Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 7
1.1. Актуальность исследования 7
1.2. Цель и задачи исследования 10
1.3. Научная новизна и практическая значимость работы
1.3.1. Научная новизна работы 10
1.3.2. Практическая значимость работы 12
1.4. Положения, выносимые на защиту 13
2. Обзор литературы 16
2.1. Муковисцидозный трансмембранный регулятор проводимости 17
2.1.1. Ген CFTR, его продукти функция 17
2.1.2. CFTR мутации
2.1.2.1. Классификации CFTR мутаций в зависимости от первичного повреждающего эффекта 20
2.1.2.2. Разработка новых методов терапии в зависимости от типа CFTR мутаций
2.1.3. Частота муковисцидоза и распределение CFTR мутаций в различных регионах мира 27
2.1.4. Источники происхождения и распространения некоторых CFTR мутаций в европейских популяциях 35
2.1.5. Преимущество гетерозиготных носителей CFTR мутаций - вероятная причина высокой частоты муковисцидоза в Европе? 39
2.2. Причины клинического разнообразия муковисцидоза 42
2.2.1. Корреляции CFTR генотипа и фенотипа при MB 43
2.2.2. Комплексные аллели 47
2.2.3. Регуляция сплайсинга. Механизмы регуляции уровня CFTR 48
2.2.4. Возможные гены модификаторы течения муковисцидоза
2.2.4.1. Ген эндотелиальной синтазы оксида азота 53
2.2.4.2. Гены фактора некроза опухоли а и лимфотоксина а 55
2.2.4.3. Ген глутатион-8-трансферазы Ml 58
2.2.3.1. Ген маннозо-связывающего лектина 60
2.2.3.2. Ген гемохроматоза 64
2.3. Диагностика и классификация MB 66
2.4. Популяционный скрининг на муковисцидоз 69
3. Материалы и методы исследования 77
3.1. Реактивы, ферменты, биопрепараты 77
3.2. Материалы исследования
3.2.1. Характеристика выборки больных 77
3.2.2. Популяционные выборки 78
3.2.3. Характеристика контрольной группы 79
3.2.4. Характеристика материала исследования 80
3.3. Методы исследования 80
3.3.1. Молекулярно-генетические методы 80
3.3.1.1. Выделение геномной ДНК 80
3.3.1.2. Идентификация мутаций в гене CFTR 81
3.3.1.3. Анализ внутригенных и внегенных полиморфизмов гена CFTR 88
3.3.1.4. Анализ полиморфизмов в генах eNOS, TNFA, LTA, MBL2, GSTM1 и HFE1
3.3.2. Общеклинические методы 92
3.3.3. Статистическая обработка результатов исследований 93
4. Результаты и обсуждение 95
4.1. Расчет частоты муковисцидоза, изучение спектра и частот CFTR
мутаций у больных муковисцидозом и в популяциях Российской Федерации 95
4.1.1. Анализ относительных частот CFTR мутаций у больных MB 95
4.1.2. Поиск мутаций в 5 дистальной и промоторной области гена CFTR 104
4.1.3. Распределение CFTR мутаций у российских больных MB в разных регионов и этнических групп 107
4.1.4. Протокол проведения прямой ДНК-диагностики у российских больных MB Ill
4.1.4. Анализ частоты некоторых мутаций в гене CFTR в ряде популяций России 118
4.1.5. Расчет частоты муковисцидоза в популяциях русских европейской части России 124
4.2. Молекулярно-генетическая диагностика в российских семьях с муковисцидозом 128
4.2.1. Ассоциация гаплотипов внегенных ДНК-маркеров с мутантными и нормальными хромосомами 128
4.2.2. Анализ частот аллелей и гаплотипов внутригенных полиморфизмов в выборках нормальных и мутантных хромосом
4.2.2.1. Анализ частот аллелей внутригенных полиморфизмов на нормальных и мутантных хромосомах 131
4.2.2.2. Анализ частот гаплотипов внутригенных полиморфизмов на нормальных и мутантных хромосомах 137
4.2.3. Эффективность комплексной ДНК-диагностики MB 146
4.3. Взаимосвязь CFTR генотипа и фенотипа у российских больных MB 153
4.3.1. Особенности клинической картины у пациентов с «тяжелыми» и «мягкими» генотипами 153
4.3.2. Вариабельность клинической картины внутри групп больных MB с «тяжелыми» и «мягкими» генотипами 167
4.4. Анализ ряда генов как возможных модификаторов клинических проявлений муковисцидоза 170
4.4.1. Анализ частот аллелей и генотипов полиморфизмов генов eNOS, TNFA, LTA, MBL2, GSTM1 и HFE1 у больных MB и здоровых индивидов 172
4.4.2. Анализ ассоциаций полиморфизмов генов eNOS, TNFA, LTA, MBL2, GSTM1 и HFE1 с поражением дыхательной системы у больных MB 183
4.4.3. Анализ ассоциаций полиморфизмов генов eNOS, TNFA, LTA, MBL2, GSTM1 и HFE1 с поражением пищеварительной системы у больных MB 191
4.4.4. Оценка функции выживаемости у больных MB с разными генотипами по генам eNOS, TNFA, LTA, MBL2, GSTM1 uHFEl 196
4.5. Медико-генетическое консультирование у российских семей с MB 199
4.5.1. Расчет риска у новорожденных, выявленных при неонатальном скрининге на муковисцидоз 201
4.5.2. Расчет риска муковисцидоза у плода с эхогенным кишечником
5. Заключение 223
6. Выводы 228
7. Список литературы
- Научная новизна и практическая значимость работы
- Классификации CFTR мутаций в зависимости от первичного повреждающего эффекта
- Популяционные выборки
- Анализ частот гаплотипов внутригенных полиморфизмов на нормальных и мутантных хромосомах
Введение к работе
Актуальность исследования.
