Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 17
1.1. Генетическое картирование генов болезней человека 17
1.1.1. Современные подходы к генетическому картированию генов наследственных болезней человека 18
1.1.2. Генетическое картирование генов наследственных болезней в изолированных популяциях 26
1.2. Современные представления о болезнях, вызванных динамическими мутациями 31
1.2.1. Аутосомно-доминантная окулофарингеальная миодистрофия 37
1.2.2. Аутосомно-рецессивная атаксия Фридрейха 48
1.2.3. Х-сцепленная спинально-бульбарная амиотрофия Кеннеди 55
1.3. Молекулярные основы заболеваний с низкорослостью 59
1.3.1. Классификация заболеваний с низкорослостью 60
1.3.2. Синдромы с задержкой роста при пропорциональном телосложении 70
1.3.3. Клинические особенности синдрома 3-М 79
1.3.4. Диагностика заболеваний с низким ростом 94
1.4. Этногенез и генетическое разнообразие якутского этноса 96
1.4.1. Этноисторические сведения о якутах 98
1.4.2. Наследственные болезни в якутской популяции 104
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 113
2.1. Клинико-генеалогическая характеристика больных и их родственников из обследованных семей 115
2.2. Молекулярно-генетические и другие методы анализа материала 118
2.2.1. Молекулярно-генетический анализ 118
2.2.2. Гистологическое исследование 130
2.3. Анализ генетического сцепления и методы статистического анализа результатов исследования 131
ГЛАВА 3. Структура и частота наследственной патологии в республике Саха (Якутия) 133
ГЛАВА 4. Клинико-генеалогический и молекулярно генетический анализ болезней, вызванных динамическими мутациями 141
4.1. Аутосомно-доминантная окулофарингеальная миодистрофия в Республике Саха (Якутия) 141
4.1.1. Распространенность окулофарингеальной миодистрофии 141
4.1.2. Клинико-генеалогическая характеристика больных с окулофарингеальной миодистрофией 147
4.1.3. Молекулярно-генетический анализ окулофарингеальной миодистрофии 158
4.1.3.1 .Поиск мутации в гене PABPN1 158
4.1.3.2.Анализ гаплотипов по данным STR-локусов 165
4.1.3.3.Прямая ДНК-диагностика окулофарингеальной миодистрофии 171
4.1.3.4.Алгоритм диагностики окулофарингеальной миодистрофии в Республике Саха (Якутия) 172
4.1.4. Резюме 173
4.2. Аутосомно-рецессивная атаксия Фридрейха в Республике Саха (Якутия) 177
4.2.1. Распространенность атаксии Фридрейха 177
4.2.2. Клинико-генеалогическая характеристика больных с атаксией Фридрейха 179
4.2.3. Молекулярно-генетический анализ атаксии Фридрейха 181
4.2.4. Алгоритм диагностики атаксии Фридрейха в Республике Саха (Якутия) 184
4.2.5. Резюме 186
4.3. Х-сцепленная спинально-бульбарная амиотрофия Кеннеди в Республике Саха (Якутия) 187
4.3.1. Распространенность спинально-бульбарной амиотрофии Кеннеди 187
4.3.2. Клинико-генеалогическая характеристика больных со спинально-бульбарной амиотрофией Кеннеди 190
4.3.3. Молекулярно-генетический анализ спинально-бульбарной амиотрофии Кеннеди 194 4.3.3.1 .Поиск мутации в гене AR 194
4.3.3.2.Быстрая ДНК-диагностика спинально-бульбарной амиотрофии Кеннеди 198
4.3.4. Алгоритм диагностики спинально-бульбарной амиотрофии Кеннеди в Республике Саха (Якутия) 199
4.3.5. Резюме 201
ГЛАВА 5. Клинико-генеалогический и молекулярно-генетический анализ наследственных заболеваний, характеризующихся низким ростом 203
5.1. Якутский синдром низкорослости в Республике Саха (Якутия) 205
5.1.1. Распространенность якутского синдрома низкорослости 205
5.1.2. Клинико-генеалогическая характеристика больных с якутским синдромом низкорослости 213
5.1.3. Молекулярно-генетический анализ якутского синдрома низкорослости 227
5.1.3.1.Молекулярно-генетический анализ сцепления с генетическими локусами, ответственными за развитие низкорослости 227
5.1.3.2.Полногеномный скрининг и картирование гена 230
5.1.3.3.Идентификация мутации в гене CUL7 241
5.1.3.4.Быстрая идентификация мутации 4582insT в гене CUL7 у якутов 248
5.1.3.5.Популяционные исследования частоты мутации 4582insT в гене CUL7 в популяциях Республики Саха (Якутия) и Сибири 250
5.1.3.6.Анализ возраста мутации 4582insT в гене CUL7 в якутской популяции 251
5.1.4. Гистологическое исследование тканей плаценты и легких плодов с якутским синдромом низкорослости или 3-М синдромом 252
5.1.5. Алгоритм диагностики якутского синдрома низкорослости в Республике Саха (Якутия) 254
5.1.6. Пренатальная диагностика якутского синдрома низкорослости или 3-М синдрома в якутской популяции 255
5.1.7. Резюме 260
5.2. Синдром низкорослости с колбочковой дисфункцией, атрофией зрительных нервов и пельгеровской аномалией лейкоцитов в Республике Саха(Якутия) 265
5.2.1. Распространенность синдрома низкорослости с колбочковой дисфункцией, атрофией зрительных нервов и пельгеровской аномалией лейкоцитов 265
5.2.2. Клинико-генеалогический анализ больных с синдромом низкорослости с колбочковой дисфункцией, атрофией зрительных нервов и пельгеровской аномалией лейкоцитов 267
5.2.3. Молекулярно-генетический анализ синдрома низкорослости с колбочковой дисфункцией, атрофией зрительных нервов и пельгеровской аномалией лейкоцитов 297
5.2.3.1.Молекулярно-генетический анализ сцепления с генетическими локусами, ответственными за развитие низкорослости 297
5.2.3.2.Полногеномный скрининг и картирование гена 300
5.2.3.3.Поиск гена и идентификация мутации в генах DDX1 и NAG 306
5.2.3.4.Быстрая идентификация мутации G5741—»А в гене NA G у якутов 316
5.2.3.5.Анализ возраста миссенс-мутации G5741— А в гене NAG в якутской популяции 317
5.2.4. Иммуногистохимическое исследование на NA G 318
5.2.5. Алгоритм диагностики синдрома низкорослости с колбочковой дисфункцией, атрофией зрительных нервов и пельгеровской аномалией лейкоцитов в Республике Саха (Якутия) 319
5.2.6. Резюме 320
ГЛАВА 6. Общее заключение 326
Выводы 336
Практические рекомендации 339
Список использованной литературы
- Генетическое картирование генов наследственных болезней в изолированных популяциях
- Анализ генетического сцепления и методы статистического анализа результатов исследования
- Клинико-генеалогическая характеристика больных с окулофарингеальной миодистрофией
- Алгоритм диагностики атаксии Фридрейха в Республике Саха (Якутия)
Введение к работе
Актуальность проблемы. Среди факторов, определяющих уровень здоровья популяций человека, наследственным заболеваниям отводится существенная роль, достигающая по некоторым оценкам 20% (Вельтищев и др., 2007). Поэтому исследование количественных и качественных характеристик груза наследственной патологии и механизмов его формирования в различных регионах страны представляется важной проблемой.
