Введение к работе
Актуальность темы диссертационного исследования
Малярия является одной из наиболее серьезных и трудноразрешимых проблем в странах с тропическим и субтропическим климатом [Ярилин А.А. 2010 г.]. Число больных, зарегистрированных в 101 стране мира, составляет 216 млн. (ВОЗ,2011), из них 81% - в странах Африки; умирает за год до 900 тыс. больных малярией, 91% из них также в странах Африки; 86% умерших от малярии в мире составляют дети до 5 лет. Наибольший процент летальных исходов - до 98%, приходится на тропическую малярию, вызываемую Plasmodium falciparum.
В период проведения настоящего диссертационного исследования, по данным Федерального бюджетного учреждения здравоохранения «Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве», было зарегистрировано 115 обращений с диагнозом малярия: в 2010 г. - 48, в 2011 г. - 32, в 2012 году -35 обращений. Из этих данных следует, что, несмотря на тот факт, что количество обращений с диагнозом малярия в год не постоянно, оно, так или иначе, не опускается ниже определенного минимального уровня. В данных условиях проблемы ранней постановки точного диагноза и адекватного лечения выходят на первый план. Известно, что поздняя диагностика тропической малярии приводит тяжёлым клиническим последствиям - к развитию наиболее опасной церебральной формы, инфекционно-токсическому шоку и других смертельных осложнений. Поздняя диагностика трёхдневной малярии ведёт к серьёзным эпидемиологическим последствиям - созданию условий для возникновения в городе случаев малярии вторичных от завозных.
В настоящее время существуют различные методы, направленные на выявление наличия малярийных паразитов в крови больного. Прежде всего, это микроскопическое исследование мазка крови больного, которое на сегодняшний день является «золотым стандартом» диагностики малярии [Stephanie Р. Johnstonata 1.]. Подобное исследование позволяет обнаружить паразитов в те-
чение полутора-двух часов после забора крови, однако этот метод не лишен некоторых недостатков: относительно низкая эффективность при незначительном количестве паразитов в мазке крови или, если они присутствуют на пороге чувствительности метода, а также трудность дифференциальной диагностики вида паразита на стадии юного трофозоита.
Наряду с микроскопическим исследованием препаратов крови в настоящее время используются так называемые экспресс - тесты [Рабинович С.А. и др. 2006 г.]. Это удобный и быстрый способ постановки диагноза, особенно в случаях отсутствия квалифицированной медицинской помощи. Однако и этот вид диагностического исследования имеет определенные ограничения в эффективности, так как экспресс-тесты пока разработаны не для всех видов паразитов и значительно уступают в чувствительности стандартным паразито-логическим исследованиям препаратов крови.
В последние десятилетия в практику диагностики инфекционных болезней, в том числе и малярии, вошли высокоэффективные и чувствительные молекулярно-генетические методы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Источниками ДНК плазмодиев малярии для ПЦР могут служить: кровь, собранная на бумажный фильтр, препарат «толстая капля».
Представляют научный и практический интерес методы, позволяющие определить наличие генетических отклонений у лиц, подвергшихся инфекции несколькими патогенами (в частности, микст-инфекции P.falciparum и Эп-штейн-Барр - вирусом) не только на молекулярно-биологическом уровне (метод ПЦР), а также на цитогенетическом уровне. В этом плане важное место отводят методам метафазного кариотипирования и флуоресцентной гибридизации in situ - FISH (Fluorescence in situ hybridization).
Для качественного улучшения диагностики малярии в современных условиях, наряду с использованием стандартных методов постановки диагноза, актуальным становится разработка и внедрение в практику точных молекулярно-
генетических и цитогенетических методов, что поможет значительно эффективнее решать существующие научные и практические проблемы, связанные с малярийной инфекцией.
Цель исследования
Оптимизация проведения молекулярно-генетических методов диагностики малярии и анализ возможности генетических перестановок при микст-инфекции завозной малярии и вируса Эпштейн-Барр с помощью современных цитогенетических методов.
