Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Репарация ДНР ДНК у дрожжей 7
Глава 2. Мутанты дрожжей с повьшеннои чувствительностью к ионизирующим излучениям
Глава 3. Генетическая нестабильность у дрожжей 18
Глава 4. Мутагенность генетической рекомбинации 37
Материалы и методы 43
Результаты и обсуждение
Глава I. Генетическая нестабильность по признаку морфологии колоний у дрожжей - сахаромицетов, индуцированных рентгеновским облучением 52
Глава II. Изучение мутаций по гену LYS2 индуцированных рентгеновским облучением у гаплоидов и диплоидов дрожжей 78
Выводы 101
Список сокращений 103
Список литературы 104
- Мутанты дрожжей с повьшеннои чувствительностью к ионизирующим излучениям
- Генетическая нестабильность у дрожжей
- Мутагенность генетической рекомбинации
- Изучение мутаций по гену LYS2 индуцированных рентгеновским облучением у гаплоидов и диплоидов дрожжей
Мутанты дрожжей с повьшеннои чувствительностью к ионизирующим излучениям
Из-за недостатка места в этом разделе приведен только основной материал по репарации ДНР ДНК у дрожжей, представляющий непосредственный интерес для темы данной работы.
Известно, что ионизирующие излучения вызывают различные повреждения ДНК, но наиболее биологически важными среди них являются ДНР (Жестяников, 1979). По оценкам разных авторов (вопшга et al., 1975;
Lehman, ОгтегаЛ, 1970; Youngy, Smith, 1976) СООТНОШЄНИЄ ДНР/ОДНОНИТЄ вый разрыв составляет 1:10-1:20. Индуцируемые ионизирующим облуче _тр нием ДНР ДНК у дрожжей возникают с частотой 6-Ю на дальтон на Гр (Resnick, Martin, 1976).
В экспериментах на бактериофаге (Freifelder, 1965) и на трансформирующей ДНК (Randolph, setlow, 1972) было показано, что одному ДНР соответствует одно летальное событие.
Одним из наиболее убедительных свидетельств роли ДНР ДНК в гибели клеток являются данные по изучению репарации ДНР у радиочувствительных мутантов различных организмов. Так у Micrococcus radiodu-rans (Suhadi et al., 1972), В Клетках дрожжей (Ho,Mortimer, 1975; Resnick, Martin, 197б)И Escherichia coli (Krasin,Hutchinson,1977) мутанты с повышенной чувствительностью к ионизирующей радиации не способны репарировать ДНР и гибель мутантных клеток наблюдается при дозах, вызывающих 1-2 двунитевых разрыва на клетку. У дрожжей, так же как у целого ряда других организмов обнаружена эффективная репарация ДНР при инкубации в питательной среде у гаплоидных клеток в логарифмической фазе роста (но, Mortimer, 1975)и у диплоидных клеток в логарифмической фазе роста (Resnick, Martin, 1976). Это было показано по увеличению молекулярного веса ДНК с помощью седимента-ционного анализа. Эта репарация осуществлялась за 3-4 часа. Целый РЯД авторов (Howard-Flanders, 1973; Resnick, 1975,1976; Захаров, 1976; Королев, Грачева, 1972) высказали предложение о рекомбинаци-онном механизме репарации ДНР ДНК.
Резник (Resnick 1975, 1976) предложил две так называемые ре-комбинационные модели репарации ДНР "Согласно первой модели (рис.1), сначала происходит экзонуклеазная деградация части материала в районе двунитевого разрыва таким образом, что на обоих концах порванного дуплекса ДНК образуются "липкие концы" (рис.16). Затем происходит надрезание неповрежденного дуплекса и высвобождение одной из его полинуклеотидных нитей, которая образует петеродуплекс с гомологичной последовательностью "липкого конца" порванного дуплекса (рис. 1в). После этого "липкий конец" удлиняется в результате работы ДНК-полимеразы (рис.Іг), г:етеродуплекс разрушается, и удлинившийся "липкий конец" находит гомологичный участок ДНК другого "липкого конца" во второй части порванного дуплекса (рис. Ig ). Эта модель не подкреплена экспериментами, указывающими на то, что такая последовательность событий действительно имеет место.