В этиологии детской инвалидности и ограничений жизнедеятельности значительная доля принадлежит наследственным факторам. Так, в Республике Саха (Якутия) среди причин детской инвалидности на первом месте (28,5%) стоят врожденные пороки развития, на втором - заболевания нервной системы (23,9%), на третьем - психические расстройства (11,9%). По данным Росстата среди причин младенческой смертности врожденные пороки развития занимают второе-третье место в Республике Саха (Якутия) и в целом по Российской Федерации. Остается значительной доля врожденных и наследственных заболеваний среди причин детской смертности (в возрасте до 5 лет), в структуре которой на долю хромосомных болезней приходится 2-3% (Новиков, 2008).
Необходимо учитывать, что подходы к диагностике и профилактике наследственных и врожденных заболеваний постоянно совершенствуются, расширяются возможности их применения в разных областях медицинской практики. В настоящее время в отношении лечения наследственной патологии обозначены подходы (патогенетический и генная терапия), сформированы предпосылки к осуществлению генотерапии. И одной из основных задач современной педиатрии и медицинской генетики в настоящее время является установление молекулярно-генетических причин возникновения и развития моногенных заболеваний.
При проведении генетико-эпидемиологических, а также молекулярно-генетических исследований по поиску генов наследственных заболеваний важно учитывать особенности формирования популяций и факторы популяцион-ной динамики. Считается, что при проведении работ по картированию моногенных заболеваний человека предпочтение следует отдавать изолированным популяциям, с так называемым «эффектом основателя» (Seffield et al., 1998; Пу-зырев, 2003; Peltonen et al., 2006; Наследственные болезни..., 2002; Гинтер, 1978; Зинченко и др., 2007; Кириллов, 2008). Якутское население относится именно к таким популяциям и является удобным объектом для картирования и идентификации новых генов наследственных заболеваний.
Длительное время для якутских популяций были характерны расселен-ность на обширной территории небольшими по численности группами, низкая плотность населения и высокий уровень рождаемости, что благоприятствовало проявлению эффектов дрейфа генов. В настоящее время территориальные группы якутов отличаются по антропологическому составу, по языковым диалектам, выражена генетическая гетерогенность территориальных групп, по-разному проявляющаяся для разных классов маркеров. Высокий уровень генетической дифференциации якутских популяций, подтвержден данными о фамильной структуре сельских популяций Якутии, о полиморфизме аутосомных
локусов и (СТО)п-участка гена DMPK, о неравномерности распространенности наследственной патологии (Ноговицына, 2001; Максимова, 2002; Хитринская и др., 2003; Данилова и др., 2005; Тарская и др., 2004; Федорова и др., 2005; Кучер и др., 2007). В то же время низкий уровень генетического разнообразия в популяциях якутов, по сравнению с другими популяциями Евразии, был выявлен при анализе линий митохондриальной ДНК, Y-хромосомы и на основании данных о полиморфизме (СТО)п-повторов гена DMPK в популяциях Якутии (Попова и др., 2002; Пузырев и др., 2003; Pakendorf et al., 2003, 2006; Федорова и др., 2005; Харьков и др., 2008; Федорова, 2008). Проведенные ранее в Якутии генетико-эпидемиологические исследования выявили высокую частоту и широкий спектр наследственной патологии, а также накопление отдельных форм моногенной патологии: спиноцеребеллярной атаксии 1-го типа, миотонической дистрофии, наследственной энзимопенической метгемоглобинемии I типа и т.д. (Ноговицына, 2001; Назаренко и др., 2001; Тарская, 2004; Брахфогель, 2000; Платонов и др., 2004; Захарова, 1982; Банщикова, 2002; Сухомясова, 2005; Га-леева и др., 2006; Барашков, 2007; Яковлева, 2008). Следующим этапом более глубокого изучения частоты и спектра наследственной патологии в регионе, особенно редких форм наследственных заболеваний, является длительное и динамическое наблюдение за больными и их семьями при помощи территориального генетического регистра наследственной и врожденной патологии (Гинтер, 2003; Наследственные болезни ..., 2002; Пузырев и др., 2000).
