Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Молекулярно-генетическое изучение наследственных моторно-сенсорных нейропатий I типа в Республике Башкортостан Багаутдинова Эльвира Газинуровна

Молекулярно-генетическое изучение наследственных моторно-сенсорных нейропатий I типа в Республике Башкортостан
<
Молекулярно-генетическое изучение наследственных моторно-сенсорных нейропатий I типа в Республике Башкортостан Молекулярно-генетическое изучение наследственных моторно-сенсорных нейропатий I типа в Республике Башкортостан Молекулярно-генетическое изучение наследственных моторно-сенсорных нейропатий I типа в Республике Башкортостан Молекулярно-генетическое изучение наследственных моторно-сенсорных нейропатий I типа в Республике Башкортостан Молекулярно-генетическое изучение наследственных моторно-сенсорных нейропатий I типа в Республике Башкортостан Молекулярно-генетическое изучение наследственных моторно-сенсорных нейропатий I типа в Республике Башкортостан Молекулярно-генетическое изучение наследственных моторно-сенсорных нейропатий I типа в Республике Башкортостан Молекулярно-генетическое изучение наследственных моторно-сенсорных нейропатий I типа в Республике Башкортостан Молекулярно-генетическое изучение наследственных моторно-сенсорных нейропатий I типа в Республике Башкортостан Молекулярно-генетическое изучение наследственных моторно-сенсорных нейропатий I типа в Республике Башкортостан Молекулярно-генетическое изучение наследственных моторно-сенсорных нейропатий I типа в Республике Башкортостан Молекулярно-генетическое изучение наследственных моторно-сенсорных нейропатий I типа в Республике Башкортостан
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Багаутдинова Эльвира Газинуровна. Молекулярно-генетическое изучение наследственных моторно-сенсорных нейропатий I типа в Республике Башкортостан : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.15 / Багаутдинова Эльвира Газинуровна; [Место защиты: Ин-т биохимии и генетики Уфим. науч. центра РАН].- Уфа, 2007.- 116 с.: ил. РГБ ОД, 61 07-3/1636

Содержание к диссертации

Введение

Глава I. Обзор литературы 11

1.1. Клиническая характеристика и эпидемиология наследственных моторно-сенсорных нейропатий 11

1.2. Молекулярно-генетические основы НМСН 16

1.2.1. Наследственные моторно-сенсорные нейропатий первого типа (миелинопатии) 20

1.2.2. Наследственные моторно-сенсорные нейропатий второго типа (аксонопатии) 32

Глава II. Материалы и методы 37

П. 1. Материал для исследования 37

П.2. Методы исследования 38

П.2.1. Выделение геномной ДНК 38

И.2.2. Идентификация дупликации гена РМР22 39

П.2.3. Исследование генов РМР22, GJB1 (Сх32), MPZn EGR2 . 40

11.2.4. Анализ полиморфных ДНК-локусов, сцепленных с геном GJB1 (Сх32) 44

11.2.5. SSCP-анализ 45

П.2.6. Определение нуклеотидной последовательности 46

И.З. Рестрикционный анализ 46

П.4. Статистическая обработка результатов 47

Глава III. Результаты исследования и обсуждение 49

III. 1. Определение частоты дупликации/делеции гена РМР22 в

выборке больных НМСН из Башкортостана 49

III. 1.2. Анализ полиморфизма ДНК-локусов 4А, 9А и 9В, сцепленных с геном РМР22, в некоторых этнических группах Башкортостана 51

III.2. Поиск мутаций и полиморфизмов в генах РМР22, GJB1 (Сх32), MPZnEGR2 59

Ш.2.1. Анализ гена РМР22 60

Ш.2.2. Анализ гена GJB1 (Сх32) 61

Ш.2.3. Анализ генов MPZ и EGR2 76

Ш.З. Анализ ассоциаций мутаций в гене GJB1 (Сх32) с гаплотипами по полиморфным локусам 79

