптивной эволюции растений.
