Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Фермент триптофаноксигеназа 9
1.1.1. Структура гена TD02 и регуляция его экспрессии 10
1.2. Роль триптофаноксигеназы в развитии психических расстройств 13
1.2.1. Ассоциация между развитием определённых психических расстройств и полиморфизмом гена TD02 17
1.3. Полиморфизм генов в популяции человека 19
1.3.1. SNP в кодирующих последовательностях генов человека 22
1.3.2. SNP в некодирующих последовательностях генов человека 28
1.3.3. Неслучайный характер фиксации SNP в некодирующих районах генов 32
1.4. Транскрипционные факторы YY1 и GATA6 35
1.5. Транскрипционный фактор YY1 36
1.4.2. Транскрипционный фактор GATA6 39
2. Материалы и методы 42
2.1. Материалы 42
2.2. Олигонуклеотиды 42
2.3. Линии животных 45
2.4. Приготовление экстракта ядер клеток печени 45
2.5. Метод торможения ДНК-пробы в геле 46
2.6. Вестерн-блот анализ 47
2.7. Окраска белков красителем "Ferry-Dye" 48
2.8. Определение активности триптофаноксигеназы и тирозинаминотрансферазы
2.9. Выделение геномной ДНК 50
2.10. ПЦР 51
2.11. Выделение продуктов ПЦР из агарозных гелей 52
2.12. Определение нуклеотидных последовательностей ДНК 52
3. Результаты 54
3.1. Изучение связывания транскрипционных факторов с различными вариантами района 651 - 680 п.о. интрона 6 гена TD02 человека 54
3.2. Идентификация белков, связывающихся с изучаемым районом 57
3.3. Определение базального уровня активности триптофаноксигеназы у полярных по моделям поведения линий мышей 78
3.4. Обнаружение SNP в районе интрона 6 гена TD02 у контрастных по моделям поведения линий мышей 81
3.5. Идентификация белков, связывающихся с SNP в интроне гена TD02 мыши 85
4. Выводы 97
5. Список цитированной литературы 99
- Роль триптофаноксигеназы в развитии психических расстройств
- SNP в некодирующих последовательностях генов человека
- Определение активности триптофаноксигеназы и тирозинаминотрансферазы
- Идентификация белков, связывающихся с изучаемым районом
Введение к работе
Актуальность исследования. Самым распространенным вариантом полиморфизма последовательностей ДНК являются единичные нуклеотидные замены (SNP), особый интерес к изучению которых связан с тем, что они часто оказываются ассоциированы с различными клинически важными признаками. При этом до сих пор основные усилия сосредоточены на выявлении и изучении SNP в кодирующих районах генов и сайтах сплайсинга [Krawszak etal., 2000], поскольку такие SNP приводят к изменению структуры белкового продукта гена, что легко детектируется и интерпретируется. Однако основная масса SNP у человека обнаруживается в других районах генов, в том числе регуляторных, но этим SNP уделяется гораздо меньше внимания. В последнее время начали развиваться работы по выявлению SNP в промоторных районах и изучению их влияния на регуляцию экспрессии генов, но исследования, направленные на, выявление и функциональную интерпретацию потенциальных регуляторных SNP в интронах, до сих пор единичны. В то же время постоянно возрастающий объем работ по поиску SNP в протяжённых районах генов человека, приводящий к накоплению данных об имеющих клинические проявления и не затрагивающих сайты сплайсинга SNP в интронах, требует функционального анализа подобных SNP и установления конкретных механизмов их проявления.
Фермент триптофаноксигеназа (TD02) является одним из ключевых
звеньев в цепи биосинтеза нейромедиатора серотонина. Поэтому ген
TD02 часто рассматривается как один из генов-кандидатов на связь с
различными нарушениями поведения. В частности, установлена
статистически достоверная ассоциация между двумя SNP в гене TD02
человека в позициях 663 п.н. и 666 п.н. от начала интрона 6 и такими
расстройствами поведения, как синдром Туретта,
предрасположенность к наркотической, алкогольной зависимости и патологической склонностью к азартным играм [Comings etal., 1996]. Данные SNP находятся в некодирующем районе гена TD02, являющемся потенциальным регуляторным районом. Последнее обстоятельство дало нам возможность предположить, что мы имеем дело с так называемыми регуляторными SNP, расположенными в регуляторной зоне гена и влияющими' на его экспрессию за счёт изменения в связывании с данным районом регуляторных ядерных белков.