Вторая модель (рис.2) предполагает образование гетеродуплекса с одновременным участием в синапсе обоих фрагментов разорванной мо-лекулы ДНК. В этом случае также происходят события в районе ДНР, приводящие к ситуации, представленной на рис. I в.Отличие заключается в том,- что раскручивание (диссоциация) нити из неповрежденного дуплекса происходит на большем протяжении, что позволяет свободному концу второго фрагмента разорванной молекулы вступать в синап-сис с неповрежденным гомологом с образованием полухиазмы Холидея с двумя гетеродуплексами (рис. 2а). Затем в районе одного или обоих гетеродуплексов могут происходить процессы репликации, диссоциации гетеродуплексов, воссоединения первоначальной структуры гомологов, аналогично тому, что показано на рис. I г, д.
Для этого необходим вторичный эндонуклеолити-ческий разрыв интактной нити неповрежденной молекулы в точке, отмеченной стрелкой на рис. 2а. В результате образуются две хромосомы, рекомбинантные по фланговым, по отношению к ДНР, маркерам (рис. 26). Для завершения репарации необходимо участие ДНК-полимеразы и ДНК-лигазы. Следовательно, последняя модель репарации ДНР подразумевает обязательный реципрокный митотический кроссинговер по фланговым, по отношению к участку репарации ДНР, маркерам. Кроме того, коррекция гетеродуплексов в районе репарации ДНР может приводить к нереципрокной рекомбинации (конверсии).
Следует отметить, что модель рекомбинационной репарации ДНР ДНК предложена ранее Королевым и Грачевой (1972) для ДНР, индуцируемых распадом включенного 32 р.
Рассмотренные выше схемы не исчерпывают всех возможностей для репарации ДНР с участием двух гомологичных дуплексов ДНК. В нашей лаборатории была предложена гипотеза о существовании у дрожжей особого пути репарации ДНР ДНК путем синтеза de novo утраченного фрагмента (Лучник и др. 1979). Эта гипотеза подробно будет обсуждена в разделе, посвященном генетической нестабильности у дрожжей.
Генетическая нестабильность у дрожжей
Рассмотрение этого вопроса представляет интерес для изучения проблемы мутагенности процессов репарации ДНР ДНК. Обширная литература о связи между процессами репарации однонитевых повреждений ДНК,индуцированных УФ-облучением и другими агентами, подробно рассмотрена в обзоре Жестяникова (1979), и выходит за рамки нашего обзора.
Связь между мутационным процессом и рекомбинацией основана на общности некоторых ферментативных этапов репликации, репарации и кроссинговера; кроме этого, источником мутаций могут быть ошибки рекомбинации. Единство генетического контроля рекомбинации и мутационного процесса можно проиллюстрировать несколькими примерами: у дрожжей известны штаммы с повышенной частотой митотического кроссинговера, одновременно обнаруживающие повышенную мутабильность
И чувствительностъ к действию излучений, rad 3, rad 6, rad 18, rad 54, (Арман и др., 1971; Суслова, Захаров, 1971; Brychcy, von Borstel, 1977; Kern, Zimraermann, 1978, Cox, Parry, 1968; von Borstel et al., 1971; Zimmermann, 1968; Golin, Esposito 1977).
Начало изучению проблемы мутагенности рекомбинации, было положено работами Демереца. В 1962 году Демерец (Demerec, 1962) обнаружил интересное явление, которое он назвал "seifing". Он заражал реципиентные мутантные клетки arg A Salmonella typhimurium трансдуцирующим фагом, выросшим на клетках того же штамма с той же мутацией arg А в качестве донорного штамма.
