Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы .— 10
1.1. Основные направления исследований генетики мультифакториальных заболеваний 10
1.2. Молекулярные механизмы развития миомы матки 15
1.3. Молекулярно-генетические исследования миомы матки... 27
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования..
2.1. Клиническая характеристика обследованных групп. — 35
2.2. Молекулярно-генетические методы ... 41
2.3. Биометрические и генетико-статистические методы 49
ГЛАВА 3. Изучение ассоциаций генетических полиморфизмов факторов некроза опухоли и их рецепторов с формированиеммиомы матки . 52
3.1. Популяционно-генетический анализ молекулярно генетическихмаркеров\ , 52
3:2 Исследование ролишолиморфных маркеров в/развитии - миомы матки, сочетающейся с аденомиозом . 56
3.3. Анализ .связей генетических-:маркеров с формированием миомы матки, сочетающейся с гиперпластическими процессами эндометрия. 59
3.4. Генетические полиморфизмы и гормональный статус больных миомой матки 65
ГЛАВА 4. Исследование взаимосвязей полиморфных маркеров генов факторов некрозаопухоли и их рецепторов с характером.поражения матки миоматозными узлами 70
4.1. Ассоциации генетических полиморфизмов с размерами миоматозных узлов
4.2. Генетические маркеры и количество миоматозных узлов у больных миомой матки 77
4.3 Анализ роли наследственной отягощенности в характере взаимосвязей молекулярно-генетических маркеров с размерами миоматозных узлов 80
4.4 Изучение особенностей ассоциаций генетических полиморфизмов с характером поражения матки в зависимости от локализации узлов 88
Обсуждение 96
Выводы 108
Практические рекомендации по
Список литературы
- Молекулярные механизмы развития миомы матки
- Молекулярно-генетические методы
- Исследование ролишолиморфных маркеров в/развитии - миомы матки, сочетающейся с аденомиозом
- Анализ роли наследственной отягощенности в характере взаимосвязей молекулярно-генетических маркеров с размерами миоматозных узлов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Миома матки - это доброкачественная опухоль, растущая из незрелых миоцитов сосудистой стенки матки (Сидорова И.С.,2003). Занимает первое место среди доброкачественных опухолей половых органов, при этом каждая десятая гинекологическая больная страдает миомой матки (Gornall A.S. et al., 2000, Нарзулаева Е.Н. и соавт.,2003). По поводу миомы матки выполняется до 50-70% оперативных вмешательств в гинекологических стационарах, из которых 60,9-95,5% приходится на радикальные операции, в том числе и в репродуктивном возрасте (24-26,8%) еще у совсем юных женщин, не успевших реализовать свою репродуктивную функцию (Сидорова И.С., Унанян А.Л. и др., 2007).
Проблема изучения этиопатогенеза миомы матки и факторов его определяющих продолжает оставаться в центре внимания отечественных и зарубежных исследователей (Сидорова И.С., 2002, Савицкий Г.А. и др., 2003, Тихомиров А. Л. и др., 2006, Fujimoto J. et al., 2000, Rein M.S. et al.,2000, Hisaoka M. et al., 2002, Olovsson M. et al.,2005). Несмотря на значительный прогресс, сделанный в последние десятилетия в этом направлении (КашЬе-Harada A. et al.,2001, Asghar Т. et al.,2004) и многочисленные гипотезы, объясняющие возникновение и течение миомы матки, ряд ключевых положений генеза этого заболевания до настоящего времени остаются дискуссионными и недостаточно изученными, что затрудняет разработісу новых органосохраняющих методов лечения данной патологии (Flake G.P. et al., 2003).
В последнее время накапливается все больше данных, свидетельствующих о том, что полиморфизм ряда генов имеет важное значение в формировании предрасположенности к повышенному риску развития миомы матки (Kurachi О. et al., 2001, Кулагина Н.В., 2008). Согласно материалам работы William Н. et al., опубликованной в 2007 г в журнале « Fertility and Sterility», в формировании миомы может: быть задействовано более чем 100 генов, многие из которых участвуют в регуляции клеточного роста, дифференциации, пролиферации. В конечном итоге характер роста опухоли определяется динамическим балансом между пролиферацией клеток и клеточной гибелью.