Цель и задачи исследования. Целью исследования являлось выяснение молекулярных механизмов влияния SNP в интроне 6 гена TD02 человека на развитие ряда психических нарушений и изучение адекватности общепринятой экспериментальной модели (мыши линии C57BL), связывающей предрасположенность к алкоголизму с повышенным уровнем экспрессии гена TD02.
Р0С. НАЦИОНАЛЬНА]! БИБЛИОТЕКА ff-Bfa?
В ходе выполнения данной работы были решены следующие задачи:
изучение возможных молекулярных механизмов влияния ассоциированных с рядом психических расстройств SNP в интроне 6 гена TD02 человека (G-»A в позиции 663 п.н. G-»Tib позиции 666 п.н. относительно начала интрона) на экспрессию этого гена;
проверка имеющихся литературных данных о том, что предрасположенность линии мышей C57BL к развитию алкоголизма связана с повышенным по сравнению с другими линиями мышей уровнем активности TD02 в печени;
3) поиск и сравнительное изучение SNP в районе интрона 6 у
.нескольких линий мышей, определение связывающихся с районами
SNP ядерных белков и поиск корреляций между SNP, изменениями
спектра связывающихся белков и признаком
предрасположенности/устойчивости к развитию алкоголизма.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые показано, что всем трём обнаруженным в популяциях человека аллелям гена TD02 присущи индивидуальные наборы белковых факторов, взаимодействующих с исследуемым районом. Основной связывающийся с наиболее распространённым аллелем WT белок идентифицирован как транскрипционный фактор YY1. Для двух других аллелей обнаружено разрушение сайта связывания фактора YY1 и появление сайтов связывания одного или двух неидентифицированных нами белков (G->A в позиции 663 п.н.), либо сайта связывания транскрипционного фактора GATA6 (G->T в позиции 666 п.н.), что может оказывать существенное влияние на экспрессию гена TD02.
В результате определения нуклеотидных последовательностей интрона 6 гена TD02 для шести линий мышей обнаружено 5 SNP и одна микроделеция. Обнаружено, что 3 SNP приводят к изменению спектра ядерных белков, связывающихся с этими районами.
Изучена активность TD02 в печени шести линий мышей. Не установлено связи между уровнем активности TD02 в печени мышей, распределением SNP в интроне 6 и изменениями спектра связывающихся с этими районами ядерных белков с признаком предрасположенности/устойчивости к развитию алкоголизма. Таким образом, у мышей линии C57BL, в отличие от человека, не обнаружен вклад TD02 в формирование алкогольной зависимости.
Полученные нами данные вносят вклад в понимание механизма влияния SNP в интронах на экспрессию гена и реализацию фенотипических признаков, а так же уточняют рамки применимости модельных линий животных при изучении генов, оказывающих влияние на поведение человека.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на межлабораторных семинарах ИциГ, на XIII всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (Пущино, 2000), и на международных конференциях: «Применение информационных технологий к проблемам биоразнообразия и динамики экосистем Северной Евразии» (Новосибирск, 2001); «Genetic and Developmental Psychoneuroendocrinology» (Novosibirsk. 1999); «150-anniversary of Ivan Pavlov International Symposium" (St. Petersburg, 1999).
Публикации по теме диссертации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, изложения и обсуждения собственных экспериментальных данных, выводов и списка литературы (184 наименования). Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, и содержит 2 таблицы и 18 рисунков.
В работе использовали самцов крыс линии Sprague-Dowley весом 150-180г. и 6-9 - месячные самцов мышей линий C57BL/6J, СВА/Са, DBA/2J, BALB/cJ и CC57BR/Mv разведения вивария Института цитологии и генетики СО РАН.
ДНК-связывающую активность факторов транскрипции в экстрактах ядер оценивали методом задержки ДНК-пробы в геле. Экстракты ядер получали согласно (Gorski eta/., 1986) в модификации (Shapiro eta/., 1988). Содержание факторов транскрипции в них оценивали методом вестерн-блот гибридизации. Для визуализации результатов использовали ECL-систему фирмы "Amersham". Секвенирование ДНК проводили на автоматическом секвенаторе ABI-Prism 310. Определение активности ТД02 проводили по модифицированному методу (Seglen, Jervell, 1969).