Исследования, посвященные комплексному медико-генетическому изучению моногенной патологии на основе территориального регистра наследственной и врожденной патологии с применением молекулярно-генетических методов, в республике ранее не проводились. Таким образом, является актуальным проведение комплексного генетико-эпидемиологического исследования наследственной патологии с привлечением молекулярно-генетических методов исследования в РС(Я) с целью дальнейшего планирования и организации медико-генетической помощи населению Якутии.
Цель исследования: клинико-генеалогический анализ этноспецифиче-ской наследственной патологии в Республике Саха (Якутия), изучение молеку-лярно-генетической основы якутских наследственных болезней и раскрытие механизмов их накопления.
Задачи исследования:
-
Оценить частоту и спектр наследственных заболеваний на основе созданного Республиканского генетического регистра наследственной и врожденной патологии Республики Саха (Якутия), провести анализ распространенности пяти наследственных заболеваний в улусах республики.
-
Провести клинико-генеалогический анализ заболеваний, вызванных динамическими мутациями: спинально-бульбарной амиотрофии Кеннеди, атаксии Фридрейха, окулофарингеальной миодистрофии.
-
Провести поиск мутаций в генах наследственных заболеваний, вызванных динамическими мутациями: спинально-буль барной амиотрофии Кеннеди, атаксии Фридрейха, окулофарингеальной миодистрофии.
-
Представить клинико-генеалогическую характеристику двух частых наследственных форм низкорослости у якутов.
-
Провести поиск кандидатных генов и идентификацию мутаций для заболеваний с низкорослостью у якутов.
-
Установить популяционные частоты найденных мутаций, оценить время возникновения мутаций в генах этноспецифических наследственных заболеваний у якутов.
-
Выявить популяционно-генетические механизмы накопления наследственных заболеваний на основании построения гаплотипов в локусах исследуемых болезней с привлечением микросателлитных маркеров.
-
Разработать алгоритм медико-генетического консультирования, пренаталь-ной диагностики с использованием молекулярно-генетических методов диагностики для заболеваний с динамическими мутациями и для редких синдромов с низкорослостью.
Научная новизна. В ходе выполнения получены новые знания о распространенности и клинико-генеалогических особенностях заболеваний, вызванных динамическими мутациями: окулофарингеальной мио дистрофии, атаксии Фридрейха, спинально-бульбарной амиотрофии Кеннеди в Республике Саха (Якутия). В результате выполнения работы впервые проведен молекулярно-генетический анализ вариабельности генов PABPN1 при окулофарингеальной миодистрофии, AR при болезни Кеннеди, FRDA при атаксии Фридрейха и найдены мутации, вызывающие эти заболевания в якутской популяции. Впервые изучена частота редкого якутского синдрома низкорослости (ЯСН, 3-М синдром) в якутской популяции и описан фенотип якутских больных. Впервые проведено картирование гена, поиск кандидатного гена и идентификация мутации, вызывающей якутский синдром низкорослости у якутов. Название «якутский синдром низкорослости» зарегистрировано в электронной международной базе МакКьюсика (OMIM) как альтернативное названию болезни З-М-синдром. Впервые дано клинико-генеалогическое описание нового синдрома низкорослости с колбочковой дисфункцией, атрофией зрительных нервов и пельгеров-ской аномалией у якутов и изучена его распространенность в якутской популяции. Впервые проведено картирование кандидатного гена для нового синдрома, открыт ген и идентифицирована мутация, вызывающая синдром низкорослости с колбочковой дисфункцией, атрофией зрительных нервов и пельгеровской аномалией лейкоцитов. Новому синдрому дано название SCOP синдром (Short stature syndrome with Cone dysfunction, Optic atrophy and Pelger-Huet anomaly). Рассмотрены механизмы накопления этноспецифических форм наследственной патологии (ОФМД, ЯСН, SCOP синдрома) в популяциях Якутии на основании построения гаплотипов в локусах генов исследованных болезней с помощью микросателлитных маркеров. Впервые оценен возраст идентифицированных мутаций в генах CUL7 и NAG в якутской популяции.
Практическая значимость. Создан Республиканский регистр наследственной и врожденной патологии на базе медико-генетической консультации РБ№1-НЦМ. На основании клинико-генеалогических и молекулярно-генетических методов диагностики выделены две новые формы низкорослости
у якутов: якутский синдром низкорослости и синдром низкорослости с кол бочковой дисфункцией сетчатки, атрофией зрительных нервов и пельгеровской аномалией лейкоцитов. В практику медико-генетического консультирования внедрена ДНК-диагностика ОФМД, болезни Кеннеди, атаксии Фридрейха, ЯСН. На основе полученных результатов предложен и внедрен в практику алгоритм диагностики пяти наследственных заболеваний: ОФМД, болезни Кеннеди, атаксии Фридрейха, ЯСН и SCOP синдрома. Результаты работы используются в преподавании курса медицинской генетики для студентов МИ ЯГУ и врачей на курсах повышения квалификации МИ ЯГУ. Положения, выносимые на защиту:
-
В якутской популяции имеется накопление некоторых форм редкой аутосом-но-рецессивной, Х-сцепленной рецессивной и аутосомно-доминантной наследственной патологии. В ходе исследования выявлено пять этноспецифи-ческих наследственных заболеваний у якутов, которым присвоено название «якутские наследственные болезни»: спинально-бульбарная амиотрофия Кеннеди, атаксия Фридрейха, окулофарингеальная миодистрофия, якутский синдром низкорослости, синдром низкорослости с колбочковой дисфункцией, атрофией зрительных нервов и пельгеровской аномалией лейкоцитов.