Муковисцидоз (МВ, CF; OMIM #219700) наиболее частое наследственное аутосомно-рецессивное заболевание среди европеоидов. Муковисцидоз обусловлен мутациями в гене CFTR, муковисцидозного трансмембранного регулятора проводимости. Белок CFTR, функционируя как цАМФ-зависимый хлорный канал, регулирует работу других хлорных и натриевых каналов и выполняет ряд иных важных функций (Riordan J.M. et al., 1989). При муковисцидозе в патологический процесс вовлекаются экзокринные железы разных систем организма: органов дыхания, системы пищеварения (поджелудочная железа, печень, желчные пути, пищеварительный тракт), а также потовые железы и урогенитальный тракт (Капранов Н.И. и др., 2004; Witt H., 2003).
В настоящий момент описаны более 1500 мутаций и 250 полиморфизмов в гене CFTR (CFTR mutation database, ), частоты которых широко варьируют в разных этнических группах. Спектры различных мутаций и полиморфизмов гена CFTR обладают выраженной популяционной специфичностью, являясь отражением генетических процессов, формирующих популяции. Частота МВ варьирует в разных популяциях мира в весьма широких пределах (например, в Европе от 1:1800 новорожденных в Ирландии до 1:26000 новорожденных в Финляндии) (WHO, 2004). Оценки частоты MB в разных популяциях Российской Федерации (РФ) также весьма различны (от 1:4900 до 1:12000 живорождённых) (Петрова Н.В., Гинтер Е.К., 1997; Капранов Н.И., 2001; Капранов Н.И., 2006; Радионович А.М. и др., 2005; Воронин С.В. и др., 2007; Матулевич С.А., 2007; Михальчук В.В. и др., 2007; Одинокова О.Н. и др., 2007). Значительное различие спектров CFTR мутаций и частоты заболевания вносит объективные сложности в разработку протоколов проведения ДНК-диагностики МВ и проведения генетического консультирования среди населения, относящегося к разным этническим группам и проживающего в разных регионах.
Клиническая картина при МВ весьма разнообразна: продолжительность жизни, спектр и тяжесть клинических проявлений значительно варьируют среди больных МВ. И хотя вариабельность клинического течения МВ несомненно обусловлена многочисленностью CFTR мутаций, а следовательно, и CFTR генотипов, но различие в течении МВ, наблюдающееся у больных, имеющих одинаковые мутации в гене CFTR, в частности, у сибсов, позволяет предполагать влияние на клиническую картину МВ других генетических факторов, отличных от гена CFTR (Ferrari M., Cremonesi L., 1996; Parad R.B. et al., 1999; McKone E.F. et al., 2006; Mekus F. et al., 2000; Vanscoy L.L. et al., 2007). В настоящее время во всем мире ведется активный поиск генов, оказывающих влияние на клинические проявления МВ. Изучается ряд генов, белковые продукты которых могут быть вовлечены в патогенетические механизмы МВ. Особое внимание уделяется генам, продукты которых вовлечены в иммунную защиту организма (Drumm M.L. et al., 2005; Salvatore F. et al., 2002; Witt H., 2003; Yarden J. et al., 2005; Garred P.et al., 2003; Thio C.L. et al., 2005; Wiertsema S.P. et al., 2006; Иващенко Т.Э., Баранов В.С., 2000; Келембет Н.А. и др., 2005; Корытина Г.Ф.и др., 2004)..
Несмотря на то, что муковисцидоз интенсивно изучается на протяжении нескольких десятков лет специалистами разных направлений, в том числе и в России, интерес к проблемам этого заболевания не ослабевает. Вопросы распространенности МВ в разных популяциях и этнических группах, выявления гено-фенотипических корреляций, определения факторов, лежащих в основе вариабельности клинических проявлений, особенностей консультирования в связи с введением пресимптоматической диагностики в России не решены до конца.
Цель исследования:
Получение оценки частоты муковисцидоза, изучение молекулярно-генетического разнообразия гена CFTR в российских популяциях, выявление гено-фенотипических корреляций у российских больных и разработка на основе полученных результатов принципов медико-генетического консультирования.
Задачи исследования:
-
Оценить частоту МВ в популяциях европейской части России;
-
Изучить спектр и относительные частоты диагностически значимых мутаций в гене CFTR в обширной выборке российских больных МВ;
-
Оценить распространенность некоторых мутаций гена CFTR в разных этнических группах коренного населения России;
-
Изучить генетическую изменчивость локуса гена CFTR по внутригенным и внегенным полиморфизмам в семьях с МВ; оценить возможность использования этих полиморфизмов для косвенной ДНК-диагностики в семьях с частичной информативностью;
-
Изучить клинические особенности МВ у больных в зависимости от CFTR генотипа;
-
Изучить возможное модифицирующее влияние ряда генов на клинические проявления муковисцидоза у больных, гомозиготных по мутации F508del;
-
Разработать принципы медико-генетического консультирования для российских семей, отягощенных МВ. Провести расчеты генетического риска МВ при наличии двух независимых факторов риска (положительный тест на ИРТ и ДНК-тестирование; гиперэхогенный кишечник и ДНК-тестирование).
Научная новизна:
-
-
Впервые на основе определенных прямыми методами популяционной и относительной частот мутации F508del дана оценка частоты муковисцидоза в популяциях русских европейской части России.
-
Впервые определен спектр частых мутаций в гене CFTR, составляющих до 75,7% мутантных аллелей у российских больных МВ, на основе которого разработаны наборы для ДНК-диагностики.
-
Впервые изучена распространенность семи CFTR мутаций в популяциях европейской части России в пяти этнических группах (русские Ростовской, Тверской, Псковской, Кировской областей, марийцы, чуваши, удмурты, башкиры). Выявлены различия в частоте встречаемости мутации F508del среди изученных этносов.
-
Впервые изучена молекулярно-генетическая изменчивость промоторной и 5’ регуляторной областей гена CFTR у российских больных МВ, у которых при предварительном тестировании не идентифицированы одна или обе мутации.
-
Выявлены мутации 3944delTG, 3667delTCAA и L138insA, ранее не обнаруженные у российских больных МВ. Впервые идентифицированы мутации 604insA и K598ins. Мутации L138ins и 604insA можно отнести к относительно частым у российских пациентов с МВ.