Среди инфицированных колоний было обнаружено повышенное в (3-4 раза)содержание колоний дикого типа, по сравнению со спонтанными реверсиями в незараженном контроле. Частота появления клонов дикого типа зависела от обработки фага низкими дозами УФ, от множественности заражения, от обогащенности среды. На основании этих данных, Демерец предположил, что клетки дикого типа образуются в результате неравного кроссинговера между хромосомой бактерии и трансдуцирующим фрагментом, т.е. являются трансдуктан-тами. Однако дальнейшие исследования явления "seifing" не подтвердили модель нераВНОГО КрОССИНГОВера (Demerec, 1963). В опы-тах, когда ауксотрофные мутанты s.typhimurium, заражали фагом, выросшем на штамме, несущем делецию мутантного сайта, по-прежнему клетки дикого типа возникали с более высокой частотой (в 2-3 раза) , чем в случае спонтанных реверсий.
Демерец (Demerec, 1963) детально изучил 22 генетических локуса, передача которых осуществляется с помощью 12 трансдуцирую-щих фрагментов ДНК, и показал, что 40% из мутантов по этим локу-сам являются "селферами". Автор пришел к заключению, что наличие трансдуцирующего фрагмента в непосредственной близости к "селфер-ному" гену, возникающей при сипансисе фрагмента с гомологичным участком реципиентной ДНК, стимулирует мутабильность генов.
Дальнейшие исследования были посвящены изучению различий уровня мутагенеза во время митоза и мейоза. Наиболее подробно охарактеризован мутагенный эффект рекомбинации у дрожжей s. cerevi-siae. В начале 60-х годов Маньи и фон Борстел (Magni, von Borstei, 1962) описали у этого объекта "мейотический эффект", заключающийся в том, что некоторые типы спонтанных мутаций возникают в мейозе чаще чем в митозе.
В работах Манъи, фон Борстела и их сотрудников (Magni, von Borstei, 1962; Magni, 1963; Magni et al., 1964; Magni et al., 1966; Magni, Sora, 1969) показано, ЧТО В МЄЙ03Є В 10-100 раз, ПО сравнению с митозом повышается частота мутаций типа "сдвиг рамки считывания". Это было показано для трех различных мутаций: met, arg, his. Возникновение мутаций типа "сдвиг рамки считывания" СВЯЗаНО С КрОССИНГОВерОМ В районе ВОЗНИКНОВеНИЯ МутаЦИИ (Magni, 1963) . Маньи и Сора (Magni , sora, 1969) предположили, что мейо-тический эффект связан с ошибочной рекомбинацией и исследовали отношение между мутациями в локусе his-1 и рекомбинацией сцепленных с ним маркеров thr з и arg б у дрожжей. Мутация his-1 показала четкий мейотический эффект. Мейотические реверсии происходили эффективнее там, где прошла рекомбинация маркеров. Частота рекомбинации изменялась от 20% до 71%, соответственно варьировал уровень реверсий. В эксперименте, где частота рекомбинации была равной контрольной, не наблюдалось мейотического эффекта. Таким образом было показано, что увеличение уровня мутирования в течение мейоза прямо коррелирует с рекомбинацией в районе мутации. Мейотический Эффект Обнаружен у Ascobolus immersus (Rizet et al., 1969; Girard, Rossignol, 1974), Neurospora crassa (Bausum, Wagner, 1965; Bausum, 1972), Schizosaccharomyces pombe (Leupold, 1955). Особенности мутагенеза, связанного с рекомбинацией изучались также на Drosophyla melanogaster (Lewis, 1959). Автор показал, что самки гомозиготные по мутации wi подвержены реверсии с -5 частотой 5x10 , в то время как реверсии к дикому типу гораздо реже у самцов, у которых нет кроссинговера.
Однако, результаты исследований мейотического эффекта достаточно Противоречивы. Так КОЛТИН И Другие (Koltin et al., 1975) обнаружили мутагенность митотической рекомбинации у shizophylium commune. Ими был обнаружен значительный процент рекомбинантов среди митотических мутантов по локусам ade 5 и ига 1. В каждой клетке дикариона вегетативного мицелия s. commune каждый из двух родительских геномов представлен отдельным ядром. Слияние ядер происходит редко (частота слияния примерно 10" ). Частота митоти-ческой рекомбинации среди случайной выборки вегетативных клеток -б составляла примерно 10 , тогда как частота рекомбинантов среди митотических :цутантных клеток - 14%, что показывает явное увеличение митотической рекомбинации среди мутантов. Исходя из этого факта, авторы предположили, что митотическая рекомбинация у s. commune может быть мутагенной. В то же время мутагенность мейотической рекомбинации у s. commune в этой работе не обнаружена.