Статистическую обработку результатов проводили используя Т-критерий Стьюдента
Роль триптофаноксигеназы в развитии психических расстройств
В настоящее время установлена связь дефектов в процессах метаболизма серотонина с множеством психических расстройств и отклонений, таких, как: ведущая к суициду тяжёлая депрессия; различные фобии [Brown, van Praag, 1990]; предрасположенность к шизофрении и алкоголизму [Le Marquand et al., 1994]; синдром Туретта [Comings, 1990]; каталепсия [Popova, Kulikov, 1995] и другие. В возникновении всех перечисленных расстройств серьёзную роль играет генетическая предрасположенность, то есть, дефекты либо в кодирующей части соответствующих генов, либо в системах регуляции активности этих генов. Статистический анализ в популяциях человека показал, что на такие заболевания, как предрасположенность к шизофрении и алкоголизму, депрессия и синдром Туретта отсутствует аддитивное влияние более чем 4-6 генов [Propping et alt 1993], что заметно ограничивает число генов-кандидатов, оказывающих существенное влияние на широкий спектр заболеваний, связанных с дефектами метаболизма нейромедиатора серотонина.
Фермент триптофаноксигеназа играет важную роль в регуляции уровня серотонина в мозге. Скорость синтеза этого нейромедиатора в мозге пропорциональна концентрации свободного триптофана, поскольку для лимитирующего этот процесс фермента триптофангидроксилазы концентрация субстрата (триптофана) в плазме крови в физиологических условиях значительно ниже константы Михаэлиса [Morgan, Badawy, 2001] Поэтому существенное влияние на синтез серотонина оказывает уровень триптофана (метаболического предшественника серотонина) в крови [Comings, 1990]. Корреляция между уровнем триптофана в крови и различными психическими расстройствами наблюдается как в популяции человека [LeMarquand et al, 1994], так и на модельных линиях экспериментальных животных [Badawy et al, 1993]. Триптофан 2,3-диоксигеназа (TD02) является ключевым ферментом деградации триптофана, что делает ген TD02 одним из важных объектов изучения в генетике психических расстройств.
Для перечисленных нарушений поведения лучше всего изучена связь между TD02 и склонностью к алкоголизму, как у человека, так и у лабораторных животных. Принято считать, что дефицит нейромедиатора серотонина в мозге может являться ключевым фактором, обеспечивающим предрасположенность к повышенному потреблению алкоголя как у человека, так и у лабораторных животных [Badawy et ah, 1993]. Так, хорошо изученной и широко используемой в экспериментах моделью предрасположенности к алкоголизму является линия мышей C57BL [Naranjo et ah, 1986]. Для мышей этой линии характерно потребление больших количеств 8%-го этанола при наличии свободного выбора, а также 4-5 кратное увеличение количества потребляемого этанола после его внутривенного введения (модель запоя). Мыши C57BL также характеризуются набором других нарушений поведения, таких, как повышенная агрессивность и склонность к аудиогенному шоку [Бландова и др., 1983]. Для этой линии характерны пониженная концентрация серотонина в мозге [Serri, Ely, 1984], пониженный уровень циркулирующего в крови триптофана и повышенный уровень активности TD02, что считается основным фактором, обусловливающим предрасположенность C57BL к алкоголизму [Badawy et ah, 1989]. Сравнительное исследование содержания серотонина в мозге у людей с предрасположенностью к алкоголизму и контрольных выборок весьма затруднено, однако непрямые методы показывают, что корелляции между уровнем триптофана в плазме крови, серотонином в мозге и склонностью к алкоголизму у людей аналогичны таковым у модельных линий грызунов. Так, измеряемое отношение концентрации выводимого с мочой метаболита серотонина 5-гидроксииндолилуксусной кислоты к другим выводимым метаболитам триптофана достоверно ниже у абстинентных хронических алкоголиков [Thomson, McMillen, 1987]. Потребление алкоголя у неабстинентных алкоголиков достоверно снижается в ходе терапии ингибиторами катаболизма серотонина [Naranjo, 1986].