-
Впервые в семьях российских больных МВ проанализированы частоты аллелей внутригенного полиморфизма IVS1CA и частоты гаплотипов четырех внутригенных полиморфизмов IVS1CA-IVS6aGATT-IVS8CA-IVS17bCA. Показаны различия в частотах и наборах гаплотипов изученных полиморфизмов, ассоциированных с нормальными и мутантными аллелями гена CFTR.
-
Выявлены три группы мутаций, ассоциированные с определенными гаплотипами четырех внутригенных полиморфизмов IVS1CA-IVS6aGATT-IVS8CA-IVS17bCA: мутации F508del, N1303K, G542X, 2143del и 394delTT – с гаплотипом 21-6-23-13; мутации CFTRdele2,3(21kb), 1677delTA, L138ins – с гаплотипом 22-7-16-13; мутации W1282X, R334W – с гаплотипом 26-7-17-17.
-
Впервые у российских больных МВ изучена взаимосвязь клинической картины и CFTR генотипа (с учетом классификации мутаций в зависимости от степени дефекта хлорного канала).
-
Впервые на выборке российских больных МВ, гомозиготных по мутации F508del, изучено модифицирующее влияние шести генов на клинические проявления заболевания и показано, что гены eNOS, MBL2 и HFE можно рассматривать в качестве модификаторов клинической картины заболевания.
-
Впервые для российских семей проведены расчеты генетического риска при наличии двух независимых факторов риска МВ: положительного результата первого теста на ИРТ у новорожденного или обнаружения гиперэхогенности кишечника у плода при ультразвуковом исследовании и положительного или отрицательного результата ДНК-диагностики.
-
Впервые для российских семей показан высокий риск МВ (приближающийся к 0,25) у плода, имеющего гиперэхогенный кишечник во 2-м триместре, при выявлении носительства CFTR мутации одним из родителей.
Научно-практическая значимость работы:
-
Определение спектра и долей частых CFTR мутаций и изучение генетической изменчивости локуса гена CFTR по внутригенным и внегенным полиморфизмам позволило разработать алгоритм молекулярно-генетической диагностики МВ, в том числе пренатальной, в российских семьях, отягощенных муковисцидозом.
-
Обнаружение новых для российских больных МВ CFTR мутаций расширило спектр мутаций, которые можно рекомендовать для рутинного анализа в диагностических лабораториях.
-
Введение полиморфизма IVS1CA в протокол анализа повышает эффективность косвенной диагностики в семьях с неполной информативностью. Использование методов прямой (анализ частых CFTR мутаций) и косвенной (анализ четырех внутригенных и пяти внегенных полиморфизмов) ДНК-диагностики позволяет обеспечить проведение пренатальной диагностики для 99,5% семей, отягощенных муковисцидозом.
-
Изучение взаимосвязи между фенотипом и CFTR генотипом позволяет выявить ассоциации между CFTR мутациями и тяжестью поражения как органов пищеварительной, так и бронхолегочной системы и дать более точный прогноз течения заболевания у больных МВ.
-
Изучение полиморфизмов некоторых генов позволяет выявить возможные механизмы, лежащие в основе клинического разнообразия у пациентов с одинаковым CFTR генотипом.
-
Расчеты риска МВ в случаях положительного результата первого теста на ИРТ у новорожденного или обнаружения гиперэхогенности кишечника у плода при ультразвуковом исследовании с учетом результата ДНК-диагностики могут дать более точный прогноз для потомства при медико-генетическом консультировании.
-
Результаты по выявлению частых, диагностически значимых для российских больных МВ мутаций в гене CFTR и контрольные образцы ДНК с известными мутациями использованы при разработке наборов для ДНК-диагностики МВ (в лаборатории ДНК-диагностики ГУ МГНЦ РАМН).
Положения, выносимые на защиту:
-
Изучение спектра и относительных частот мутаций в гене CFTR в обширной выборке российских больных МВ (776 индивидов) из разных регионов РФ выявило, что к диагностически значимым можно отнести мутации F508del (54,2%), CFTRdele2,3(21kb) (7,2%), 2143delT (2,1%), W1282X (2,0%), N1303K (1,9%), 3849+10kbC>T (1,9%), 2184insA (1,7%), G542X (1,3%), 1677delTA (0,8%), 3821delT (0,8%), R334W (0,7%), L138ins (0,6%) и 394delTT (0,5%). Доля не охарактеризованных мутантных аллелей составила 23%.
-
В результате изучения частоты семи CFTR мутаций (CFTRdele2,3(21kb), F508del, 1677delTA, 2143delT, 2184insA, 394delTT и 3821delT) в выборках здоровых индивидов, относящихся к 5 этническим группам РФ: русских из европейской части России, марийцев, удмуртов, чувашей и башкир, показано, что частота мутации F508del среди русских европейской части России значимо выше (0,00518), чем у изученного коренного населения Волго-Уральского региона (<0,002).
-
Частота муковисцидоза, рассчитанная из популяционной и относительной частот мутации F508del для популяций русских европейской части России, составляет 1:10935.
-
Анализ четырех внутригенных маркеров гена CFTR (IVS1CA, IVS6aGATT, IVS8CA и IVS17BCA) выявляет неравновесие по сцеплению аллелей и гаплотипов в выборках мутантных и нормальных хромосом. Мутация F508del сцеплена с гаплотипами 21-6-17-13 и 21-6-23-17 в 91,8% случаев. Мутации G542X, N1303K, 394delTT и 2143delT ассоциированы с гаплотипом 21-6-23-13. С гаплотипом 22-7-16-13 сцеплены мутации CFTRdele2,3(21kb), 1677delTA и L138insA; с гаплотипом 26-7-17-17 - мутации W1282X и R334W. Самым частым в выборке нормальных хромосом родителей больных МВ (23,5%) является гаплотип 22-7-16-13. Анализ четырех внутригенных маркеров (IVS1CA, IVS6aGATT, IVS8CA и IVS17BCA) и пяти внегенных маркеров (XV-2c; KM19; CS7; J3.11; W30) позволяет проводить пренатальную диагностику МВ практически во всех семьях (99,5%).