Среди генов-кандидатов, участвующих в регуляции процессов апоптоза и клеточной пролиферации, важное значение имеют гены факторов некроза опухоли и их рецепторов (Kokawa К. et al., 2001.,Wu X. et al.,2002,Asghar Т. et al.,2004). Это определяется тем, что факторы некроза опухоли через свои специфические рецепторы могут являться как индукторами апоптоза (Burroughs K.D. et al., 1997, Унанян А.Л.и др., 2004, Olovsson М. et al.,2005), так и стимулировать митогенную активность клеток (Arici A. et al., 2000, Moore A. et al.,2000).
Клинико-генетические работы, посвященные молекулярно-генетическим аспектам миомы матки в России немногочисленны и затрагивают в основном гены HLA-системы (Матаев СИ., 2000), факторов роста и ангиогенеза (Егорова О.В. и др., 2007), интегринов (Григорьева Н.Ю., 2003; Гигани О.О., 2003; Ордиянц И.М., 2005,2007а,2007Ь; Прудникова Н.Ю., 2005; Полина М.Л., 2008), каталитической субъединицы теломеразы (Адамян Л.В. и др., 2007), ферментов биотрансформации (Почос Е.В. и др., 2006, Егорова О.В. и др., 2007) и хемокинов (Кулагина Л.В. и др., 2008). Исследования роли
полиморфных маркеров генов факторов некроза опухоли и их рецепторов в отношении миомы матки в нашей стране до сих пор не проведены.
Работа выполнена в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы «Генетические факторы мультифакториальных заболеваний человека» (гос.контракт №02.740.11.0496).
Цель и задачи исследования. Изучить полиморфизмы генов факторов некроза опухоли, их рецепторов и рассмотреть их влияние на формирование миомы матки и характер ее поражения миоматозными узлами.
В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:
-
Изучить распределение полиморфизмов генов фактора некроза опухоли а (-308 G/A TNFa), лимфотоксина a (+250 A/G Lta), рецепторов фактора некроза опухоли 1-го (+36 A/G TNFR1) и 2-го (-322 VNTR TNFR2) типов у больных миомой матки и популяционной выборке
-
Исследовать роль генетических полиморфизмов в формировании миомы матки, сочетающейся с аденомиозом
-
Оценить взаимосвязи молекулярно-генетических маркеров с миомой матки, сочетающейся с гиперпластическими процессами эндометрия
-
Проанализировать влияние генетических факторов на степень поражения матки миоматозными узлами
-
Рассмотреть роль наследственной отягощенности в характере взаимосвязей полиморфных маркеров с размерами миоматозных узлов
-
Выявить ассоциации генов-кандитатов с площадью миоматозных узлов в зависимости от их локализации
Научная новизна работы. Впервые проведен комплексный молекулярио-генетическнй анализ полиморфизмов генов фактора некроза опухоли a (-308 G/A TNFa), лимфотоксина a (+250 A/G Lta), рецепторов фактора некроза опухоли 1-го (+36 A/G TNFR1) и 2-го (-322 VNTR TNFR2) типов у больных миомой матки, русской национальности, являющихся уроженками Центрального Черноземья РФ.
Впервые установлены генетические маркеры предрасположенности к формированию миомы матки, сочетающейся с аденомиозом (+36 A/G TNFR1) и гиперпластическими процессами эндометрия (-308 G/A TNFa).
Впервые показаны взаимосвязи между генетическими полиморфизмами и характером поражения матки миоматозными узлами.
Впервые выявлено влияние наследственной отягощенности на характер взаимосвязей генетических полиморфизмов с размерами миоматозных узлов. Установлены особенности этих ассоциаций при миоматозных узлах различной локализации.
Научно-практическое значение. Результаты работы вносят вклад в расшифровку механизмов патогенеза миомы матки, формирование представлений о молекулярно-генетических основах заболевания. Полученные данные позволяют рекомендовать в целях определения группы пациенток с повышенным риском развития сочетанной патологии по гиперпластическим процессам матки проведение молекулярно-генетического тестирования генов фактора некроза опухоли а и рецептора фактора некроза опухоли 1-го типа для выявления прогностически неблагоприятных маркеров. Определенные в работе генетические маркеры миоматозных узлов больших размеров - генотипы 1/1 и 2/1 -322 VNTR полиморфизма рецептора
фактора некроза опухоли 2-го типа, +36 АА рецептора фактора некроза опухоли 1-го типа и его сочетание с полиморфизмом -308 GG фактора некроза опухоли а могут быть использованы в практической медицине при определении индивидуальной тактики ведения больной с миомой матки. Положения, выносимые на защиту.