Ш.4. Алгоритм ДНК-диагностики НМСН I типа 84

Заключение 86

Выводы 93

Список литературы 95

Введение к работе

Актуальность исследования

Наследственные моторно-сенсорные нейропатии (НМСН) или болезнь Шарко-Мари-Тута (ШМТ) - это генетически и клинически гетерогенная группа заболеваний периферической нервной системы, поражающих миелиновые оболочки, аксоны двигательных и чувствительных волокон, а также спинномозговых корешков. НМСН являются одними из самых распространенных наследственных болезней нервной системы человека. В среднем, в мире их распространенность составляет 10,0 на 100000 населения, варьируя от 0,1 до 41,0 на 100000 населения, но большинство показателей находится в пределах 4,0-15,0 на 100000 [Руденская Г. Е., 1998; Emery А., 1991; Ionasescu V., 1995]. В последние десятилетия и в нашей стране активно ведутся работы по изучению распространенности НМСН. Согласно этим данным, чаще заболевание встречается в Воронежской области (12,5 на 100000), в Самарской (11,0 на 100000) и Амурской (10,7 на 100000) областях [Федотов В. П., 2002; Вяткина С. Я., 1991; Хоменко Е. И., 1982, 1983]. В Башкортостане распространенность всех типов НМСН составляет 10,3 на 100000 населения [Крупина Н. Б. с соавт., 2006].

В зависимости от характера поражения нервных волокон, НМСН
подразделяются на два основных типа - димиелинезирующий (НМСН I) и
аксональный (НМСН II), клиническая дифференциация которых возможна
только на основе электронейромиогрфического исследования, выявляющего
скорость проведения импульса (СПИ) по срединному нерву. К каждому из этих
типов заболевания относится целый ряд генетически различных форм
заболевания. В настоящее время картировано более 25 генов, ответственных за
развитие НМСН, 22 из которых идентифицированы

[]. Известные формы НМСН, несмотря на существование определенных особенностей, имеют много общих как клинических, так и электронейромиографических признаков, что

значительно затрудняет их диагностику, в том числе дифференциальную. Поэтому самым точным методом диагностики НМСН, становящимся все более доступным в наше время, является ДНК-анализ, позволяющий проводить не только дифференциальную, но также пренатальную и пресимптоматическую диагностику в отягощенных НМСН семьях. При этом, молекулярно-генетическое исследование НМСН является и основой изучения патогенеза данной группы заболеваний.

Большинство из известных генов, мутации в которых приводят к развитию НМСН, кодируют белки, непосредственно участвующие в структурной и функциональной организации миелина периферических нервных волокон. Согласно литературным данным, в странах Европы и США наиболее распространена НМСН I типа, среди которого наиболее частой является форма НМСН 1А (СМТ1А). Генетической причиной развития данной формы является дупликация 1,5 Mb в хромосомной области 17р 11.2-12, включающей ген белка периферического миелина (РМР22) [Timmerman V. et al., 1990, Patel P. et al., 1990, Lebo Y. et al., 1992]. Наряду с дупликацией/делецией, в гене РМР22 обнаружено более 60 точковых мутаций, приводящих к развитию НМСН. Второй по частоте считается Х-сцепленная форма НМСН IX, обусловленная мутациями в гене коннексина 32 (Сх32, GJB1) - структурного белка межклеточных каналов, обеспечивающих факультативный транспорт ионов и небольших молекул между соседними слоями миелина. Нормальное функционирование щелевого соединения между соседними шванновскими клетками обеспечивает сальтаторный характер проведения возбуждения по миелиновой оболочке периферических нервов [Bruzzone R. et al.,1996]. В настоящее время описано 296 различных мутаций гена GJB1, спектр и частота которых различны в разных популяциях [CMTMutations]. Другим важным геном, мутации в котором приводят к развитию целого ряда форм НМСН, является ген MPZ (myelin protein zero, Ро), кодирующий основной белок миелина, составляющий 50% всех белков миелина периферической нервной системы. Основной функцией белка является