-
Распространенность ОФМД (11 на 100 тыс. нас.) и болезни Кеннеди в отдельных улусах республики (408,7 и 106,6 на 100 тыс. мужчин) превышает мировые значения в десятки раз. Показатели распространенности синдрома ЯСН и SCOP синдрома получены в мире впервые (12,72 и 9,95 на 100 тыс. нас, соответственно) и позволяют отнести оба редких в мире заболевания к частым наследственным заболеваниям у якутов. АФ зарегистрирована в популяции якутов, относящихся к азиатской расе, где ранее не было описано случаев болезни.
-
Клинико-генеалогическая характеристика больных с ОФМД, болезнью Кеннеди и АФ в PC (Я) сопоставима с клиникой больных, описанных ранее. Мо-лекулярно-генетическими причинами болезней, вызванных динамическими мутациями у якутов являются экспансии (GCG)io в гене PABPN1 при ОФМД, (CAG)n в гене AR при болезни Кеннеди и (GAA)n в гене FRDA при АФ.
-
Основными причинами (40%) низкорослости в якутской популяции якутов являются 3-М синдром и новый синдром низкорослости с колбочковой дисфункцией, атрофией зрительных нервов и пельгеровской аномалией лейкоцитов. Распространенность обоих форм низкорослости в якутской популяции - 22,7 на 100 тыс. населения, среди детей - 67,5 на 100 тыс. населения. Клиника ЯСН у якутских больных сходна с клиникой ранее описанных больных с 3-М синдромом, за исключением дистресс-синдрома у новорожденных. Мутации 4582insT в гене CUL7 и G5741—>А в гене NAG являются единственными молекулярно-генетическими причинами двух форм низкорослости, особенно часто встречающихся в якутской популяции.
-
Основными популяционными механизмами накопления наследственных заболеваний в якутской популяции являются дрейф генов и эффект основателя.
-
Республиканский генетический регистр наследственной и врожденной патологии, созданный в ходе исследования, позволяет решать задачи накопления
эпидемиологической информации о нозологической структуре, диспансеризации семей с наследственными заболеваниями, пре- и постнатальной диагностики и профилактики наследственной патологии у детей, а также проводить генетический мониторинг населения.
Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на всероссийской научно-практической конференции «Современные достижения клинической генетики» (Москва, 2003); научно-практической конференции «Генетические аспекты патологии человека. Проблемы сохранения генофонда коренных народов Севера» (Якутск, 2005); на V съезде Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005); на II межрегиональной научно-практической конференции «Экология и здоровье человека на Севере» (Якутск, 2007); на VIII научной конференции «Генетика человека и патология» (Томск, 2007); на межрегиональной научно-практической конференции «Здоровье детей Севера» (Якутск, 2008); на XIII международной конференции «Геном человека» (Индия, 2008); на российской научно-практической конференции «Современные проблемы клинической генетики» (Москва, 2008); Первом молодежном инновационном конвенте (Москва, 2008); на научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской генетики на Крайнем Севере» (Якутск, 2009); межлабораторных семинарах НИИ мозга Университета г. Ниигаты (Япония, 2005, 2006, 2008); межлабораторных семинарах ЯНЦ КМП СО РАМН (Якутск, 2007, 2008, 2009); межлабораторном семинаре НИИ медицинской генетики СО РАМН (Томск, 2009).
Внедрение в практику здравоохранения. Материалы диссертации внедрены в работу медико-генетической консультации РБ№1-НЦМ Республики Саха (Якутия), а также включены в учебный процесс для студентов, в программу обучения ординаторов, интернов, врачей на кафедрах детских болезней, педиатрии, неврологии, курса медицинской генетики МИ ЯГУ. Научно обоснованные рекомендации по клинической и молекулярно-генетической диагностике и профилактике пяти якутских наследственных заболеваний внедрены в практику МГК РБ№1-НЦМ. Получен патент Российской Федерации № 2315310 «Способ диагностики 3-М синдрома в якутской популяции». По результатам исследования название заболевания «якутский синдром низкорослости» внесено в международный электронный каталог OMIM как альтернативное названию синдром 3-М.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 73 работы, из которых 13 статей в журналах, рекомендованных для опубликования работ при защите диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук, одна статья в международном журнале, 43 публикации - в виде тезисов и статей в материалах международных и российских научно-практических конференций. Получен патент РФ на изобретение.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 424 страницах машинописного текста. Данные проиллюстрированы таблицами (68), рисунками (67) и приложениями (8). Библиографический указатель включает 375 источников литературы, из них 126 работ отечественных авторов.
Генетическое картирование генов наследственных болезней в изолированных популяциях
Для генетического картирования неизвестного гена в конкретном локусе определенной хромосомы существует несколько основных методов. Вот некоторые из них: клинико-генеалогический (анализ сегрегации и сцепления признаков в семье); цитогенетический (ассоциация цитогенетических перестроек в конкретной хромосоме или хромосомном локусе с определенным клиническим фенотипом); метод гибридизации in situ (специфическая гибридизация мРНК и кДНК искомого гена с денатурирован- ными хромосомами на метафазных препаратах клетки); метод гибридных клеток (анализ совместной сегрегации клеточных признаков и хромосом в клонированных in vitro гибридных соматических клетках) (Фогель, Мотульски, 1990; Leppert, 1990; Gardner et al., 1991; Горбунова, Баранов, 1997; Пузырев, Степанов, 1997; Strachan, Read, 2004).
Все эти методы обладают рядом ограничений, связанных с недостаточной разрешающей способностью. Наиболее мощным, продуктивным и широко используемым в настоящее время методом картирования генов наследственных болезней человека является так называемый анализ сцепления искомого гена с набором точно локализованных генетических маркеров (Conneally, Rivas, 1980; Ott, 1991; Strachan, Read, 2004; Иллариошкин и др., 2002, Иллариошкин, 2004).