-
Полиморфные маркеры генов фактора некроза опухоли а и его рецептора 1-го типа ассоциированы с формированием миомы матки, сочетающейся с аденомиозом и гиперпластическими процессами эндометрия.
-
Размеры миоматозных узлов взаимосвязаны с полиморфными вариантами генов.
3. Ассоциации молекулярно-генетических маркеров с размерами
миоматозных узлов проявляются в группе женщин с наследственной
отягощешюстью и отсутствуют при неотягощенной наследственности.
4. Характер взаимосвязей генов-кандитатов с площадью миоматозных
узлов зависит от их локализации в матке.
Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на: III Международной Пироговской научной медицинской конференции (Москва, 2008), II международной научной конференции молодых ученых-медшсов (Курск, 2008), 74-й итоговой научной межвузовской конференции студентов и молодых ученых «Молодежная наука и современность» (Курск, 2009), II Международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2009), 5 съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), III международной конференции молодых ученых «Современные вопросы акушерства и гинекологии» (Москва, 2009), VIII Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке; концепция болезней цивилизации» (Москва, 2009), IV Международной Пироговской научной медицинской конференции (Москва, 2009), II межрегиональной научно-практической конференции акушеров-гинекологов и перинатологов «Актуальные проблемы современного акушерства, гинекологии и перинатологии» (Белгород, 2009), 43-й Всероссийской научной конференции с международным участием студентов и молодых ученых «Актуальные проблемы теоретической, экспериментальной, клинической медицины и фармации» (Тюмень, 2009), IX окружной конференции молодых ученых «Наука и инновация XXI века» (Сургут, 2009), Всероссийской конференции с международным участием «Охрана репродуктивного здоровья - будущее России» (Белгород, 2010), VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов - на - Дону, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе 6 в журналах из перечня ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание использованных материалов и методов, результаты к их обсуждение, а также выводы, практические рекомендации и список литературы. Материалы диссертации изложены на 138 страницах машинописного текста и содержат 16 таблиц и 20 рисунков. Библиографический указатель содержит 226 наименований, из которых 112 иностранных.
Молекулярные механизмы развития миомы матки
Мультафакториальные заболевания (МФЗ), являясь наиболее распространенной группой болезней в структуре всей патологии человека (на их долю приходится до 90 % всех заболеваний человека) (Бочков Н.П., 2004), находятся в центре постоянного внимания генетиков, служат предметом многочисленных генетических исследований, проводимых как зарубежом (Carlson C.S.,2004, Matsuzaki Н.,2004, Morley М.,2004, Wang Y.S.,2005, Hunter DJ.,2005), так и в нашей стране (Баранов В.С.,2004, Иванов В.П. и др.,2005, Носиков В.В.,2005, Янковский Н.К. и др., 2003, Хуснутдинова Э.К.,2006, 2007, Воевода М.И., 2006, Полоников А.В. и др., 2006, Гинтер Е.К. и др., 2007).
Развитие технологий генетического картирования мультифакториальных заболеваний, построение подробной генетической карты человека в результате успешной реализации международной программы «Геном человека», активное использование в исследованиях современных методов анализа ДНК-полиморфизма, разработка математических и компьютерных методов и моделей позволили начать систематическое картирование генов, ответственных за сложнонаследуемые (мультифакториальные) заболевания и признаки (Пузырев В.П., 2003).
Картирование генов с применением ДНК-маркеров у человека осуществляется в рамках двух подходов: кандидатное и позиционное картирование (Пузырев В.П., 1997). Кандидатное картирование предполагает изучение лишь тех генов, продукты экспрессии которых вовлечены в возникновение или течение заболевания (так называемые гены-кандидаты). Изучение взаимосвязей полиморфных маркеров генов-кандидатов с исследуемыми заболеваниями или отдельными признаками данных заболеваний позволяет установить их патогенетическую роль и, таким образом в конечном итоге «картировать» заболевание. Важно подчеркнуть, что в рамках данного подхода в анализ вовлекаются только гены с известной локализацией и функцией. Позиционное клонирование предполагает выявление генов мультифакториальных заболеваний путем анализа сцепления болезни с уже картированными генетическими маркерами. Недостатком позиционного клонирования является «нефункциональность» открытого региона - кроме сцепления с заболеванием о нем больше нет практически никакой информации. Способом, который позволяет преодолеть ограничения позиционного картирования, является позиционно-кандидатный способ. Он объединяет мощность обратно-генетической стратегии с преимуществами кандидатного подхода и предполагает поиск подходящих генов-кандидатов на позиционно выявленном участке.