Задачи исследования
1) Изучение эффективности и совершенствование существующего метода
проведения Nested PCR с препаратом «толстая капля» в качестве источника
ДНК малярийного плазмодия.
-
Разработка и изучение возможности применения в практике диагностики малярии метода Nested PCR с эритроцитарным сгустком в качестве источника ДНК паразита.
-
Сравнительный анализ эффективности и трудозатратности при проведении Nested PCR с разными источниками ДНК малярийного плазмодия.
-
Выявление Эпштейн-Барр вирусной инфекции у больных малярией при помощи метода ПНР.
-
Анализ кариотипа больного малярией на предмет наличия у него специфичных для лимфомы Беркитта генетических изменений (транслокаций).
База исследования.
Информационной и методической базой для проведения исследования являлись:
1) Городская клиническая инфекционная больница №2 г. Москвы.
-
Федеральное бюджетное учреждение здравоохранения «Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве».
-
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П.Чумакова» Российской академии медицинских наук.
Научная новизна диссертационного исследования.
-
Показана высокая эффективность и специфичность метода ПЦР для диагностики малярии.
-
Впервые применён метод выделения ДНК паразита из эритроцитарного сгустка для постановки Nested ПЦР с целью диагностики малярии. Показана высокая эффективность и сравнительно незначительная трудозатратность при использования данного биосубстрата.
3) Впервые проведено исследование кариотипа Эпштейн-Барр вирус -
позитивных больных завозной малярией на территории Москвы на наличие
транслокаций, выявляемых при диагностике лимфомы Беркитта. Транслока
ций, характерных для эндемичной лимфомы Беркитта, у больных завозной
малярией и в группе контроля не обнаружено.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Метод Nested PCR с эритроцитарным сгустком в качестве источника ДНК паразита, предложенный в данной работе, может быть внедрен в практическую диагностику малярии с целью улучшения точности и достоверности постановки диагноза.
Полученная в результате проведенной работы информация может быть полезна для полноты понимания процессов происходящих в организме больно-
го при сочетании двух патогенов - Эпштейн-Барр вируса герпеса человека и малярийных плазмодиев.
Результаты диссертационной работы нашли применение в учебном процессе на кафедре биологии и общей генетики ГОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава РФ» и кафедре инфекционных болезней с курсом эпидемиологии ФГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов». Предложенная модификация метода Nested PCR использовалась для уточнения видовой принадлежности в диагностике отдельных случаев завозной малярии в ИКБ 2.
Апробация диссертации.
Апробация диссертации проведена на научной конференции кафедры биологии и общей генетики ГОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава РФ» (июль 2013 г.).
Материалы диссертации были доложены на Первой молодежной научно-практической школы-конференции по естественным, техническим, медицинским наукам и биотехнологиям в Российском университете дружбы народов (июнь 2013 г.)
Публикации по теме диссертации.
По теме диссертации опубликовано 3 статьи, из них 2 в журналах, поименованных в перечне ВАК России.
Диссертация написана на 111 листах и состоит из титульного листа; оглавления; введения, отражающего цели и задачи исследования; обзора литературы по проблематике диссертации; обзора используемых материалов и методов; изложения оригинальных собственных материалов; выводов; обсуждения результатов; библиографического списка, составленного в соответствии с «ГОСТ Р 7.0.5 - 2008 - Библиографическая ссылка» и состоящего из 157 источников (в числе которых 44 российских и 133 иностранных); иллюстративного материала состоящего из 26 рисунков и 5 таблиц и списка сокращений.
![Оптимизация лабораторной диагностики гонореи и антибиотикочувствительность Neisseria gonorrhoeae по материалам г. Екатеринбурга и Свердловской обл. [Электронный ресурс]](/i/i/4436/199888.png "Оптимизация лабораторной диагностики гонореи и антибиотикочувствительность Neisseria gonorrhoeae по материалам г. Екатеринбурга и Свердловской обл. [Электронный ресурс] Кобенко Эльвира Георгиевна")