Что касается мутагенности митотической рекомбинации, то аналогичное заключение сделал Виллиамс (Williams, 19 80) в исследовании на миксомицете Dictiosteiium discoideum. Он исследовал мутацию устойчивости к актидиону - АСГ. У диплоида наблюдается часто -б -5 та мутации 10 , что всего в 10 раз ниже, чем у гаплоида (ю ).
Если мутации возникают у диплоида независимо в двух гомологах, то частота их проявления должна быть 10 . Автор допустил возможность возникновения мутации в одной хромосоме с последующей ее гомозиготизацией. Частота гомозиготизации по сцепленной с АСГ ts-мутаций -10" . Вероятность возникновения мутации в одной хромосоме и последующей гомозиготизации 10" , т.е. меньше на три порядка. Автор заключил, что в данном случае имеется сильный мутагенный эффект митотической рекомбинации.
Мутагенность генетической рекомбинации
Рассмотрение этого вопроса представляет интерес для изучения проблемы мутагенности процессов репарации ДНР ДНК. Обширная литература о связи между процессами репарации однонитевых повреждений ДНК,индуцированных УФ-облучением и другими агентами, подробно рассмотрена в обзоре Жестяникова (1979), и выходит за рамки нашего обзора.
Связь между мутационным процессом и рекомбинацией основана на общности некоторых ферментативных этапов репликации, репарации и кроссинговера; кроме этого, источником мутаций могут быть ошибки рекомбинации. Единство генетического контроля рекомбинации и мутационного процесса можно проиллюстрировать несколькими примерами: у дрожжей известны штаммы с повышенной частотой митотического кроссинговера, одновременно обнаруживающие повышенную мутабильность И ЧувСТВИТелЬНОСТЪ К ДеЙСТВИЮ ИЗЛучеНИЙ, rad 3, rad 6, rad 18, rad 54, (Арман и др., 1971; Суслова, Захаров, 1971; Brychcy, von Borstel, 1977; Kern, Zimraermann, 1978, Cox, Parry, 1968; von Borstel et al., 1971; Zimmermann, 1968; Golin, Esposito 1977).
Начало изучению проблемы мутагенности рекомбинации, было положено работами Демереца. В 1962 году Демерец (Demerec, 1962) обнаружил интересное явление, которое он назвал "seifing". Он заражал реципиентные мутантные клетки arg A Salmonella typhimurium трансдуцирующим фагом, выросшим на клетках того же штамма с той же мутацией arg А в качестве донорного штамма.
Среди инфицированных колоний было обнаружено повышенное в (3-4 раза)содержание колоний дикого типа, по сравнению со спонтанными реверсиями в незараженном контроле. Частота появления клонов дикого типа зависела от обработки фага низкими дозами УФ, от множественности заражения, от обогащенности среды. На основании этих данных, Демерец предположил, что клетки дикого типа образуются в результате неравного кроссинговера между хромосомой бактерии и трансдуцирующим фрагментом, т.е. являются трансдуктан-тами. Однако дальнейшие исследования явления "seifing" не подтвердили модель нераВНОГО КрОССИНГОВера (Demerec, 1963). В опы-тах, когда ауксотрофные мутанты s.typhimurium, заражали фагом, выросшем на штамме, несущем делецию мутантного сайта, по-прежнему клетки дикого типа возникали с более высокой частотой (в 2-3 раза) , чем в случае спонтанных реверсий.
Демерец (Demerec, 1963) детально изучил 22 генетических локуса, передача которых осуществляется с помощью 12 трансдуцирую-щих фрагментов ДНК, и показал, что 40% из мутантов по этим локу-сам являются "селферами". Автор пришел к заключению, что наличие трансдуцирующего фрагмента в непосредственной близости к "селфер-ному" гену, возникающей при сипансисе фрагмента с гомологичным участком реципиентной ДНК, стимулирует мутабильность генов.