Основным положением анализа сцепления является то, что мерой относительного генетического расстояния между двумя локусами может служить частота рекомбинаций между этими локусами в результате кроссинговера гомологичных хромосом в мейозе (Фогель, Мотульски, 1990; Merette, Ott, 1993; Ott, 1991; Strachan, Read, 2004; Иллариошкин и др., 2002, Иллариошкин, 2004). Чем ближе расположены локусы на хромосоме, тем больше вероятность их наследования как единого целого, чем дальше расположены, тем больше вероятность, что они разойдутся по разным хромосомам. Частота рекомбинации между локусами 1% принята за единицу генетического расстояния между ними - 1 сантиморганиду (сМ), что эквивалентно в среднем 1 млн. пар нуклеотидов. Сущность этого анализа состоит в составлении сегрегации патологического признака (болезни) в родословной с сегрегацией различных генетических маркеров — особых участков ДНК с точно известной хромосомной локализацией. Если все больные имеют один и тот же аллель исследуемого маркера при сравнении со здоровыми членами семьи, это свидетельствует об отсутствии рекомбинаций между искомым мутантным геном и исследуемым маркером, т.е. о наличии сцепления между ними. Для достоверного доказательства сцепления разработан специальный математический аппарат, работающий на основании гипотезы о наличии или отсутствии сцепления при имеющихся семейных данных и выбранной частоте рекомбинаций 0; отношение этих двух вероятностей (отношение правдоподобий) показывает шансы за и против сцепления. Для удобства используется десятичный логарифм отношения правдоподобий — «logarithm of the odds» или «Lod score» (лод-балл): LOD=Logi0Po/Pi/2, где P0- вероятность полученного распределения семейных данных для сцепленных генов с частотой рекомбинаций 9, Pi/2 — вероятность такого распределения для двух несцепленных, свободно рекомбинируемых генов (частота рекомбинаций 9=1/2).
При анализе родословной производится сложение лод-баллов. Значение лод-балла +3,0 (для Х-сцепленного признака +2,0) и выше говорит о наличии генетического сцепления между маркером и изучаемым признаком и означает соотношение шансов 1000:1 (для Х-сцепленного признака- 100:1). Лод-балл, равный -2,0 и ниже, говорит о достоверном отсутствии сцепления. Значения лод-балла от +3,0 до -2,0 означают более или менее предположительное наличие сцепления и нуждаются в дальнейшем подтверждении (Ott, 1991). Расчет лод-баллов производится с помощью специальных компьютерных программ (LINKAGE, ALLEGRO, MERLIN и т.д.) (Rampersaud et al., 2005; Lathrop et al., 1984).
Для успеха анализа сцепления необходимо выполнять некоторые условия при подборе клинического и генетического материала:
1. Информативность семей по болезни. Для этого необходимо большое число доступных для анализа больных и здоровых родственников из нескольких поколений для анализа сегрегации признаков. /
2. Информативность генетических маркеров. Подбираемые маркеры должны быть полиморфны по различным аллелям и ключевые члены родо словной должны быть гетерозиготны. Взамен ранее используемых маркеров RELP в последние годы широко используются гипервариабельные микросател литные маркеры - (СА)п-повторы, обладающие высокой гетерозиготностью и однонуклеотидные полиморфизмы, весьма плотно и равномерно распределен ные по длине всего генома (Broman et al., 1998). Тенденции в развитии генети ческих маркеров человека, начиная с групп крови до используемых в настоящее время ДНК микросателлитных маркеров и однонуклеотидных последователь ностей, представлены в табл.2.
3. Исключение проблемы генетической гетерогенности изучаемого кли нического синдрома. Для этого необходим тщательный клинико генеалогический анализ исследуемой родословной с детальным клиническим осмотром больных и семей, направляемых для анализа сцепления, с целью под бора однородных клинических групп. Для дальнейшего развития стратегии ис следования генетического сцепления разработаны методы двухлокусного («Two-point linkage analyses») и мультилокусного анализа («Multipoint linkage analysis»), существенно повышающие скорость выполнения, методические воз можности и разрешающую способность в локализации неизвестных генов. Данный анализ позволяет оценивать лод-баллы для совокупности сцепленных локусов в соответствии с генетической картой изучаемого мутантного гена в пределах данного участка (Lathrop et al., 1984а, 19846).
В изолированных популяциях, где предполагается эффект основателя, в инбредных родословных с аутосомно-рецессивным заболеванием исключительно продуктивным зарекомендовал себя метод гомозиготного картирования. Он заключается в анализе «гомозиготности по происхождению» («homozygousiy- by-descent») и позволяет оценить степень гомозиготности больных лиц по серии маркеров как результат наследования от единого предка общего хромосомного участка, включающего мутантный ген (Lander et al., 1988).