При проведении генетического картирования сложнонаследуемых признаков применяются различные методы. Одним из таких методов является анализ сцепления, основанный на прослеживании косегрегации генов при передаче от родителей к потомкам в ряду поколений (Пузырев В.П., 2003). У человека при небольшом размере семьи, сцепление маркерного гена и гена заболевания можно выявить только тогда, когда оба гена не только находятся в одной хромосоме, но и физически расположены достаточно близко один к другому (Гинтер Е.К., 2003). С учетом этого в настоящее время анализ сцепления проводят, используя, как правило, большое число маркеров (не менее 500), распределенных по всему геному (Ohashi J. et al., 2002; Carlson C.S. et al., 2004). Анализ сцепления позволяет идентифицировать достаточно широкий интервал (в несколько мегабаз), который косегрегирует с болезнью в семье и охватывает участок ДНК в сотни кандидатных генов заболевания. В целом исследования по анализу сцепления больше подходят для поиска новых, еще неизвестных генов мультифакториальных заболеваний (Souto J.C., 2003). Следует отметить, что в отличие от менделирующих заболеваний, когда один ген должен быть сцеплен с заболеванием и при этом данное сцепление является абсолютным, при МФЗ сцепление будет выявляться для всех генов, участвующих в формировании предрасположенности, однако это сцепление будет неполным т.к. соответствующий ген встречается не у всех больных МФЗ. Кроме этого, чем меньший вклад гена в формирование предрасположенности, тем слабее он будет сцеплен с заболеванием (Гинтер Е.К., 2003).
Среди других методов генетического картирования мультифакториальных заболеваний широкое применение в научных исследованиях получил метод анализа ассоциаций. В отличие от анализа сцепления, где оценивается косегрегация генетического материала в семьях, при поиске ассоциаций исследуются популяционные корреляции в частотах аллелей (Пузырев В.П.,2003). Идеология этих исследований достаточно проста (Гинтер Е.К., 2003): если гены имеют отношение к развитию частых МФЗ, то их определенные аллели, которые можно назвать предрасполагающими, будут встречаться у больных чаще, чем в. популяции. Другие аллели того же гена будут встречаться реже, и формально они должны выполнять защитную (протективную) роль.
Молекулярно-генетические методы
Генотипирование ДНК-маркеров производилось методом анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) продуктов ПЦР-амплификации специфических участков генома с использованием соответствующих ферментов рестрикции производства ООО "Сибэнзим" (Новосибирск) (табл. 4). После инкубации рестрикционной смеси в течение 16 часов при температуре 37С проводили разделение фрагментов ДНК с помощью вертикального или горизонтального электрофореза на электрофоретических ячейках, производства фирмы «Хеликон» (Россия). В зависимости от размера разделяемых фрагментов ДНК использовали агарозный гель 2-3% концентрации, приготовленный на основе ТВЕ-буфера, окрашенный раствором бромистого этидия (0,01%). Визуализация фореграмм осуществлялась в темном боксе с трансиллюминатором фирмы UVP (Швеция). Полиморфизм гена фактора некроза опухоли а (-308 G/A TNFa). Ген
TNFa расположен на шестой хромосоме (6р21.3) в локусе, кодирующем молекулы главного комплекса гистосовместимости первого (HLA-A, В, С) и второго классов (HLA-DP, DQ, DR).
Анализ локуса -308G/ATNFa осуществлялся с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров (табл. 4) по методике указанной в работе (Hulkkonen, 2002). Реакция проводилась в 12,5 мкл общего объема смеси, содержащей 33,5 мМ трис-HCl (рН=8,8), 1,25 мМ MgCl2, 0,5 мкг геномной ДНК, по 5 пМ каждого праймера, по 100 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (4 мин при 94С) выполняли 35 циклов амплификации по схеме: денатурация - 1 мин. при 94С; отжиг праймеров - 1 мин. при 60С; элонгация - 1 мин при 72С. Затем пробы выдерживали 10 мин при 72С и охлаждали. После ПДРФ-анализа продукты рестрикции разделяли в 3% агарозном геле, предварительно окрашенном бромистым этидием, в течение 40 мин при 160V. В качестве электрофорезного буфера использовали ІхТАЕ (трис-ацетатный буфер). Результаты анализировали в проходящем ультрафиолетовом свете. Фрагменты длиной 107 п.н. соответствовали генотипу -308 АА TNFa, 87 и 20 п.н. - генотипу -308 GG TNFa, а 107, 87 и 20 п.н. выявлены у гетерозигот -308 GA TNFa (рис. 3).