-
У российских больных МВ выявлена ассоциация между CFTR генотипом и тяжестью поражения как органов пищеварительной, так и бронхолегочной системы. У больных с двумя мутациями I и/или II классов дебютом заболевания чаще является кишечный синдром, манифестирующий в более раннем возрасте; колонизация легких P.aeruginosa начинается в более раннем возрасте, что приводит к более быстрому прогрессированию заболевания по сравнению с больными, имеющими, по крайней мере, одну мутацию IV или V класса.
-
Гены eNOS, MBL2 и HFE можно рассматривать как модификаторы клинических проявлений МВ у российских больных. Установлена ассоциация полиморфного аллеля A VNTR eNOS4 со снижением показателей функции внешнего дыхания (ФЖЕЛ и ОФВ1; p<0,05) и со снижением частоты цирроза печени (p<0,05). Выявлена ассоциация аллелей G54D, G57E, R52C и –221G>С гена MBL2 со снижением показателей ОФВ1 у детей дошкольного возраста (p<0,05), более ранним поражением P.aeruginosa (p=0,017) и ассоциация мутации G54D с более частым поражением Al. xylosoxidans (p=0,037) и St. maltophilia (p=0,049). Обнаружена ассоциация мутации Н63D гена HFE с более тяжелым поражением пищеварительной системы и ранней манифестацией кишечного синдрома (p<0,05).
-
Параметрами, которые необходимо учитывать при медико-генетическом консультировании в семьях с МВ и расчетах апостериорного риска, являются частота МВ (1:10965), частота гетерозиготного носительства мутантных аллелей МВ (0,019), доля выявляемых при ДНК-диагностике мутаций (75,5%) и относительные частоты МВ мутаций, если оба родителя происходят из популяций европейской части России. Риск МВ у новорожденного, положительно тестированного на ИРТ, составляет 0,0541 при обнаружении у него одной CFTR мутации и 0,0005, если ни одна из частых CFTR мутаций не обнаружена. Риск МВ у плода с эхогенностью кишечника, диагностированной при УЗИ во втором триместре беременности, при обнаружении CFTR мутации у одного из родителей составляет 0,1733, если ни одна из частых CFTR мутаций не обнаружена – 0,0017.
Личное участие автора в получении научных результатов.
Представляемая диссертационная работа является обобщением результатов многолетних комплексных исследований. Работа выполнена на базе лаборатории генетической эпидемиологии ГУ МГНЦ РАМН. Планирование эксперимента, обработка, анализ и обобщение материалов исследования выполнены лично автором. Автор участвовала в сборе популяционных образцов крови совместно с сотрудниками лаборатории генетической эпидемиологии и лаборатории экологической генетики ГУ МГНЦ РАМН, в сборе клинических данных о больных МВ совместно с сотрудником лаборатории генетической эпидемиологии Тимковской Е.Е. и сотрудниками научно-клинического отделения муковисцидоза д.м.н. Н.Ю. Каширской, к.м.н. Радионович А.М., к.м.н. Воронковой А.Ю. Автором создана коллекция ДНК больных МВ и их родственников. Выделение ДНК из образцов крови и ворсин хориона плодов, анализ частых мутаций в гене CFTR у 776 больных МВ, 1082 родителей, в популяционных выборках (3739 индивидов); анализ внутригенных и внегенных полиморфизмов в семьях с МВ (344 больных и 488 родителей); проведение 109 пренатальных диагностик МВ выполнены лично автором. Анализ кодирующей последовательности гена CFTR в выборке 50 пациентов методом денатурирующего гель-электрофореза проведен в Институте биогенетики (Брест, Франция); анализ полиморфизма генов-модификаторов клинической картины МВ (148 больных, гомозиготных по мутации F508del) проведен совместно с сотрудником лаборатории Тимковской Е.Е.; анализ последовательности 5’ регуляторной и промоторной области гена CFTR у 83 больных МВ и 50 здоровых индивидов методом анализа конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов ДНК проведен совместно с сотрудниками лаборатории к.б.н. М.Ю. Скобловым и О.Н. Нурутдиновой, что оговорено в соответствующих местах текста. Статистический анализ: расчет относительных частот мутаций, расчет популяционной частоты мутации F508del, оценка частоты МВ в популяциях европейской части России, анализ гено-фенотипических корреляций у российских больных МВ, оценка возможного влияния генов-модификаторов на клиническую картину МВ у больных с одинаковым CFTR генотипом, расчет генетических рисков при наличии двух независимых факторов риска МВ в разных регионах России выполнены лично автором.
Апробация работы.
Результаты исследования были представлены на Европейских конференциях по муковисцидозу (в 1991, 1996, 1999, 2006, 2008 годах); на Европейских международных симпозиумах по муковисцидозу (в 1997, 2000, 2001, 2002, 2003 годах); на Европейской конференции по генетике человека (2008 г.); на 2 (4) Российском съезде медицинских генетиков (Курск, 2000 г.); на 5-ом Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург – Гастро-2003» (С.-Петербург, 2003 г.); на Всероссийской научно-практической конференции «Современные достижения клинической генетики» (Москва, 2003 г.); на Третьем съезде генетиков и селекционеров России “Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития” (Москва, 2004 г.); на Третьих антропологических чтениях к 75-летию со дня рождения академика В.П.Алексеева «Экология и демография человека в прошлом и настоящем» (Москва, 2004 г.); на V Съезде Медицинских генетиков (Уфа, 2005 г.); на VII национальном конгрессе по муковисцидозу (Воронеж, 2005 г.); на Российском Медицинском Форуме «Фундаментальная наука и практика» (Москва, 2006 г.); на VIII Национальном конгрессе «Муковисцидоз у детей и взрослых» (Ярославль, 2007 г.); на межлабораторном семинаре ГУ МГНЦ РАМН (25 июня 2008 г.).
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 74 работы из них 38 в журналах, рекомендуемых ВАК МОН РФ.
Структура и объем работы.
Работа изложена на 305 листах машинописного текста; состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 4 глав собственных исследований и обсуждений результатов, заключения, выводов, списка цитированной литературы (401 источник, в том числе 45 отечественных и 356 зарубежных) и приложения. Иллюстративный материал содержит 68 таблиц, 43 рисунка, 33 таблицы Приложений.