Достоверные корреляции обнаруживаются между алкоголизмом, депрессией, агрессивностью и уровнем свободного триптофана в плазме крови. Триптофановое число (отношение концентрации триптофана к суммарной концентрации шести аминокислот — фенилаланина, тирозина, валина, метионина, лейцина и изолейцина) достоверно уменьшается в ряду групп: контроль; алкоголики; алкоголики со склонностью к депрессии; алкоголики со склонностью к депрессии и агрессивному поведению. При этом для последней группы триптофановое число понижено по сравнению с контрольной группой более чем в два раза [Branchley et al, 1984]
Как один из ключевых ферментов в цепи синтеза серотонина, TD02 вносит свой вклад в формирование многих нарушений поведения, находящихся под полигенным контролем. Вместе с тем, влияние вариаций активности гена TD02 может существенно модифицироваться или даже устраняться другими генами, участвующими в процессах метаболизма серотонина, из которых достоверное влияние на многие поведенческие признаки оказывают гены триптофангидроксилазы, переносчика серотонина, серотонинового рецептора HTR2A [Comings et al, 1991]. Свой вклад вносят также гены дофаминэргической и норадреналиновой систем [Comings et al., 2000], что существенно осложняет анализ влияния конкретных полиморфных сайтов, обнаруживаемых в этих генах, на проявление полигенного признака, требуя применения специальных методик анализа и обширного первичного материала [Comings et al., 2000].
SNP в некодирующих последовательностях генов человека
Экстракты ядер клеток печени 3-4-месячных самцов крыс линии Спрэг-Доули готовили согласно методу Горски [Gorski et al.t 1986], в модификации Шапиро [Shapiro etal, 1988].
Все процедуры проводили на льду максимально быстро. Самца крысы забивали декапитацией. Печень промывали 50 мл перфузионного буфера (ЮмМ Hepes, рН 7.8; 25мМ КС1; 1мМ ЭДТА) через верхнюю полую вену. Затем 1-4 г печени измельчали ножницами на льду и гомогенизировали в двух объемах сахарозного буфера (ЮмМ Hepes рН 7.8; 25мМ КС1, 0,15мМ спермин, 0,5мМ спермидин, 1мМ ЭДТА, 2М сахароза, 10% глицерин). Гомогенат разбавляли двумя объёмами сахарозного буфера, наслаивали на подушку из сахарозного буфера и центрифугировали 30 мин. при 24000 оборотов/мин. при 0С (центрифуга L8-50, ротор SW-28).
Осадок ядер ресуспендировали в 4 мл лизирующего буфера (ЮмМ Hepes рН=7.8; ЮОмМ КС1; ЗмМ MgC12; 0,1 мМ ЭДТА; 1мМ DTT; 0,1 мМ PMSF; 10% глицерин). Затем при перемешивании добавляли 0,1 объема насыщенного при 4С (NR»)2S04 и выдерживали 15 мин. на льду при периодическом встряхивании. Хроматин осаждали центрифугированием при 32000 оборотов/мин. в течение 75 мин. при 0С (центрифуга L8-50, ротор SW-28). Белки супернатанта осаждали добавлением по частям сухого (NHtbSC из расчета 0,262 г/мл, аккуратно перемешивая 30 мин. на льду. Далее центрифугировали 20 мин. при 32000 оборотов/мин при 0С, ротор SW-50. Осадок растворяли в 1-2 мл диализного буфера (25мМ Hepes рН=7.8; 80 мМ КС1; 0,2мМ ЭДТА; 1мМ DTT; 0,2мМ EGTA; 10% глицерин). Диализ вели три раза по 45 мин. против 150мл диализного буфера. Полученный экстракт центрифугировали 1 мин 10.000 об/мин на центрифуге Eppendorf при 4С, супернатант расфасовывали в пробирки по ЮОмкл, хранили при 70С. Содержание белка в ядерном экстракте определяли спектрофотометрически по поглощению на 260нм и 280нм.