7 сближение соседних пластин миелиновых структур, что обеспечивает их стабилизацию и компактизацию. В гене MPZ описано уже более 120 мутаций, обнаруженных в разных регионах мира. Более редкой, но все же имеющей место причиной НМСНI типа, является нарушение структуры гена EGR2 (early growth response gene - 2). Считается, что этот ген экспрессируется в раннем эмбриогенезе и является транскрипционным фактором для, так называемых, поздних миелиновых генов, таких как MPZ и МБР (myelin basic protein). В настоящее время в гене EGR2 описано только 9 мутаций и один полиморфизм. Следует отметить, что мутации в выше указанных генах могут приводить к различным формам НМСН, относящимся не только к НМСН I типа, но также к НМСН II и промежуточного типов. Поэтому, при проведении молекулярно-генетического изучения данной группы заболеваний в определенном регионе, как правило, в первую очередь исследуются именно эти гены.

В Республике Башкортостан (РБ) эпидемиологическое и молекулярно-генетическое исследование НМСН начато в последние годы: установлена территориальная и этническая неравномерность распространения заболевания, преобладание по частоте НМСН I типа. Однако, молекулярно-генетический анализ включал только определение дупликации/делеции гена РМР22, показавшее несколько более низкий уровень частоты данной мутации в РБ (45% среди НМСН І) [Крупина Н. Б. с соавт., 2006], по сравнению с другими регионами России. В связи с этим, актуальным является продолжение исследования роли ряда известных генов в развитии НМСН у больных из РБ, являющееся основой для разработки наиболее оптимального для региона алгоритма ДНК-диагностики данной группы заболеваний.

В настоящее время банк ДНК больных НМСН из РБ расширен, что требует и продолжения определения дупликации/делеции гена РМР22. Кроме того, следует отметить, что при проведении идентификации данной мутации методом регистрации дозы гена с помощью двух микросателлитных маркеров, в ряде случаев возникала необходимость анализа полиморфизма дополнительных ДНК-локусов. Это определило актуальность подбора

8 высокополиморфных маркеров, сцепленных с геном РМР22, удобных для ПЦР-анализа и характеризующихся высокой степенью гетерозиготности среди населения исследуемого региона.

Целью исследования явился анализ структурных особенностей генов РМР22, Сх32, MPZ, EGR2 у больных с наследственными моторно-сенсорными неиропатиями из Башкортостана и разработка оптимального для региона алгоритма ДНК - диагностики данной группы заболеваний.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

  1. Провести поиск мутаций и полиморфных вариантов генов РМР22, Сх32, MPZ и EGR2 у больных с НМСН из РБ и в контрольной выборке.

  2. У больных с выявленными мутациями определить гаплотипы по полиморфным локусам, маркирующие мутантные хромосомы.

  3. Охарактеризовать клинические особенности НМСН у больных с выявленными мутациями в исследованных генах.

  4. С целью оптимизации метода выявления дупликации/делеции гена РМР22 провести анализ полиморфизма трех сцепленных с геном минисателлитных ДНК - локусов в популяциях русских, башкир и татар - жителей Башкортостана.

  5. Разработать на основе полученных данных оптимальный для населения Республики Башкортостан алгоритм ДНК-диагностики НМСН.

9 Научная новизна

В результате проведенного исследования впервые в Республике Башкортостан изучены спектр и частота мутаций в генах РМР22, GJB1 (Сх32), MPZ и EGR2 при НМСН I типа. Выявлено 4 различных мутации в гене GJB1, одна из которых Рго87А1а является частой в РБ (19,40% среди НМСН I типа), сцепленной с общим гаплотипом; мутация Thr86Ile, выявленная с частотой 1,49% среди НМСН I типа, ранее не описана. С целью оптимизации метода идентификации дупликации/делеции гена РМР22 проведен анализ полиморфизма трех сцепленных с геном микросателлитных локусов среди жителей РБ, показавший высокие показатели гетерозиготности и возможности их использования для диагностики данной мутации.