Анализ генетического сцепления и методы статистического анализа результатов исследования
Болезнь Кеннеди обусловлена повреждением андрогенного рецептора (AR), расположенного в локусе Xpl 1.2-12 (La Spada, 1991). Мутация заключается в экспансии тандемных CAG-повторов в 1-м экзоне гена AR. В норме число копий CAG составляет 10-36, тогда как больные амиотрофией Кеннеди имеют увеличенное число тандемных повторов - от 38 до 72. Диапазон CAG-повторов в норме слегка отличается в каждой популяции. Например, в Финляндии — 15-29 CAG-повторов, в Швеции -17-29, в Дании - 18-27 (Lund et al., 2000), в Польше - 16-29 (Sulek et al., 2005). Эдварде с соавт. изучили полиморфизм CAG-повторов в 4 человеческих расах: у представителей белой расы в норме встре чается 15-31 CAG-повтор, у черной расы - 11-29, у американцев мексиканского происхождения - 14-30, у азиатов - 15-29 (Edwards et al., 1992). Данное заболевание относят к группе полиглутаминовых болезней, так как в пораженных мотонейронах выявляются внутриядерные белковые поли-глутаминсодержащие включения (Figlewicz, Orrell, 2003; Yamada at el., 2008; Jourdan, Lieberman, 2008). Болезнь обусловлена прогрессирующей дегенерацией двигательных ядер XII, X, IX, V пар черепных нервов и двигательных нейронов спинного мозга. На белковом уровне такой характер мутации проявляется патологическим удлинением соответствующего полиглутаминового участка белка, что незначительно влияет на функцию андрогенного рецептора. Поражение центральной нервной системы связывают с тем, что мутантный белок приобретает новые цитотоксические свойства и способствует формированию патологических внутриядерных включений (Иллариошкин и др., 2002). В отличие от других болезней тринуклеотидных повторов (миотоническая дистрофия, доминантные атаксии 1, 2 типа и т.д.), при болезни Кеннеди не наблюдалось прямой корреляции между количеством повторов и клинической тяжестью заболевания (Udd et al.,1998), но отмечалась отрицательная корреляционная связь между количеством CAG-повторов и возрастом начала болезни (Lund et al., 2001).
Более углубленное исследование эндокринных расстройств при болезни Кеннеди показало, что более 80% пациентов имеют постпубертатную гинекомастию (Dejager et al., 2002). В гормональном профиле 86% больных имели частичную андрогенную резистентность к повышенному уровню тестостерона. Доказана прямая корреляционная связь длины CAG-повторов с более ранним началом неврологического заболевания, а также с началом возраста гинекомастии.
В литературе описаны случаи гомозиготного носительства CAG-экспансии в гене AR у женщин, что сопровождалось развитием чрезвычайно «мягкого» фенотипа - крампи, тремора рук и редких периоральных фасцикуля-ций (Schmidt et al., 2002). Более легкая тяжесть клинических проявлений у женщин-гомозигот по сравнению с мужчинами-гемизиготами обусловлена вы соким уровнем стимуляции андрогенного рецептора у мужчин, что лежит в основе более выраженного дефекта транскрипционной регуляции. Соответственно, блокада андрогенного рецептора может иметь определенное терапевтическое значение. Имеются попытки лечения спинально-бульбарной амиотрофии Кеннеди на примере модельных животных (Katsuno et al., 2003; Yang et al., 2007).
Lund с соавтор. (2000) прогаплотипировали 13 финских, 10 шведских, 12 датских, 2 норвежские семьи с болезнью Кеннеди с 45 больными и 7 носительницами по 17 микросателлитным маркерам общей протяженностью региона 25,2 сМ вокруг гена AR в, поиске эффекта генетического основателя. Все скандинавские семьи имели одинаковый гаплотип по всем микросателлитным маркерам. Анализ гаплотипов семей с болезнью Кеннеди из Финляндии, Швеции, Дании выявил страновую специфичность общего гаплотипа основателя, которые со временем стали короче вследствие рекомбинаций. Мутация была внесена в Западную Финляндию 20 поколений назад. Анализ гаплотипа предполагает наличие одного общего основателя для большинства пациентов из Скандинавии.
В другом исследовании Lund со соавт. (2001) прогаплотипировали 123 семьи с болезнью Кеннеди (из Финляндии, Швеции, Норвегии, Дании, Германии, Бельгии, Италии, Японии, Австралии и Канады) на внутригенные SNP маркеры гена ARdl2, интрагенные GGC-повторы, и по 16 микросателлитным маркерам общей регион - протяженностью 25,2 сМ вокруг гена AR. Все семьи из Финляндии, Швеции, Норвегии имели одинаковый гаплотип с отсутствием внутригенного сайта StuI ARdl2, хотя пациенты из других стран имели сайт StuI, предполагающий, что датские пациенты получили это заболевание от другого предка (Lund et al., 2000). Анализ гаплотипа показал наличие двух гаплотипов основателя в Германии, двух в Италии, двух в Японии и двух в Австралии. Не было выявлено общего гаплотипа для больных из Канады. Эти результаты доказывают, что мутация экспансии CAG-повторов не является уникальным событием. Успехи в расшифровке мутации гена болезни Кеннеди открывают перспективы для пренатальной, и преиплантационной диагностики. В одном из случаев преимплантационная диагностика позволила выявить на бластомерах 11 эмбрионов 2 здоровых, 8 носительниц женского пола и 1 пораженный эмбрион мужского пола (Georgiou et al., 2001). Были подсажены 2 эмбриона: 1 здоровый и 1 носительница.
Дифференциальную диагностику проводят с боковым амиотрофическим склерозом, хронической формой вилюйского энцефаломиелита, болезнью Ку-гельбера-Веландера III типа. До клинических проявлений в молодом возрасте также дифференцируют с синдромом Клайнфельтера, обусловленным кариоти-пом XXY.
В отечественной литературе исследований, посвященных болезни Кеннеди, немного (Бадалян и др., 1987; Петрухин, 1996; Клюшников и др., 2008). Первое клиническое описание в отечественной литературе было сделано Бадаляном в 1987 году (Бадалян и др., 1987). После открытия гена болезни Кеннеди появились исследования с молекулярно-генетическим подтверждением заболевания (Петрухин, 1996; Клюшников и др., 2008). В Якутии до настоящего времени данное заболевание не изучалось.
Клинико-генеалогическая характеристика больных с окулофарингеальной миодистрофией
К патогномоничным признакам синдрома 3-М можно отнести признаки, встречающиеся с частотой более 70%: треугольное лицо, мясистый нос, выступающий подбородок, полные губы, длинный фильтр, гипоплазия средней трети лица, короткая шея, тонкие трубчатые кости на рентгенограмме (табл. 14).