Электрофоретическое разделение продуктов рестрикции reHaTNFa: 1, 12-13 - гетерозиготы -308 GA TNFa; 2-10 гомозиготы -308 GG TNFa ; 11- гомозигота -308 АА TNFa.
Полиморфизм гена лимфотоксина а (+250 A/G Lta ). Ген Lta локализуется на 6 хромосоме в регионе р21.33. Ген лимфотоксина имеет сходную с геном фактора некроза опухоли экзон-интронную структуру. Степень аминокислотной гомологиии Lta и TNFa составляет около 30%, причем области выраженной гомологии локализуются в консервативных участках молекулы.
Анализ полиморфизма гена +250 A/G Lta в 1 интроне проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров (табл. 4) по методике указанной в работе (Quasney М., at al., 2001). Реакция проводилась в 12,5 мкл общего объема смеси, содержащей 33,5 мМ трис-НС1 (рН=8,8), 1,25мМ MgCl2, 0,5 мкг геномной ДНК, по 5 пМ каждого праймера, по 100 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (4 мин при 94С) выполняли 35 циклов амплификации по схеме: денатурация — 30 сек. при 94С; отжиг праймеров - 30 сек. при 68С; элонгация - 42 сек. при 74С. Затем пробы выдерживали 10 мин при 72С и охлаждали. После ПДРФ-анализа продукты рестрикции анализировали в 2%-ном агарозном геле, окрашенным бромистым этидием, в течение 30 минут при 150V. В качестве электрофорезного буфера использовали ІхТАЕ (трис-ацетатный буфер). Затем пробы идентифицировали в проходящем УФ-свете. Фрагменты длиной 782 п.н. соответствовали генотипу +250 АА Lta, 586 и 196 п.н. -генотипу +250 GG Lta, фрагменты длиной 782, 586 и 196 п.н. наблюдались у гетерозигот +250 AG Lta (рис.4).
Электрофоретическое разделение продуктов рестрикции гена Lta: 1, 4, 9-11 - гомозиготы +250 АА Lta; 2 - гомозигота +250 GG Lta; 3, 5-8 - гетерозиготы +250 AG Lta. Полиморфизм рецептора фактора некроза опухоли 1 типа (+36 A/G
TNFR1). Ген +36A/G TNFR1 расположен на хромосоме 6р55. Его продукт — рецептор фактора некроза опухоли 1 типа ответственен за острый воспалительный ответ и найден в большинстве типов клеток. Фактор некроза опухоли, соединяясь со своими рецепторами, образует димер, обусловливающий конформационные изменения этого рецепторного домена и инициацию определенного клеточного сигнала.
Анализ полиморфизма гена TNFR1 в области 1 экзона (+36 A/G TNFR1) проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК на амплификаторе IQ5 (Bio-Rad) с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров и специфических зондов (табл. 4) с последующим анализом полиморфизма методом дискриминации аллелей. Реакционная смесь объемом 25 мкл включает: 67 мМ трис-HCl (рН=8,8), 2,5мМ MgCb, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по 5 пкмоль каждого зонда, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (4 мин при 95С) выполняли 40 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров -. 1 мин. при 59С; денатурация - 15 сек при 95С.
При проведении ПНР в амплификаторе с флюоресцентной детекцией (амплификатор IQ5) генотипирование осуществлялось методом Tag Man зондов по данным величин RFU (уровень относительной флуоресценции) каждого зонда, представленном на рисунке 5. Зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю G, зонд с красителем FAM -аллелю А.
Две полосы, вертикальная и горизонтальная, делят график на четыре секции: одна для каждого гомозиготного состояния, одна для гетерозиготного состояния и секция без реакции. Присвоение генотипов неизвестным образцам определяется вычерчиванием RFU для одного флуорофора (на оси х) относительно RFU для другого флуорофора (на оси у) на диаграмме дискриминации аллелей).