Мечение олигонуклеотидных зондов осуществлялось с помощью достройки выступающих З -концов фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I. 15 мкл реакционной смеси, содержавшей 300 нг олигонуклеотида, 1,5 мкл 10х буфера для мечения (500 мМ Трис-HCl рН 8.0, 100 мМ NaCl, 100 мМ MgCb, 1мМ дитиотрейтол, ЗмМ dGTP, ЗмМ dTTP, ЗмМ dCTP,), 2,5 единицы активности фрагмента Клёнова, 20 мкСі [a- P]dATP, оставляли на 5 мин. при комнатной температуре, после чего переносили в лед. Для оценки включения [a- PjdATP в ДНК 1 мкл реакционной смеси наносили на ДЕАЕ 81 бумагу, промывали 50 мл 0,5 М NaH2P04, после чего рассчитывали удельное включение на нг ДНК. Меченые олигонуклеотиды очищали от невключившейся [a- P]dATP электрофорезом в 8% неденатурирующем ПААГ, олигонуклеотид из геля извлекали электроэлюцией на бумагу DEAE 81. мкл соответствующего ядерного экстракта инкубировали с озвученной ДНК эритроцитов цыпленка (из расчета 1,3 мкг ДНК на 10 мкг суммарного белка) в течение 10 мин. на льду. После этого к пробам, содержащим 3 пмоль ДНК-пробы, меченой [ Р], добавляли 1-4 мкг. белка ядерного экстракта, в случае конкурентного анализа 250 пмоль соответствующего немеченого конкурентного олигонуклеотида, и доводили объем реакционной смеси до 16 мкл диализным буфером. Реакцию связывания проводили при комнатной температуре в течение 15 мин.
Антитела против факторов транскрипции YY1 или GATA6 (1мкл) прединкубировали с 4 мкг белка ядерного экстракта и ДНК эритроцитов цыпленка в течение 15 мин при 0С, далее реакция связывания проводилась аналогично.
Пробы наносили на 5,5% неденатурирующий ПААГ. Электрофорез проводили в 0,5х ТВЕ буфере при напряжении 10 V/см в течение 45 мин. - 1 часа в холодной комнате при 4 С в электрофоретической камере, обеспечивающей охлаждение стекла холодным буфером. После этого гель высушивали и экспонировали с рентгеновской плёнкой 3-5 дней.
Электрофорез по Лэммли (Остерман, 1981) белков ядерных экстрактов проводили следующим образом. К 6-12 мкл ядерного экстракта, содержащего 4 мкг белка, добавляли 10х буфер для нанесения (бОмМ Трис-HCl рН 6.8, 2% SDS, 10% глицерин, 1% Р-меркаптоэтанол, 0,02% бромфеноловый синий) и прогревали 5 мин. при 100 С, после чего образец наносили на 8% SDS-полиакриламидный гель. Электрофорез вели 2 часа при напряжении 10 V/CM. Белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану методом полусухого электропереноса: гель после электрофореза вымачивали в буфере для переноса (25мМ Трис, 190мМ глицин, 1% SDS, 20% метанол) 2 раза по 15 мин.; перенос вели 1 час при напряжении 2V/CM мембраны. Полосу мембраны, содержащую набор маркерных белков, отрезалали и прокрашивали красителем Ferry-Dye для контроля переноса. В случае использования окрашенных маркеров молекулярного веса эта полоса фотографировалась цифровой фотокамерой. Оставшуюся часть мембраны использовали для процедуры иммунодетекции с использованием набора для ECL-Вестерн-анализа. Для предотвращения неспецифического связывания проводили инкубацию при покачивании в 5% растворе блокирующего реагента в буфере TBS (20мМ Трис-HCl рН 7.6, 137мМ NaCl, 0,1% Tween-20) 1 час; блокирующий реагент отмывали буфером TBS 2 раза по 5 мин. и один раз 10 мин. Инкубацию с первичными антителами (разведение 1:1000) проводили при покачивании 1 час, антитела отмывали буфером TBS 2 раза по 5 мин. и один раз 10 мин. Инкубацию с коньюгатом "вторичные антитела -пероксидаза хрена" (разведения 1:5000, 1:8000, 1:10000, 1:15000, 1:20000) проводили при покачивании 1 час, антитела отмывались буфером TBS 2 раза по 5 мин. и один раз 10 мин. Мембрану переносили на стеклянную пластинку, смачивали необходимым количеством проявляющего реагента (0,1 мл/см ). После 1 мин. инкубации избыток реагента удаляли, мембрана накрывалась плёнкой "Саран" и экспонировалась в темноте с рентгеновской плёнкой со временем экспозиции 20, 30,45, 90, 200 сек. последовательно.