Научная новизна и практическая значимость работы
Муковисцидоз (MB, CF; OMIM #219700) наиболее частое наследственное аутосомно-рецессивное заболевание среди европеоидов. Муковисцидоз обусловлен мутациями в гене CFTR, муковисцидозного трансмембранного регулятора проводимости [OMIM #602421]. Белок CFTR, функционируя как цАМФ-зависимый хлорный канал, регулирует работу других хлорных и натриевых каналов, участвует в транспорте воды, является сенсором внутриклеточного уровня АТФ и медиатором транспорта эндоплазматических пузырьков [Riordan J.M. et al., 1989], в период внутриутробного развития организма играет роль в клеточной дифференциации [Cohen J. С, Larsen J. Е., 2005]. При этом заболевании в той или иной степени в патологический процесс вовлекаются экзокринные железы разных систем организма, но в большей степени страдают органы дыхания, поджелудочная железа, печень, желчные пути, пищеварительный тракт, потовые железы и урогенитальный тракт [Иващенко Т.Э., Баранов B.C., 2002; Капранов Н.И. и др., 2004; Witt Н., 2003].
В настоящий момент описаны более 1500 мутаций и 250 полиморфизмов в гене CFTR, частоты которых широко варьируют в разных этнических группах [CFTR mutation database, http://www.genet.sickkids.on.ca/cfitr/]. Спектры различных мутаций и полиморфизмов гена CFTR обладают выраженной популяционной специфичностью, являясь отражением генетических процессов, формирующих популяции. Это вносит объективные сложности в разработку протоколов проведения ДНК-диагностики MB среди населения, относящегося к разным этническим группам и проживающего в разных регионах.
MB наиболее распространен среди европеоидов (1:2500 до 1:4500 новорожденных). Частота MB варьирует в разных популяциях в весьма широких пределах (например, в Европе от 1 : 1800 новорожденных в Ирландии до 1 :26000 новорожденных в Финляндии) [WHO, 2004]. Оценки частоты MB в разных популяциях Российской Федерации (РФ) также весьма различны (от 1:4900 до 1:12000 живорождённых) [Петрова Н.В.,.Гинтер Е.К, 1997; Капранов Н.И., 2001, 2006, Радионович A.M. и др., 2005; Воронин СВ. и др., 2007; Матулевич С.А., 2007; Михальчук В.В. и др., 2007; Одинокова О.Н и др., 2007]. Определение спектра мутаций в гене CFTR, характерных для больных MB из разных регионов и этнических групп, является важным условием разработки рациональной стратегии пренатальнои и постнатальнои диагностики этого заболевания и одним из аспектов популяционно-эпидемиологических исследований наследственной патологии человека, в том числе и в России.
В странах с высокой распространенностью MB разработаны программы скрининга новорожденных, направленные на раннее и возможно более полное выявление больных, а также программы скрининга беременных женщин для выявления гетерозиготных носителей MB. Начиная с 2006 года, MB включен в список наследственных заболеваний, подлежащих обязательному неонатальному скринингу в Российской Федерации, наряду с фенил кетону рией, гипотериозом, галактоземией и адреногенитальным синдромом. Значительный прогресс в области ранней диагностики и терапии MB способствует трансформации MB из безусловно фатального заболевания детского возраста в хроническую патологию взрослых. В развитых странах отмечается рост числа больных MB подросткового, юношеского возраста и взрослых [Амелина Е.Л, 2001; WHO, 2004]. Медиана продолжительности жизни больных MB, родившихся в 2000 году, составит более 50 лет [Dodge J., 2007; Warwick W.J., Braverman J., 2007].
Однако продолжительность жизни, спектр и тяжесть клинических проявлений значительно варьируют среди больных MB. Взаимосвязь между вариабельностью клинического течения и CFTR генотипом неоднозначна. С одной стороны, установлена четкая зависимость между мутациями в гене CFTR и недостаточностью внешнесекреторной функции поджелудочной железы [Kerem Е. et al., 1990; Kerem В. S., Kerem E., 1996]. Выделена группа мутаций, ассоциирующих обычно с сохранностью функции поджелудочной железы, и эти, так называемые, «мягкие» мутации обладают доминантным эффектом, т.к. остаточная экзокринная функция поджелудочной железы отмечается даже у пациентов, несущих «тяжелую» мутацию во втором CFTR аллеле. Однако, с другой стороны, связь между CFTR генотипом и другими проявлениями MB не столь очевидна. В частности, течение бронхолегочного процесса, определяющее качество и продолжительность жизни больных MB, по мнению ряда авторов [Ferrari М., Cremonesi L. , 1996; Parad R.B. et al., 1999; McKone E.F. et al., 2006], впрямую не зависит от CFTR генотипа, а в значительной степени обусловлено факторами окружающей среды. Кроме того, различие в течении MB наблюдается у больных, проживающих в равных социальных условиях, наблюдаемых в одних медицинских центрах и имеющих одинаковые мутации в гене CFTR, в частности, у сибсов, причем конкордантность по тяжести заболевания у монозиготных близнецов, достоверно выше, чем у дизиготных [Mekus F. et ah, 2000; Vanscoy L.L. et al., 2007], что позволяет предполагать влияние на клиническую картину MB других генетических факторов, отличных от гена CFTR.
В настоящее время во всем мире ведется активный поиск генов, оказывающих влияние на клинические проявления MB. Изучается ряд генов, белковые продукты которых могут быть вовлечены в патогенетические механизмы MB. Особое внимание уделяется генам, продукты которых вовлечены в иммунную защиту организма [Drumm M.L. et al., 2005; Salvatore F. et al., 2002; Witt FL, 2003]..
По-видимому, вариабельность клинических проявлений MB является следствием взаимодействия нескольких факторов: CFTR мутаций, модифицирующих факторов в гене CFTR и/или других генах и влияния окружающей среды [Loubieres Y., et al., 2002]. В связи с широкой вариабельностью клинической картины выявление факторов, вовлеченных в патогенез отдельных симптомов MB является важной медико-генетической задачей во всем мире, решение которой позволит не только выявить генетические факторы риска определенных осложнений, но может способствовать созданию новых этиопатогенетических подходов к терапии заболевания, что будет способствовать дальнейшему увеличению продолжительности и повышению качества жизни больных.