В большинстве случаев преждевременное закрытие стреловидных швов между париетальными костями черепа может ограничить боковой рост головы, приводя к неправильной форме черепа - длинной и узкой (долихоцефалия). Характерные лицевые особенности включают в себя относительно большую голову, выраженные лобные бугры, треугольное лицо, острый выступающий подбородок, мясистый вздернутый нос, полные губы, толстые брови, длинный фильтр и гипоплазию средней трети лица, гипоплазию верхней челюсти. Кроме того, в некоторых случаях, могут быть аномалии зубов и прикуса (Temtamy et al., 2006). У трех описанных больных найдены ранее не описанные симптомы: выступающая резцовая межчелюстная кость, выступающая верхняя челюсть, тонкие открытые губы, высокое арковидное небо, срединнорасщепленный язык, запоздалое высыпание зубов с гипокальцификацией эмали и аномалией прикуса.
Типичные лицевые особенности при синдроме 3-М в виде треугольного лица, выступающего подбородка и мясистого носа были описаны в литературе у многих пациентов (Miller et al., 1975; Spranger et al., 1976; Garcia-Cruz, Cantu, 1979; Cantu et al., 1981; Winter et al., 1984; Hennekam et al., 1987; van Goethem, Malvaux, 1987; Feldmann et al., 1989; Mueller et al., 1992; van der Wal et al., 2001), хотя в некоторых случаях отмечались существенные отличия в лицевых диз-морфологических чертах от ранее описанных случаев (van der Wal et al., 2001; Marik et al., 2002). Так, у двух пациентов отмечался очень высокий лоб, оттопыренные уши и гипертелоризм, что отличает их от остальных описанных пациентов с 3-М синдромом (van der Wal et al., 2001). A Marik с соавт. (2002) описали нетипичные низко посаженные большые уши, эпикант, широкий рот с опущенными уголками, узкие губы, высокое небо и маленькие ногти, аномалию дермалоглифики. Очевидно, что типичное лицо не является главным критерием в определении синдрома 3-М.
К нелицевым признакам относятся короткая шея, выступающая трапециевидная мышца, квадратные плечи, короткая грудная клетка, деформации грудной клетки, гиперлордоз, гиперподвижность суставов, укорочение 5 пальцев (van der Wal et al., 2001) и выступающие пятки. Интеллект сохранен. Также имеются два сообщения о взаимосвязи гипермобильности суставов с внутричерепными сосудистыми аневризмами при синдроме 3-М, что может говорить о генерализации процесса соединительной ткани (Mueller et al., 1992; Hennekam etal., 1987).
Эндокринологический скрининг, проведенный у 7 из 28 ранее описанных пациентов, не показал никаких аномалий (Miller et al., 1975; Spranger et al., 1976; Garcia-Cruz, Cantu, 1979; Cantu et al., 1981; Winter et al., 1984; Hennekam et al., 1987; van Goethem, Malvaux, 1987; Feldmann et al., 1989; Mueller et al., 1992). Однако гипоспадия с уменьшенным размером яичек в сочетании с высоким уровнем фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) и азооспермия, описанные ван дер Вал с coaBT.(van der Wal et al., 2001) у пятого пациента, явились причиной исследования половой функции у всех пяти взрослых пациентов. У всех обследованных пациентов отмечалось нормальное половое развитие. Три пациента мужского пола имели уменьшение размеров яичек и повышение уровня ФСГ. Анализ спермы в четвертом случае показал олигоспермию, а в пятом азооспермию. Функция клеток Лейдига была нормальной, однако сочетание ги-поспадии с повышенным уровнем лютеинизирующего гормона (ЛГ) косвенным образом указывает на снижение продукции тестостерона. Две женщины с 3-М синдромом имели нормальное половое созревание, вовремя начавшуюся менструацию, регулярный менструальный цикл и нормальные уровни ЛГ и ФСГ. Следовательно, женщины с 3-М синдромом не имеют нарушений гонадальной функции, тогда как мужчины имеют дисфункцию гонад, частичное или полное бесплодие, которое обусловлено повышенным уровнем ЛГ, ФСГ, уменьшением размеров яичек и нарушением продукции спермы. Ранее не сообщалось об из менении функции гонад у мужских пациентов с 3-М синдромом, однако среди ранее описанных в литературе случаев 3-М синдромом в трех случаях встречалась гипоспадия, что косвенным образом подтверждает эту гипотезу (Feldmann et al, 1989; Winter et al, 1984).
Рентгенологические особенности - утончение трубчатых костей, проявления остеопороза, тонкие ребра, переднезаднее укорочение позвонков, spina bifida occulta, маленький таз, уменьшение крыльев подвздошных костей и отставание костного возраста (Hennekam et al., 1987; van Goetherm, Malvaux, 1987) (табл.14). Кроме того в 4 из 6 описанных случаев отмечалось ранее не описанное утолщение кортикального слоя длинных трубчатых костей (van der Wal et al., 2001). Диагноз синдрома 3-М может быть выставлен по наличию неспецифических рентгенологических признаков, которые могут не обнаруживаться в первые 2 года жизни.
Тонкие длинные кости с суженными диафизами и расширенными мета-физами являются основным рентгенологическим критерием 3-М синдрома. Повышенная прозрачность не характерна (van der Wal et al, 2001). Утончение длинных трубчатых костей в литературе данным встретилось в 29 случаях из 34 (Miller et al., 1975; Spranger et al., 1976; Garcia-Cruz, Cantu, 1979; Cantu et al., 1981; Winter et al., 1984; Hennekam et al., 1987; van Goethem, Malvaux, 1987; Feldmann et al., 1989; Mueller et al., 1992; van der Wal et al., 2001) и, следовательно является одним из кардинальных рентгенологических признаков синдрома 3-М. Для выявления этого признака использовался метакарпальный индекс, который во всех случаях, кроме одного, повышался более чем на 2 стандартных отклонения.