Исследование ролишолиморфных маркеров в/развитии - миомы матки, сочетающейся с аденомиозом
При рассмотрении миомы матки важное патогенетическое значение имеет ее сочетание с гиперпластическими процессами эндометрия. Это обусловлено тем, что, во-первых, гиперпластические процессы матки (к которым относят миому матки, аденомиоз, гиперпластические процессы эндометрия (Дамиров М.М., 2000, Акулинина И. Н., 2002, Баскаков В.П. и др., 2002, Серов В. Н. и др., 2004, Чепик О.Ф., 2004, Коган Е.А. и др., 2007) имеют общие молекулярные звенья патогенеза (Аничков Н. М. и др., 2005, Сидорова И.С. и др., 2007) и поэтому достаточно часто встречаются сочетано (Кулова Ф. Т. и др., 2001, Савицкий Г.А. и др., 2003, Адамян Л. В. и др., 2005,2006). Во-вторых, травматическое воздействие на миометрий, обусловленное удалением полипа эндометрия или вмешательством по поводу гиперплазии эндометрия, может выступать триггерным фактором в патогенезе миомы матки (Тихомиров А.А. и др., 2006). В-третьих, другим триггерным фактором развития миомы матки, связанным с внутриматочным вмешательством по поводу гиперпластических процессов эндометрия, могут являться развивающиеся в результате этого воспалительные заболевания гениталий (Flake G.P. et al.,2003, Hartmann K.E. et al.,2006). В связи с этим нами проведен анализ распределения исследуемых молекулярно-генетических маркеров у больных миомой матки в зависимости от ее сочетания с гиперпластическими процессами эндометрия. Установлено, что среди 240 пациенток с миомой матки гиперпластические процессы эндометрия встречались у 32,08% (77 человек). Причем на долю полипа эндометрия приходится 18,75%, а удельный вес гиперплазии эндометрия, сочетающихся с миомой матки составляет 13,33%.
Анализ распределения генетических полиморфизмов факторов некроза опухоли и их рецепторов среди больных миомой, сочетающейся с гиперпластическими процессами эндометрия и без ГПЭ в сравнении с контрольной группой (табл.8) выявил достоверные различия в концентрации генотипов и аллелей по л оку су -308 G/A TNFa .
Получено, что среди пациенток с миомой матки в сочетании с ГПЭ частота полиморфного маркера -308 АА фактора некроза опухоли a составляет 8,00%, что статистически достоверно больше в 6 раз концентрации данного генетического маркера в группе больных миомой матки без гиперпластических процессов эндометрия (1,32%, р=0,03, с учетом поправки Бонферрони рсог=0,09) и более чем в 12 раз превышает аналогичный показатель в контрольной группе (0,63%, р=0,01, рсог=0,03). При этом, следует отметить, что распространенность данного молекулярно-генетического маркера среди больных миомой матки без ГПЭ и в контрольной группе не отличается (р 0,05).
Изучение концентрации аллеля -308 A TNFa в исследуемых группах больных (рис. 8) показало его более высокие значения в группе пациенток с миомой матки, сочетающейся с гиперпластическими процессами эндометрия (17,33%), как в сравнении с больными миомой матки без ГПЭ (12,50%) так и с женщинами контрольной группы (9,87%). Следует подчеркнуть достоверность различий в частотах аллеля -308 A TNFa между больными миомой матки в сочетании с ГПЭ и контрольной группой (%2=4,57, р=0,03, OR=l,91 95%С11,05-3,48).
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о высокой частоте генотипа -308 АА и аллеля -308 А фактора некроза опухоли а среди
Эти данные позволяют считать генетические маркеры -308 АА TNFa и -308 A TNFa факторами риска развития миомы матки, сочетающейся с гиперпластическими процессами эндометрия (отношения шансов равны 13,56 и 1,91, соответственно).
Далее мы провели более детальный анализ и изучили особенности распределения рассматриваемых молекулярно-генетических маркеров в зависимости от вида гиперпластических процессов эндометрия (полип эндометрия и гиперплазия эндометрия) (рис.9 и 10). Установлено, что в группе женщин с миомой матки, сочетающейся с полипом эндометрия концентрация генотипа -308 АА TNFa составляет 11,63% (рис.9) и является максимальной как в сравнении с больными с миомой матки в сочетании с гиперплазией эндометрия (3,13%, р 0,05), с миомой матки без ГПЭ (1,32%, X2=7,54, p=0,007, pcor=0,021, OR=9,87 95%CI 1,61-76,84), так и женщинами контрольной группы (0,63%, х2=Ю,49, р=0,002, pcor=0,006, OR=20,53 95%С1 2,22-486,81).