Определение активности триптофаноксигеназы и тирозинаминотрансферазы
Этот фактор присутствует в печени, лёгких и ряде других тканей эндодермального происхождения, и в печени является основным представителем данного семейства транскрипционных факторов [Laverriere et al, 1994]. Добавление антител против GATA6 к экстракту ядер печени приводит к значительному ослаблению комплекса 5 (Рис. 10) в экспериментах по задержке ДНК-пробы в геле. Следовательно, комплекс 5 содержит этот транскрипционный фактор. Аналогичная картина наблюдается и при использовании экстракта ядер ткани лёгкого (данные не приведены).
Для доказательства того, что наблюдаемые в экспериментах по задержке ДНК-пробы в геле эффекты обусловлены полноразмерным транскрипционным фактором GATA6, был выполнен Вестерн-блот-анализ с последующей ECL-детекцией. Для нанесения на SDS-ПААГ брали аликвоты экстрактов ядер печени и лёгкого крысы, содержащие 2 мкг. суммарного белка. Использовались разведения первичных антител 1:1000, вторичных антител 1:10000 и 1:15000, 1:20000; оптимальным разведением оказалось 1:20000. В качестве маркёра молекулярных весов использовался набор предварительно окрашенных белков Benchmark Prestained Protein Ladder. После перенесения на нитроцеллюлозную мембрану дорожка, содержащая маркёр молекулярных весов, фотографировалась цифровой фотокамерой для последующего определения молекулярных весов полос в картине ECL-детекции. Результаты Вестерн-блот- анализа приведены на Рис.11.
Белки GATA4, GATA5, GATA6 имеют молекулярные веса 42, 44 и 45 Ша соответственно [Molkentin, 2000]. Основная полоса (-45 kDa) соответствует подвижности белка GATA6. Наличие дополнительных полос в картине ECL-Western-блота, вероятнее всего, объясняется неспецифическим связыванием антител против GATA6 с белками GATA4 и GATA5 GATA6
Связывание белков экстракта ядер клеток печени с олигонуклеотидом М2 в присутствии антител против GATA6 и конкурентных олигонуклеотидов. 1 - свободный зонд; 2 - связывание с экстрактом ядер печени крысы; 3 - то же в присутствии 80х избытка олигонуклеотида API; 4 - то же в присутствии 80х избытка олигонуклеотида GATA; 5 - связывание с ядерным экстрактом, обработанным антителами против транскрипционного фактора GATA6. Стрелкой показана подвижность комплекса, соответствующего транскрипционному фактору GATA6. GATA6 64
Результат Вестерн-блот-анализа экстрактов ядер клеток лёгкого и печени крысы на транскрипционный фактор GATA6. I — экстракт ядер лёгкого, 2.5 мкг. суммарного белка; 2 — экстракт ядер печени, 2.5 мкг. суммарного белка; 3 — маркёр молекулярных весов Benchmark Prestained Protein Ladder. 1,2— результат ECL-детекции, разведение вторичных антител 1:20000. 3 Фотография полосы нитроцеллюлозной мембраны, содержащая предварительно окрашенные маркёры молекулярных весов после электропереноса. Полоса, соответствующая фактору GATA6, отмечена стрелкой. (подвижность GATA4 в SDS-ПААГ соответствует 48 кДа [Arceci et ai, 1993], поскольку эти белки имеют достаточно сходный С-концевой район, на который были произведены антитела, и интенсивность этих полос сравнительно невысока.
Таким образом, наблюдаемые факты позволяют нам сделать вывод о том, что с районом 651 - 680 п.о. интрона 6 гена TD02 человека связываются полноразмерные транскрипционные факторы YY1 и GATA6.
Для всех изученных аллелей общим является связывание с ними HMG-подобных белков, которые являются обычным и важным компонентом композиционных регуляторных элементов и участков с нарушенной нуклеосомной укладкой [Ross et al.y 2001]. В случае наиболее распространённого в популяции человека аллеля WT происходит связывание с данным районом транскрипционного фактора YY1, являющегося либо репрессором, либо активатором транскрипции в зависимости от транскрипционного контекста и взаимодействующих с нам кофакторов [Shi at al.y 1997]. В случае мононуклеотидной замены G-»A в позиции 663 п.н., ассоциированной с синдромом Туретта и склонностью к тяжёлой депрессии, мы обнаружили разрушение сайта связывания фактора YY1 и появление сайта связывания одного или двух не идентифицированных нами белков. Замена G-»T в позиции 666 п.н., негативно ассоциированная с алкоголизмом, приводит к резкому ослаблению связывания YY1 и появлению сильного сайта связывания другого транскрипционного фактора — GATA6. Подобные изменения в спектре связывающихся транскрипционных факторов (репрессор на активатор) могут существенно сказываться на экспрессии гена TD02 и, как следствие, на всём последующем пути синтеза нейромедиатора серотонина в мозге.