Алгоритм диагностики атаксии Фридрейха в Республике Саха (Якутия)
В неврологическом статусе: двусторонний птоз, больше справа. Почти полностью прикрывает зрачки. Ограничено движение глазных яблок кнаружу. Вверх движение отсутствует. Слабо надувает щеки. Лобные складки не выражены. Плохо оскаливает зубы. Голос гнусавый. Мягкое небо напрягается слабо. Язык отклонен влево. При глотании поперхивается, дисфагия. Объем движений в руках полный. Гипотрофия мышц плеч предплечий. Сила в дельтовидных мышцах до 3,5-4 баллов. Кистевая динамометрия S=D=7Kr. Слабость мышц шеи, с трудом голову отрывает от подушки. С рук рефлексы низкие. Гипотрофия подлопаточных мышц, четкой мышечной гипотрофии других мышц из-за подкожно-жировой клетчатки не выявлено. Коленные и ахилловы рефлексы средней живости S=D. Ноги с постели отрывает на 60 и 80 градусов. Сила снижена в ягодичных мышцах, в сгибателях и разгибателях бедер, в приводящих и отводящих мышцах бедер. Сила в стопах дистоничная. Походка переваливающаяся. Сделать приседание не может. Со стула поднимается с помощью рук.
В лабораторных анализах: в общем анализе крови, мочи, биохимических анализах крови без особенностей. ЭКГ без патологии. ЭНМГ тестирование нервно-мышечной передачи с круговой мышцы глаза выявило миастенический блок умеренной степени (-6% -9%), с рук блока нет (+2% -1%). Осмотр окулиста: Visus OD 0,2; Visus OS 0,2. Внутриглазное давление - 21/20 мм рт. ст. Периметрия в пределах нормы. Сложный миопический астигматизм обоих глаз. Амблиопия. Двусторонний птоз век (окулофарингеальная миодистрофия). Двусторонняя начальная катаракта.
Диагноз окулофарингеальной миодистрофии был выставлен на основании наличия клинико-диагностических признаков: дисфагии, двухстороннего птоза и медленно прогрессирующей мышечной слабости и ЭНМГ-изменений: миастенический блок в круговых мышцах глаз. На АД тип наследования указывало поражение 2 сибсов, матери и деда. Выставить окончательный диагноз окулофарингеальной миодистрофии позволил молекулярно-генетический анализ на мутацию в гене PABPN1. Выявлена мутация в гене PABPN1 — удлинение одного из аллелей до 10 GCG-повторов. Анализ проведен также двум сибсам. У сибсов также выявлено удлинение GCG-повторов до 10.
Высокое накопление ОФМД в якутской популяции, выявленная единственная мутация (GCG)io в гене PABPN1, гомогенность якутской популяции и показанный эффект основателя при других исследованных заболеваниях (СЦА 1-го типа, НЭМ I типа, МД) дают нам основание предположить, что основным популяционным механизмом накопления ОФМД в якутской популяции является эффект основателя. Динуклеотидные маркеры с большим успехом используются при анализе гаплотипа (Scacheri et al., 1999; Blumen et al., 2000). В 29 семьях (28 якутских и в одной русской) проведен анализ гаплотипов с использованием 9 STR-локусов, расположенных в локусе гена PABPN1 приблизительно на одинаковом расстоянии друг от друга (табл. 31).
Динуклеотидные маркеры были выбраны с помощью базы данных NCBI и UCSC. Некоторые из них ранее были использованы в других исследованиях (Blumen et al., 2000; Scacheri et al., 1999). Примеры анализа показаны на рис. 11.
Для выявления аллелей, ассоциированных с окулофарингеальной миоди-строфией, проведен семейный анализ полиморфных маркеров и определен гап-лотип, характерный для хромосом, несущих мутацию (GCG)io. Результаты исследования представлены в виде родословных на рис. 1-8 в прил. 5.
Рассчитаны частоты аллелей в выборке больных (84 хромосомы) и в здоровой выборке родственников без мутации (10 хромосом) (табл. 32). Наиболее частыми оказались аллель 2 для D14S1003, аллель 3 для D14S50, аллель 3 для D14S28, аллель 1 для D14S990, аллель 2 для D14S58J, аллель 2 или 3 для -D14S972, аллель 5 для D14S64, аллель 3 или 5 для D14S264, аллель 2 для D14S1041.
Все выявленные гаплотипы хромосом с мутацией приведены в табл.33, выделенная область представляет собой сохраненную часть гаплотипа основателя. Как следует из табл.33 и рис. 1-8 из прил.5, наиболее вероятным нам представляется следующий гаплотип основателя: D14S1003 - D14S50 - D14S283 - D14S990 - D14S581 - D14S972 - D14S64 - D14S264 - D14S1041: 2-3-3-1-2-2-5-3-2. Интересным является тот факт, что выявленный в русской семье (семья 9) гаплотип одинаков с гаплотипом, выявленным для всех 27 якутских семей.
Некоторые из исследованных нами микросателлитных маркеров были ранее использованы для изучения гаплотипов у потомков французов в Северной Америке (D14S283, D14S990, D14S1041) с мутацией (GCG)9H у евреев Бухары (D14S50, D14S283, D14S990, D14S\MV) с мутацией (GCG)9(Blumen et al., 2000). Но в якутских семьях были обнаружены мутация, заключающаяся в экспансии 10 GCG-повторов в отличие от изученных популяций, и гаплотип в 27 якутских семьях и одной русской семье, отличающийся от гаплотипов, обнаруженных в популяции французов и евреев Бухары, что говорит о различном происхождении найденной мутации.