Дальнейшие исследования были посвящены изучению различий уровня мутагенеза во время митоза и мейоза. Наиболее подробно охарактеризован мутагенный эффект рекомбинации у дрожжей s. cerevi-siae. В начале 60-х годов Маньи и фон Борстел (Magni, von Borstei, 1962) описали у этого объекта "мейотический эффект", заключающийся в том, что некоторые типы спонтанных мутаций возникают в мейозе чаще чем в митозе. В работах Манъи, фон Борстела и их сотрудников (Magni, von Borstei, 1962; Magni, 1963; Magni et al., 1964; Magni et al., 1966; Magni, Sora, 1969) показано, ЧТО В МЄЙ03Є В 10-100 раз, ПО сравнению с митозом повышается частота мутаций типа "сдвиг рамки считывания". Это было показано для трех различных мутаций: met, arg, his. Возникновение мутаций типа "сдвиг рамки считывания"
Связано с кроссинговером в районе возникновения мутации (magni, 1963) . Маньи и Сора (Magni , sora, 1969) предположили, что мейо-тический эффект связан с ошибочной рекомбинацией и исследовали отношение между мутациями в локусе his-1 и рекомбинацией сцепленных с ним маркеров thr з и arg б у дрожжей. Мутация his-1 показала четкий мейотический эффект. Мейотические реверсии происходили эффективнее там, где прошла рекомбинация маркеров. Частота рекомбинации изменялась от 20% до 71%, соответственно варьировал уровень реверсий. В эксперименте, где частота рекомбинации была равной контрольной, не наблюдалось мейотического эффекта. Таким образом было показано, что увеличение уровня мутирования в течение мейоза прямо коррелирует с рекомбинацией в районе мутации. Мейотический Эффект Обнаружен у Ascobolus immersus (Rizet et al., 1969; Girard, Rossignol, 1974), Neurospora crassa (Bausum, Wagner, 1965; Bausum, 1972), Schizosaccharomyces pombe (Leupold, 1955). Особенности мутагенеза, связанного с рекомбинацией изучались также на Drosophyla melanogaster (Lewis, 1959). Автор показал, что самки гомозиготные по мутации wi подвержены реверсии с -5 частотой 5x10 , в то время как реверсии к дикому типу гораздо реже у самцов, у которых нет кроссинговера.
Изучение мутаций по гену LYS2 индуцированных рентгеновским облучением у гаплоидов и диплоидов дрожжей
Как указывалось в обзоре литературы, репарация ДНР ДНК, происходит за счет рекомбинационного взаимодействия с неповрежденной гомологичной молекулой ДНК, для чего необходимо наличие в одном ядре двух гомологичных дуплексов ДНК. Можно предположить, что при реком-бинационной репарации ДНР ДНК происходят ошибки рекомбинации, что может привести к неслучайному совпадению мутаций в обоих гомологах.
Задачей этой части работы являлась попытка выяснения вопроса о мутагенности репарации ДНР ДНК. Известна гипотеза (Magni, von Borstel, 1962)0 наличии у диплоидов, по крайней мере в мейозе, дополнительного механизма возникновения мутаций, связанного с ошибками генетической рекомбинации (например, неравный кроссинговер). Мутации, возникающие по такому механизму, должны выявляться преимущественно как мутации типа "сдвиг рамки считывания" или делеции.
Удобным инструментом при исследовании мутационных событий, происходящих с низкимичастотами, являются генетические системы, позволяющие селективно отбирать прямые и обратные мутации. Для дрожжей s. cerevisiae такая система была предложена в лаборатории Шермана (chatooet ai., 1979). Этот метод основан на способности мутантов по гену LYS2 (в отличие от штаммов дикого типа) усваивать « -аминоадипиновую
" Конструирование модельной генетической системы для сравнительного изучения механизмов возникновения мутантов по гену LYS2 у гаплоидов и диплоидов дрожжей, и изучение механизмов возникновения спонтанных, УФ- и рентгениндуцированных мутантов было проведено в совместной работе с сотрудниками каф. генетики и селекции Ленинградского университета Ю.О.Черновым и Д.А. Гррдениным. кислоту (промежуточный метаболит биосинтеза лизина) в качестве единственного источника азота. Мы использовали мутационную систему lys 2 для изучения мутабильности процесса репарации у дрожжей.