Поскольку YY1 играет важную роль в процессах репрессии генов в ходе дифференцировки тканей [Shnvastava, Calame, 1994], эффекты данных мутаций могут проявляться не только в изменении уровня экспрессии гена TD02 во взрослом состоянии, но и в возникновении и фиксации определённых нарушений в ходе развития нервной системы. Возникновение в случае одной из мутаций сайта связывания факторов семейства GATA вдвойне интересно в данном аспекте, поскольку доказано взаимодействие факторов GATA1 и YY1 в процессе репрессии гена "-глобина в ходе дифференцировки эритроидных тканей [Raich et ai, 1995]. Другим путём влияния факторов YY1 и GATA на процессы транскрипции является их участие в процессах ремоделирования хроматина [Wheil et al.y 2003; Zhou, Ouyang, 2003].
Транскрипционные факторы YY1 и GATA являются не только факторами транскрипции в традиционном значении этого слова, но также важными компонентами ядерного матрикса, и в этом качестве способны оказывать серьёзное опосредованное действие на процессы активации/репрессии транскрипции. Для ряда генов, изменяющих свою экспрессию в ходе дифференцировки, показано изменение петлевой организации хроматина с участием этих факторов. Например, промотор гена гистона Н5 образует петлю за счет взаимодействия транскрипционных факторов YY1 и H4UA3 с ядерным матриксом, и эта петля открепляется от матрикса при переходе клетки в состояние покоя [Сьяксте, Сьяксте, 2001]. Промотор гена остеокальцина связывается с ядерным матриксом в трёх точках с помощью факторов транскрипции YY1 и AML только после прекращения пролиферации и начала дифференцировки [Stein et al.y 1995]. Откреплением от ядерного матрикса факторов транскрипции GATA и NF1 сопровождается переход эритроцитов от пролиферации к дифференцировке [Hoffman et ai, 1989]. Таким образом, наблюдаемое нами изменение спектра связывания транскрипционных факторов с районом изученных нами мутаций может
Идентификация белков, связывающихся с изучаемым районом
Связывание белков экстракта ядер клеток печени с олигонуклеотидами, соответствующими сайту полиморфизма в позиции 629 п.н. от начала интрона. 1 — подвижность свободного зонда; 2 — олигонуклеотид С629; 3 - олигонуклеотид BD629. Использовано 4 мкг суммарного белка экстракта ядер клеток печени крысы. (Рис. 18) позволили идентифицировать белок, связывающийся с олигонуклеотидами С629, С974 и BD974. На Рис. 18 видно значительное ослабление комплексов олигонуклеотид/белок в присутствии антител против транскрипционного фактора GATA6. Это доказывает, что именно транскрипционный фактор GATA6 является главным компонентом комплексов связывания с перечисленными олигонуклеотидами.
Таким образом, мы видим, что в случае трёх из шести полиморфизмов в интроне 6 гена 77)02, отличающих линии СВА и C57BL, наблюдается резкое изменение спектра связывающихся с данными районами ядерных белков. Замена С—»Т в позиции 15 п.н. у линии C57BL создаёт сильный сайт связывания какого-то не идентифицированного нами белка. В случае полиморфных сайтов в позициях 629 и 974 п.н. от начала интрона 6 у линии СВА имеются хорошие сайты связывания транскрипционного фактора GATA6. У линии C57BL этот сайт либо полностью разрушен (G/T в позиции 629), либо существенно ослаблен (G/A в позиции 974). Однако у линии мышей DBA/2 SNP в позициях 629 и 974 п.н. (и, соответственно, спектр связывающихся с данным районом белков аналогичны таковым у линии C57BL, при этом предрасположенности к алкоголизму у линии DBA не наблюдается.
Это вызвало сомнения в связи уровня активности ТД02 в печени и предрасположенности к алкоголизму на модели мышей C57BL и, чтобы их разрешить, было выполнено исследование предрасположенности к употреблению алкоголя, активности фермента TD02 и нуклеотидной последовательности района интрона 6 гена TD02 у линии мышей CC57BR, полученной от скрещивания мышей BALB и C57BL [Monroe, 1968], в сравнении с родительскими линиями.