Несмотря на интенсивное изучение муковисцидоза специалистами разных направлений, в том числе и в России, интерес к проблемам этого заболевания не ослабевает. Решение вопросов, связанных с изучением распространенности MB в разных популяциях и этнических группах, выявления гено-фенотипических корреляций, определения факторов, лежащих в основе вариабельности клинических проявлений, особенностей консультирования в связи с введением пресимптоматической диагностики в России представляется актуальным.
Классификации CFTR мутаций в зависимости от первичного повреждающего эффекта
Поскольку при этом каждый индивид анализируется отдельно, по желанию индивида информация о его MB статусе может быть передана родственникам и членам семьи. Брачно-парная модель рассматривается как менее удобная, поскольку консультируется сразу брачная пара, и результат должен быть предоставлен сразу обоим партнерам. Положительно тестированными считаются только пары, в которых оба партнера являются носителями CFTR мутаций. Каскадное тестирование охватывает тестирование других членов семьи после выявления пораженного MB или носителя. Широта охвата этого вида скрининга зависит от информированности членов семьи, а также от желания информированных индивидов быть протестированными. Поэтому каскадное тестирование не рассматривают как метод популяционного скрининга [Langerfelder-Schwind Е., 2005].
За последние несколько лет в некоторых развитых странах уровень выживаемости больных MB вышел на плато. Дальнейшее значительное увеличение продолжительности жизни при MB требует разработки новых стратегий лечения и мониторинга больных [Doring G., Hoiby N., 2004]. К таким стратегиям относятся неонатальный скрининг общей популяции для выявления больных MB [Wilcken В., 2003; Ratjen F., Doring G., 2003], раннее назначение антибактериальной и противовоспалительной терапии выявленным в результате скрининга пациентам, внедрение эффективных методов гигиены внутри и вне центров MB, составление регистров пациентов [Doring G., Hoiby N., 2004].
Цель неонатального скрининга заключается в идентификации новорожденных с MB на максимально ранних этапах жизни. Новорожденным с MB, выявленным при неонатальном скрининге, стандартная терапия может назначаться раньше, чем пациентам, у которых диагноз MB устанавливается на основании клинических симптомов, и такая ранняя помощь может быть более полезной с клинической точки зрения [Wilcken В., 2003; Green M.R., Weaver L.T., 1994]. Неонатальный скрининг предполагает возможность более раннего проведения генетического консультирования, при этом особенно ценным представляется то, что такое консультирование будет проведено до зачатия следующего ребенка и сможет повлиять на репродуктивное поведение супругов и их родственников с сохранными детородными функциями [Dankert-Roelse J.E. et al., 2005; Dudding Т. et al., 2000]. Так показано, что со времени введения скрининговой программы в провинции Бретань во Франции произошло снижение частоты MB среди новорожденных, по разным оценкам, на 15-30% [Scotet V. et al., 2003; Dankert-Roelse J.E. et al., 2005]. Кроме того, неонатальный скрининг позволит снизить стресс родителей больного ребенка, связанный с отложенным по времени диагнозом [Merelle М.Е. et al., 2003].
В ряде исследований установлено, что постановка диагноза MB в первые недели жизни, до развития симптомов, приводит к улучшению состояния пациентов на более поздних этапах жизни [Wang S.S. et al., 2002; Mastella G. et al., 2001; Sims E.J. et al., 2005; Rosenfeld M., 2005; Farrell P.M. et al., 2001]. При более поздней диагностике MB недостаточность питания может стойко персистировать, при этом возрастная нутритивная норма может оставаться недостижимой, ранняя же диагностика в сочетании с интенсивной диетотерапией способна предотвратить недостаточность массы и роста пациентов [Farrell P.M. et al., 2005; Dankert-Roelse J.E. et al., 2006]. По результатам нескольких проспективных исследований неонатальная диагностика связана со снижением уровня госпитализаций [Dankert-Roelse J.E. et al., 2005; Sims E.J. et al., 2005] и улучшением клинических показателей в детском возрасте [Merelle М.Е. et al., 2001; Mastella G. et al., 2001; Dankert-Roelse J.E. et al., 2005; Dankert-Roelse J.E. et al., 2006; Siret D. et al:-, 2003].
Данные регистра США свидетельствуют, что ранняя бессимптомная диагностика (возраст 6 недель) не влияет на частоту хронических инфекций P.aeruginosa, главного фактора прогрессирования заболевания легких [Wang S.S. et al., 2001], что, вероятно, отражает врожденную чувствительность дыхательных путей больных MB к оппортунистическим внешним патогенным микроорганизмам и различия в методах ранней терапии. В соответствии с последней информацией, зафиксированной в Базе данных MB Великобритании, раннее выявление с помощью скрининга не приводит к улучшению показателей инфицирования P.aeruginosa в течение первых 2-х лет жизни пациентов [Mehta G. et al., 2001]. Однако, в отличие от исследования S.S. Wang с соавторами [2001] E.J. Sims с соавторами [2005] отмечают, что у пациентов в возрасте старше 2-х лет, диагностированных в результате скрининга, достоверно реже выявляются одна или более позитивных культур P.aeruginosa в сравнении с пациентами с более поздним установлением диагноза. Это может быть связано с более ранней терапией, которая, благодаря скринингу, может назначаться уже после первого инфицирования этим патогенным микроорганизмом.
Также сообщается о повышении уровня выживаемости пациентов, диагностированных в результате неонатального скрининга, в сравнении с клинически диагностированными [Dankert-Roelse J.E. et al., 1995; Dankert-Roelse J.E. et al., 2005; Merelle M.E. et al., 2001]. Начиная с середины 1980-х годов, произошло улучшение качества лечения больных MB, связанное с более эффективной антибиотикотерапией и улучшением методов коррекции нутритивного статуса, включая заместительную терапию, более эффективными кислотоустойчивыми панкреатическими ферментами, что привело к увеличению прогнозируемой продолжительности жизни больных с MB. В нескольких исследованиях показано, что и в условиях современных прогрессивных методов лечения выявление больных в ходе скрининга новорожденных способствует сохранению функции легких и нутритивного статуса, а также снижению смертности как в периоде новорожденности, так и в детском и подростковом возрасте [Mehta G. et al., 2001; Doull I.J. M. et al., 2001; Sims E.J. et al., 2005; McKay K.O. et al., 2005; Mahadeva R. et al., 1998; Maselli J.H. et al., 2003].