Рис. 9. Частоты генотипа -308АА TNF а в группах больных миомой матки в зависимости от ее сочетания с полипом и гиперплазией эндометрия и в контрольной группе, %
Аналогичные данные получены и по распределению аллеля -308 А фактора некроза опухоли а среди вышерассмотренных групп женщин (рис.10). Выявлена наибольшая частота данного генетического маркера среди больных миомой матки, сочетающейся с полипом эндометрия (19,77%) которая статистически достоверно превышает соответствующий показатель контрольной группы (9,87%, у?=5,Ъ6, р=0,02, OR=5,36 95%С1 1,12-4,49).
Таким образом, полученные в данном разделе работы результаты позволяют заключить, что генетический полиморфизм -308 G/A фактора некроза опухоли а ассоциирован с формированием миомы матки, сочетающейся с гиперпластическим процессами эндометрия. При этом факторами риска развития миомы матки, сочетающейся с гиперпластическими процессами эндометрия являются генотип -308 АА и аллель -308 A TNFa, значительно чаще встречающиеся в данной группе больных по сравнению с контрольной группой. Наибольшую концентрацию они имеют среди пациенток с миомой матки, сочетающейся с полипом эндометрия. Обращает на себя внимание и еще один факт: у больных миомой матки с гиперпластическими процессами эндометрия наблюдается наибольшая частота воспалительных заболеваний гениталий, которая в данной группе больных составляет 85,71%) и статистически достоверно превышает распространенность этих заболеваний среди пациенток с миомой матки без ГПЭ (69,75%, %2=6,25, р=0,013). Согласно данным литературы (Демьянов А.В. и др.,2003) одним из медико-биологических эффектов факторов некроза опухоли является их выраженное провоспалительное действие.
Анализ роли наследственной отягощенности в характере взаимосвязей молекулярно-генетических маркеров с размерами миоматозных узлов
Таким образом, полученные данные свидетельствует о том, что генетические полиморфизмы -308 G/A фактора некроза опухоли а и +36 A/G рецептора фактора некроза опухоли 1-го типа играют важную роль в формировании миоматозных узлов в матке у женщин с наследственной отягощенностью по данной патологии. Пациентки, имеющие высокопродуктивные аллели по этим полиморфизмам отличаются значительно меньшими (в среднем на 30%) площадью и объемом миоматозных узлов. При этом обращает на себя внимание низкий уровень статистической значимости этих отличий (для всех трех выявленных ассоциаций р=0,004 - 0,006), который существенно меньше данных показателей в общей группе больных миомой матки (р=0,021 — 0,047). Кроме этого, следует отметить, что в рассматриваемой нами групп женщин с наследственной отягощенностью выявлены высокодостоверные ассоциации генетического маркера -308 G/A TNFa с площадью и объемом миоматозных узлов, тогда как в общей группе пациенток с миомой матки данный полиморфизм «проявил» себя лишь в сочетании с локусом +36 A/G TNFR1.
Установив значимые «моноэффекты» исследуемых генетических полиморфизмов фактора некроза опухоли а и его рецептора 1-го типа в изменчивости характера поражения матки миоматозными узлами среди женщин с наследственной отягощенностью на следующем этапе работы мы проанализировали роль комбинаций данных генетических полиморфизмов в формировании таких патогенетически важных показателей как площадь и объем миоматозных узлов. Получено, что у женщин с миомой матки, одновременно имеющих в генотипе высокопродуктивные аллели -308 А TNFa (генотипы -308 АА и -308 GA) и +36 G TNFR1 (генотипы +36 GG и +36 AG) медиана площади миоматозных узлов равняется 84,39 см (интерквартильный размах 63,58 - 176,62 см2), что значительно меньше (на 64,65%, р=0,047 аналогичного показателя пациенток без этих аллелей (сочетание генотипов -308 GG TNFa и +36 АА TNFR1) - 138,95 см2 (нижний квартиль - 76,93 см , верхний квартиль 220,58 см ) (рис. 16). генотипов локусов -308 G/A TNFa и +36 A/G TNFR1 в группе женщин с наследственной отягощенностью
Пациентки с другими комбинациями аллелей по этим полиморфизмам характеризуются средними значениями площади миоматозных узлов (медиана 97,99 см2, интерквартильный размах 45,53 - 176,62 см2). Аналогичной направленности взаимосвязи обнаружены нами и по объему миоматозных узлов (рис.17). Женщины, имеющие одновременно в генотипе высокородуктивные аллели -308 A TNFa (генотипы -308 АА и -308 GA) и +36 G TNFR1 (генотипы +36 GG и +36 AG) характеризуются наименьшим объемом миоматозных узлов (медиана 65,42 см3, нижний квартиль - 46,62 см3, верхний квартиль — 175,58 см3) в сравнении с пациентками без этих аллелей (генотипы -308 GG TNFa и +36 АА TNFR1) (медиана 111,63 см3, интерквартильный размах 47,69 - 228,96 см3). Различия между сравниваемыми группами по объему миоматозных узлов достигают 70,64% при уровне значимости р=0,047. Больные с другими комбинациями аллелей по локусам -308 G/A TNFa и +36 A/G TNFR1 по объему миоматозных узлов занимают промежуточное положение между двумя вышерассмотренными группами женщин с миомой матки (медиана - 73,30 см3, интерквартильный интервал 22,44 - 143,72 см2).