Мыши линии CC57BR, как оказалось, обладают повышенной C974 BD974 Пік.J" Связывание белков экстракта ядер клеток печени с олигонуклеотидами С974, BD974 и BD629 в присутствии антител к транскрипционным факторам.
Линии 1-4: олигонуклеотид С974, 5-7: олигонуклеотид BD974, 8-11: олигонуклеотид BD629. 1, 8 — подвижность свободного зонда; 2, 5, 9 — связывание с 4 мкг белка экстракта ядер крысы, 3, 6, 10 — то же в присутствии антител против YY1. 4, 7, II - то же в присутствии антител против GATA6.
Стрелкой показано положение комплекса, соответствующего транскрипционному фактору GATA6. склонностью к потреблению алкоголя в условиях свободного выбора в отличие от мышей BALB (Табл. 2), то есть унаследовали этот признак от родительской линии C57BL. При этом базальная активность TD02 в печени у мышей BALB, избегающих употребления алкоголя, так же высока, как и у предпочитающих алкоголь мышей C57BL и CC57BR, а индуцированная активность TD02 достоверно выше, чем у CC57BR [Каледин и др, 2003].
Уровень потребления алкоголя и активность TD02 в печени мышей линий C57BL, CC57BR и BALB. Показатель C57BL CC57BR BALB Потребление раствора этанола, % от общего количества жидкости (п = 10) 49 ± 5,7 42 ± 3,2 28 ±3,2 Активность TD02, нмоль/мг белка/час без индукции (п = 4) глюкокортикоидная индукция (п = 7) 23,7±2,4 44,4 ± 3,2 25,0 ±1,9 41,8 ±1,5 24,1 ± 1,6 47,4 ±1,5
Достоверность межлинейных различий: р 0,05 по сравнению с BALB; р 0,01 по сравнению с BALB; п - число мышей в группе
При исследовании нуклеотидных последовательностей интрона 6 гена TD02 мышей линий BALB и CC57BR было обнаружено, что эти последовательности (и, соответственно, спектр связывающихся с районами SNP ядерных белков) оказались полностью идентичными у мышей BALB, CC57BR и DBA/2, хотя линия CC57BR предрасположена к развитию алкоголизма, а линии BALB и DBA/2 - нет.
Таким образом, можно сделать вывод, что обнаруженные нами SNP в интроне 6 у исследованных пяти линий мышей не имеют видимой связи с предрасположенностью/устойчивостью к развитию алкоголизма и уровнем базальной активности фермента TD02 в печени. Более того, высокий уровень активности TD02 в печени у мышей C57BL, возможно, не является основным фактором, определяющим предрасположенность к развитию алкоголизма, хотя ранее [Badawy et ah, 1989] именно эта причина (повышенный уровень активности TD02 и, как следствие, пониженный уровень циркулирующего в крови триптофана и пониженная концентрация серотонина в мозге) называлась основной.
Тем не менее, полученные нами на нескольких линиях мышей результаты не ставят под сомнение данные о том, что ген TD02 является одним из важных кандидатных генов в генетике поведения человека в целом и развитии предрасположенности к алкоголизму в частности. Скорее, они свидетельствуют о том, что у линии мышей C57BL, ранее считавшейся весьма удачной моделью предрасположенности к алкоголизму, связанной с изменением уровня экспрессии TD02 [Naranjo et ah, 1986; Badawy et ah, 1993], эта предрасположенность реализуется несколько иными путями. Генетическая предрасположенность к алкоголизму является полигенным признаком, при этом считается, что у человека в её формировании обнаруживается аддитивное влияние примерно 4-6 генов [Propping et ah, 1993]. Кроме того, алкогольная зависимость у человека разделяется по целому спектру диагностических признаков на алкоголизм типа I и II [Cloninger, 1987], и только на развитие алкоголизма типа II оказывают заметное влияние дефекты в системе метаболизма серотонина [Comings, 1993]. Как и для большинства полигенных признаков, для наследственной склонности к алкоголизму возможно аддитивное/нейтрализующее друг друга влияние разных генов. Возможность такой ситуации при анализе наследственной предрасположенности к алкоголизму у исследованных нами линий мышей также нельзя исключить.