Популяционные выборки
В выборке нормальных хромосом обнаружено 11 аллелей IVS1CA, их частоты приведены в табл. 27. Наиболее распространенными среди нормальных хромосом являются аллели 22, 21 и 23 (36,9%, 25,0% и 15,3%, соответственно). Подобное распределение частот аллелей IVS1CA показано для ранее исследованных европеоидных популяций [Mateu Е. et al., 1999]. В выборке мутантных хромосом обнаружено 10 аллелей. Наблюдаются достоверные различия в частотах встречаемости аллелей IVS1CA между выборками нормальных и MB хромосом (р 0,001), а также выявлено значительное неравновесие по сцеплению для аллелей 21, 22 и 23 (Ast j 0,l; табл. 27).
Электрофореграмма анализа полиморфизма динуклеотидных СА повторов в 1 интроне гена CFTR. 1, 13 - генотипы, гомозиготные по аллелю 21 (21/21); 2 -генотип, гетерозиготный по аллелям 22 и 25 (22/25); 3 - генотип, гетерозиготный по аллелям 21 и 24 (21/24); 4 - генотип, гетерозиготный по аллелям 23 и 24 (23/24); 5, 9 - генотипы, гетерозиготные по аллелям 23 и 27 (23/27); 6, 14 - генотипы, гомозиготные по аллелю 22 (22/22); 7 - генотип, гетерозиготный по аллелям 24 и 26 (24/26); 8 - генотип, гетерозиготный по аллелям 21 и 22 (21/22); 10 - генотип, гетерозиготный по аллелям 22 и 24 (22/24); 11 - генотип, гетерозиготный по аллелям 24 и 27 (24/27); 12 - генотип, гетерозиготный по аллелям 22 и 23 (22/23).
Наиболее частым среди мутантных хромосом является аллель 21 (63,7%; Astd=-0,389). Он встречается в 95,8% MB хромосом с мутацией F508del (AStd=-0,724). Аллель 22, наиболее частый среди нормальных хромосом (36,9%), среди MB хромосом встречается существенно реже (20,6%; AStd=0,180), а среди MB хромосом с мутацией F508del - только в 2,6% случаев (р 0,001; AStd=0,431).
По данным литературы [Mateu Е. et al., 2002] три наиболее частые в мире мутации, F508del, G542X и N1303K, явно ассоциируют с аллелем 21, который вероятно присутствовал в гаплотипах хромосом, на которых возникли эти мутации. В исследованной нами выборке мутантных хромосом эти мутации таюке преимущественно ассоциированы с аллелем 21.
Различия частот аллелей полиморфных тетрануклеотидных GATT повторов в 6а интроне гена CFTR (IVS6aGATT) определяли в выборках 468 нормальных и 670 мутантных хромосом (в том числе 334 с мутацией F508del) (рис. 19).
В изученной выборке обнаружено 3 аллеля (табл. 28), аллель 8 встречался только среди нормальных хромосом. Различие частот аллелей полиморфизма IVS6aGATT в выборках нормальных хромосом и мутантных хромосом достоверно (р 0,001, табл. 28).
В выборке нормальных хромосом наиболее частым является аллель 7 (80,6%), что характерно для большинства современных популяций, кроме некоторых тихоокеанских островных популяций и обследованного коренного населения Латинской Америки [Mateu Е. et al., 2001; Бермишева М.А. и др., 2007; под ред. Е.К. Гинтера, 2002; Хуснутдинова Э.К. и др., 2003]. Среди мутантных MB хромосом самым частым является аллель 6 (65,4%; Astd=-0,467), при этом в исследованной выборке наблюдается абсолютное сцепление аллеля 6 с мутацией F508del в исследованной выборке хромосом (AStd=-0,823). Результат согласуется с данными литературы как отечественной, так и зарубежной [Chehab F.F. et al., 1991; Gaitskhoki V.S. et al., 1993; Иващенко Т.Э., 2000; Корытина Г.Ф. и др., 2002].
Частоты аллелей полиморфных динуклеотидных СА повторов в 8 интроне гена CFTR (IVS8CA) определяли в выборках 436 нормальных и 621 мутантной хромосомы (в том числе 312 с мутацией F508del) (рис. 20).
В изученной выборке обнаружено 10 аллелей (табл. 29). Выявлено неравновесие по сцеплению аллелей 16, 17 и 23 в изученной выборке хромосом. В выборке нормальных хромосом наиболее распространенными являются аллели 16 (60,4%) и 17 (29,7%). Сходное распределение аллелей среди нормальных хромосом наблюдается и в популяциях Западной Европы [Claustres М. et al., 1996; Mateu Е. et al., 2001; Morral N. et al., 1993]. Среди мутантных хромосом самыми частыми являются аллели 17 (37,8%), 23 (30,1%) и 16 (30,4%), причем в выборке хромосом с мутацией F508del преимущественно встречаются аллели 17 и 23 (59,7% и 38,1%, соответственно). Различие в частотах аллелей локуса IVS8CA в выборках нормальных хромосом и мутантных хромосом достоверно (р 0,001, табл. 28).
Различия в частотах аллелей локуса IVS17bCA между выборками нормальных и мутантных хромосом достоверны (р 0,001). Аллель 13 является наиболее распространенным как среди нормальных, так и среди мутантных хромосом, но его доля выше в выборке MB хромосом (83,9%; AStd=-0,179), достигая 96,7% среди мутантных хромосом с мутацией F508del (Astd -0,371). Встречаемость аллеля 17 в выборке мутантных хромосом (13,0%) достоверно ниже, чем в выборке нормальных хромосом (19,0%). Аллель 13 является наиболее частым во всех изученных популяциях [Claustres М. et al., 1996; Magnani С. et al., 1994; Morral N. et al., 1992; Morral N. et al., 1993; Morral N. et al., 1994a; Russo M.P. et al., 1995].