Научно-практическая значимость

Полученные данные позволяют расширить представление о молекулярно-генетических причинах развития НМСН в Башкортостане. На основе данных по спектру и частоте генетических вариантов НМСН разработан оптимальный для нашего региона алгоритм поиска мутаций у больных с НМСН I типа. Полученные результаты могут быть использованы для уточнения диагноза, а также позволяют проводить пренатальную ДНК-диагностику НМСН в семьях с идентифицированными мутациями. Результаты исследования могут быть использованы при чтении курсов медицинской генетики на биологических факультетах университетов, в медицинских ВУЗах и на курсах повышения квалификации медицинских работников.

10 Положения, выносимые на защиту

  1. Высокая частота распространения формы НМСН IA среди больных НМСН из Республики Башкортостан.

  2. Высокий уровень гетерозиготности трех микросателлитных локусов, сцепленных с геном РМР22, у жителей РБ и возможность их использования для диагностики дупликации/делеции данного гена.

  3. Спектр и частоты мутаций в генах РМР22, GJB1, MPZ и EGR2 у больных НМСН I типа из РБ. Впервые обнаружены мутации Thr86Ile (с.257С>Т) в гене GJB1 и полиморфизм Ser238Ser (с.714С>Т) в гене MPZ.

  4. Высокая частота мутации Рго87А1а в гене GJB1 среди больных НМСН I типа из РБ, связанная с эффектом основателя.

  5. Основные клинические характеристики больных НМСН I с выявленными мутациями в гене GJB1.

  6. Оптимальный для жителей РБ алгоритм молекулярно-генетического обследования больных НМСН I типа, основанный на анализе генов РМР22 и GJB1.

Молекулярно-генетические основы НМСН

Применение современных методов молекулярно-генетических исследований значительно расширило представления о причинах возникновения и механизмах развития заболевания. Это дает возможность, в свою очередь, создать подробную классификацию НМСН и точно диагностировать отдельные формы болезни [Young P. et al., 2003].

На сегодняшний день картировано 25 ДНК-локусов и идентифицировано более двадцати генов для различных типов НМСН (табл.1) [Щагина О. А. с соавт., 2005]. При этом, различные мутации одного и того же гена могут вызывать различные формы заболевания, различающиеся по типу наследования и по определенным клиническим проявлениям. Таким образом, в настоящее время выделяют 35 форм НМСН, среди которых по аутосомно-доминантному типу наследуются 23, по аутосомно-рецессивному - 9, 1 - Х-сцепленная доминатная и 2-Х-сцепленные рецессивные формы (табл.1).

Большинство из известных генов, мутации в которых приводят к развитию НМСН, кодируют белки, непосредственно участвующие в структурной и функциональной организации миелина периферических нервных волокон. На рисунке 1 представлена сложная система локализации и взаимодействия всех белков миелина. Их подразделяют на три группы. В первую группу входят белки, являющиеся основными компонентами миелина -РМР22, Ро (MPZ), Cx32/GJB1 и периаксин. Ко второй группе относят белки -регуляторы транскрипции генов миелина - EGR2/Krox20 и SOX10. Третья группа объединяет внутриклеточные белки шванновских клеток, которые, вероятно, вовлечены в синтез, транспорт и дегенерацию компонентов миелина. К ним относятся миотубуларин-связанный липид фосфатазы MTMR2, MTMR13/SBF2, SIMPLE, а также, возможно, динамин 2. Мутации фактора митохондриального деления GDAP1 вносят значительный вклад в участие митохондрий в процесс миелинизации или сохранности миелина, тогда как функции других генов, причастных к развитиСогласно литературным данным, в странах Европы и США наиболее распространена НМСН I типа, среди которого наиболее частой является форма НМСН 1А (СМТ1А). Генетической причиной развития данной формы является дупликация 1,5 Mb в хромосомной области 17р11.2-12, включающей ген белка периферического миелина (РМР22) [Timmerman V. et al., 1990, Patel P. et al., 1990, Lebo R. et al., 1992]. Хромосомная область 17pl 1.2 является генетически нестабильной - горячей точкой рекомбинации. Это обусловлено наличием фланкирующих данный хромосомный регион высокогомологичных повторяющихся последовательностей ДНК, между которыми в мейозе может происходить неравный кроссинговер как результат спаривания ложно ориентированных друг против друга теломерного и центромерного повторов. В результате образуются две хромосомы с перестройками: одна несет дупликацию, представляющую собой простой тандемный повтор, а другая -реципрокную ей делецию (рис. 2) [Lupski J. et al., 1991; Valentijn L. et al., 1992; Pentao L. et al, 1992; Chance P. et al., 1994]. Делеция данной хромосомной области обусловливает возникновение нейропатии со склонностью к параличам от сдавления (ННСПС). ю данного заболевания, включая NDRG1, KIAA1985 и YARS все еще до конца не выяснены.