Таким образом, следует отметить, что сочетания полиморфизмов -308 G/A фактора некроза опухоли а и +36 A/G рецептора фактора некроза опухоли 1-го типа ассоциированы с характером поражения матки миоматозными узлами при наследственной предрасположенности по данной патологии. При этом при учете парных комбинаций полиморфизмов различия по площади и объему миоматозных узлов между индивидуумами с крайними вариантами сочетаний генотипов существенно выше (достигают 65 - 70 %), чем при моноэффектах этих полиморфизмов (25 — 40%).
Резюмируя полученные в данном разделе работы результаты можно заключить что, во-первых, наследственная отягощенность является важным фактором в формировании особенностей клинических проявлений миомы-матки, обусловливающая различия в характере поражения матки миоматозными узлами. При наличии наследственной отягощенности по миоме матки- четко проявляются взаимосвязи между генетическими полиморфизмами фактора некроза опухоли а и- его рецептора 1-го типа с площадью и объемом миоматозных узлов. В случаях неотягощенной наследственности по этой патологии взаимосвязи молекулярно-генетических маркеров с характером поражения матки миоматозными узлами отсутствует. Это позволяет сделать вывод о том, что при таком мультифакториальном заболевании, как миома матки генетические полиморфизмы фактора некроза опухоли а (-308 G/A TNFa) и рецептора фактора некроза опухоли 1-го типа (+36 A/G TNFR1) могут являться одним из значимых факторов, определяющих наследственную составляющую данной патологии и в частности играющие важную модифицирующую роль в проявлении таких клинически значимых патогенетических признаков миомы матки как степень ее поражения миоматозными узлами.
Во-вторых, направленность выявленных взаимосвязей между молекулярно-генетическими маркерами и степенью поражения матки миоматозными узлами свидетельствует о том, что площадь и объем миоматозных узлов у пациенток, имеющих в генотипе высокопродуктивные аллели полиморфизмов -308 G/A TNFa (аллель А) и +36 A/G TNFR1 (аллель G) на 25 - 40 % меньше, чем у женщин с низкопродуктивными генотипами по этим локусам (генотипы -308 GG TNFa и +36 АА TNFR1). Характер вышеуказанных взаимосвязей согласуется с функциональной значимостью факторов некроза опухоли и их рецепторов, являющихся, как свидетельствуют данные литературы, важным элементом системы апоптоза в организме (Kurachi О. et al.,2001, Змушко Е.И. и др.,2001, Рыдловская А.В.,2005) (медико-биологические основы выявленных ассоциаций будут детально рассмотрены нами в одном из следующих разделов данной работы).
В-третьих, уровень статистической значимости (т.е. показатель характеризующий вероятность гипердиагностики) моноэффектов полиморфных генетических маркеров среди женщин с наследственной отягощенностью (р=0,004 — 0,006) существенно более низкий в сравнении с общей группой больных миомой матки (р=0,021 - 0,047).
В-четвертых, при сочетании в генотипе генетических полиморфизмов -308 G/A TNFa и +36 A/G TNFR1 у пациенток с наследственной отягощенностью степень выраженности их патогенетических эффектов при миоме матки возрастает: при одновременном наличии в генотипе женщины высокопродуктивных аллелей -308 A TNFa и +36 G. TNFR1 (генотипы -308 АА, -308 GA TNFa и +36 GG, +36 AG TNFR1) площадь и объем миоматозных узлов на 65 - 70 % меньше чем у пациенток без этих аллелей (сочетание генотипов -308 GG TNFa и +36 АА TNFR1).