Итак, установлены различия распределения полиморфных аллелей внутригенных маркеров IVS1CA, IVS6aGATT, IVS8CA, IVS17bCA гена CFTR на нормальных и мутантных хромосомах. Выявлено, что определенные аллели полиморфных маркеров находятся в значительном неравновесии по сцеплению с мутацией F508del.
Анализ частот гаплотипов внутригенных полиморфизмов на нормальных и мутантных хромосомах
Интестинальные нарушения при MB вызваны нарушением секреции клетками кишечника ионов хлора, что ведет к дегидратации кишечного содержимого и повышению слизеобразования. Ранним и грозным кишечным проявлением является мекониальный илеус (обтурация просвета кишечника замазкоподобным меконием), встречающийся у 5-20% больных MB и развивающийся из-за дисфункции желез тонкого кишечника и недостаточного переваривания интестинального содержимого вследствие панкреатической ахилии [Капранов Н.И. и др., 2004; Martin P.M., et al„ 2003; Salvatore F., et al., 2002]. Начало кишечных проявлений MB возможно и во внутриутробный период развития.
Одним из маркеров возможной врожденной патологии плода является повышенная эхогенность и расширение петель кишечника, обнаруживаемая у плода при ультразвуковом исследовании (УЗИ) во втором триместре беременности. Эхогенный кишечник плода, определяемый как кишечник, сонографическая плотность которого превышает плотность окружающих костей, диагностируется у 0,2-1,8% плодов при рутинном ультразвуковом обследовании во втором триместре беременности. Вначале эта интестинальная эхогенность описывалась как вариант нормы, который обычно исчезает на 20 неделе беременности. Потом было показано, что она ассоциирована с различными аномалиями плода: хромосомными аномалиями, врожденными инфекциями, интестинальной обструкцией и MB. Так в исследовании V. Scotet с соавторами [2002] 9,9% плодов с эхогенным кишечником оказались поражены MB; 4,7% имели хромосомные аномалии, включавшие синдром Дауна, синдром Тернера и трисомию 18 хромосомы; 3,1% с врожденными вирусными инфекциями (цитомегаловирус и токсоплазма), также в единичных случаях были обнаружены редкие патологии (токсемия gravidis и тетрада Фалло). Внутриутробная гибель плода была отмечена в 7% случаев. В обширном коллаборативном исследовании В. Simon-Bouy с соавторами [2003] показано, что MB был диагностирован у 3% плодов с эхогенным кишечником, в 6,9% случаев наблюдались множественные аномалии развития, 3,5% - хромосомные нарушения, в 2,8%о - вирусные инфекции, в 1,9% - внутриутробная гибель плода, 1,2% -токсемия и в 6,2% - преждевременные роды. F. Muller с соавторами [2002] показали, что риск MB при выявлении аномалий желудочно-кишечного тракта при рутинном УЗИ составляет 3,1%. Риск значительно повышается, если гиперэхогенность сочетается с дилятацией кишечника (17%) или отсутствием желчного пузыря (25%). При обнаружении одной из частых CFTR мутаций риск MB у плода с эхогенностью кишечника возрастает до 11%. Помимо высокой частоты пораженных MB среди плодов с эхогенным кишечником выявляется высокая частота носителей мутаций в гене CFTR, превышающая наблюдаемую в популяции, по крайней мере, в 2 раза [Scotet V. et al., 2002], хотя в исследованиях F. Muller с соавторами [2002] увеличения числа гетерозигот по сравнению с популяционным не обнаружено. Показано, что среди пораженных и носителей MB, у которых отмечался эхогенный кишечник, при ДНК-диагностике чаще обнаруживаются «тяжелые» мутации [Muller F., et al., 2002]. Таким образом, авторы полагают, что аномалии кишечника у плода являются фактором высокого риска MB с тяжелым течением и предлагают рекомендовать скрининг на CFTR мутации семьям, у плодов которых при рутинном скрининге обнаружена эхо генно сть кишечника. В исследуемой популяции с высокой частотой MB (Франция) это позволяет выявить до 11% больных [Muller F., et al., 2002;.Scotet V et al., 2002]. Расчет риска MB у плода как в случае положительного, так и отрицательного результата ДНК-тестирования, необходим при генетической консультации таких семей.
В работах S. Ogino с соавторами [2004а; 2004b] представлены примеры расчета остаточного риска плода, положительно тестированного при УЗИ, в различных ситуациях, учитывающих положительный УЗИ тест и результат анализа CFTR мутаций как независимые факторы риска. Для аккуратного расчета необходимо знать вероятности того, что плод при положительном УЗИ кишечника поражен MB, является или не является носителем CFTR мутаций. Единственной работой, где приводятся данные, используя которые можно провести расчет таких вероятностей, является исследование V. Scotet с соавторами [2002]. S. Ogino с соавторами [2004а] показывают, что вероятности того, что плод поражен MB, является или не является носителем CFTR мутаций при положительном УЗИ кишечника, составляют 0,11; 0,00089 или 0,00035, соответственно. Эти вероятности следует учитывать при генетическом консультировании и более точном расчете риска MB у плода, по крайней мере, как ориентировочные, поскольку в популяциях другого этнического состава данные вероятности могут отличаться.
Также необходимо учитывать частоту MB, частоту гетерозиготного носительства мутантных аллелей MB, долю выявляемых при ДНК-диагностике мутаций и относительные частоты MB мутаций в регионах и этнических группах, к которым принадлежат консультируемые. В наших расчетах были использованы данные, представленные в таблице 52.
Рассмотрены несколько ситуаций, встретившиеся в практике нашей лаборатории. Задача состояла в расчете риска плода быть пораженным MB при обнаружении у него эхогенного кишечника, при условии отсутствия семейной истории MB. Первоначальная ситуация - это ситуация до проведения ДНК-исследования.
Похожие диссертации на Молекулярно-генетические и клинико-генотипические особенности муковисцидоза в российских популяциях
-