На рис. 7 приведены генотипы штаммов, использованных в этих опытах. У штамма П3887, полученного при скрещивании ф2 1хр-192 локус PH0I сцеплен с LYS 2 (Mortimer,sc hiid, 1980)и картируется проксимально по отношению к центромере хромосомы 2. При возникновении мутаций lys 2 в одном из гомологов и последующей сегрегации, мутация pho 1 должна часто сегрегировать совместно с lys 2.
Возможны следующие пути возникновения мутантов с рецессивным фенотипом: 1) при кроссинговере на участке "CEN 2 - pho 1" или же потере второго гомолога (тогда соответствующая аллель pho 1 сегрегирует совместно с мутацией lys 2). 2) при кроссинговере на участке pho 1 - lys 2 или конверсии в локу-се lys 2(тогда у мутанта iys2сохраняется гетерозиготность по pho 1). Первые два пути возникновения мутантов с рецессивным фенотипом в дальнейшем сокращенно будем называть "мутирование-сегрегация". 3) Совпадение мутаций одновременно в двух гомологах.
Различными авторами обнаружено, что частота спонтанных (Willi ams, 1976) и индуцированных ультрафиолетовым или рентгеновским из лучением (Инге-Вечтомов и др., 1980) мутантов с рецессивным феноти пом у диплоидных микроорганизмов на несколько порядков превышает частоту, ожидаемую при случайном совпадении мутаций в двух гомологах.
Детальный анализ закономерностей возникновения мутантов по гену ADE 2 при действии УФ на диплоидные дрожжи, проведенный Гордениным и йнге-Вечтомовым (1981) позволил исключить гипотезу о неслучайном совпадении мутаций в обоих генах диплоидной клетки. Мутанты по гену ADE 2 возникали за счет механизма "мутирование-сегрегация".
Как известно, репарация ДНР ДНК, происходит за счет рекомби-национного взаимодействия с неповрежденной гомологичной молекулой ДНК, для чего необходимо наличие двух гомологичных дуплексов ДНК. Если при репарации ДНР ДНК происходят ошибки рекомбинации, это может привести к неслучайному совпадению мутаций в двух гомологах.
По аналогии с литературными данными можно ожидать, что это будут мутации типа сдвиг рамки считывания. Мы изучили возникновение мутантов с рецессивным фенотипом Lys" у диплоидов дрожжей S.ce-revisiae, облученных рентгеновскими лучами на стадии G1 клеточного цикла. Для контроля отбирали спонтанные мутанты по гену LYS 2. УФ-индуцированные мутанты по гену LYS 2 были взяты для сравнения индуцированными рентгеновским облучением мутантами, поскольку для гена ADE 2 был показан механизм возникновения мутаций мутирование-сегрегация (Горденин, Инге-Вечтомов, 1981).
У пяти штаммов дрожжей было получено более 3000 спонтанных и индуцированных рентгеновским и У-облучением мутантов (табл.9). Эти мутанты далее будем обозначать как Adp+. ;См.ыатериалы и методы) Часть мутантов Adp+ (от 10 до 30% в зависимости от штамма), имела по потребности в лизине фенотип с нечетким проявлением Lys-("leaky"), остальные мутанты были Lys".(в табл.9 представлены суммарные данные по всем штаммам). Среди последних большинство было аллельно мутации lys 2 и незначительная часть (порядка 1%) аллельна lys 5 (причем большинство мутантов lys 5 было среди "leaky" Lys-. Эти результаты соответствуют данным, полученным ранее в лаборатории Шермана (chattoo et al., 1979), согласно которым мутанты lys 5 образуются со значительно меньшей частотой по сравнению с мутантами lys 2 .