Наследственные моторно-сенсорные нейропатий первого типа (миелинопатии)

Частота дупликации гена РМР22 варьирует в разных популяциях: наиболее высокие ее показатели зафиксированы в европейских популяциях, где они составляют 70-80% всех случаев НМСН I типа [Raeymaekers P. et al., 1991; Nelis Е. et al., 1996], несколько ниже они в Италии - 57,6% [Mostacciuolo М. et al., 1995, 2001], России -53,7% [Mersiyanova I. et al., 2000], Корее - 53,6% [Choi В. et al., 2004], один из самых низких показателей частоты данной мутации установлен в Японии - 31,2% [Ikegami Т. et al., 1997]. Ранее нами было установлено, что в Республике Башкортостан частота дупликации гена РМР22 составляет 26,0% от всех случаев НМСН без дифференциации на типы заболевания и 45,0% от НМСН I типа [Крупина Н. Б. с соавт., 2006].

Как уже было сказано, наряду с дупликацией/делецией, в гене РМР22 обнаружены и точковые мутации, приводящие к развитию НМСН. К настоящему моменту их описано более 60, среди которых - миссенс, нонсенс мутации, мелкие делеции и мутации сайта сплайсинга [http://www.hgrad.cf.ac.uk]. Возникновение признаков заболевания при наличии точковых мутаций в гене связано с нарушением процессов деградации шванновских клеток и их включения в компактный миелин. Миссенс мутации повреждают гидрофобную часть белка, что ведет к развитию заболевания с тяжелыми клиническими проявлениями [Berger P. et al., 2006]. Некоторые из них приводят к развитию синдрома Дежерина-Сотта. Описание больных с клиническими проявлениями наследственной нейропатии Дежерина-Сотта и точковыми мутациями в гене РМР 22 впервые сделано Roa с соавт. в 1993 году [Roa В. В. et al., 1993]. В отдельную форму выделена СМТ1Е, обусловленная двумя мутациями в гене РМР22 - А67Р и W28R, - характеризующаяся сочетанием классических клинических признаков ШМТ с нейросенсорной тугоухостью [Kovach М. J. et al., 1999; Boerkoel С. F. et al., 2002].

Поскольку НМСН IA, вызванная дупликацией гена РМР22, это одни из самых частых вариантов наследственных нейропатии, при проведении ДНК-диагностики у больных с клиническим диагнозом НМСН первоочередной задачей является определение данной мутации. На сегодняшний день для идентификации дупликации/делеции гена РМР22 используется ряд методов: блот-гибридизация по Саузерну, флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), гель-пульсирующий электрофорез, полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ), анализ полиморфизма коротких тандемных повторов (STRs) и полимеразная цепная реакция в реальном времени [Latour P. et al., 2001; Kim S. et al., 2003]. Каждый из методов имеет как преимущества, так и недостатки. Так, например, методы гибридизации по Саузерну и гель-пульсирующего электрофореза являются достаточно дорогостоящими, трудоемкими и длительными процессами. Применение ПЦР в реальном времени является неоправданно дорогостоящим, требующим высокой степени оптимизации проведения реакции, а ПДРФ-анализ дает неоднозначные результаты, трудно поддающиеся трактовке, еще более усложняя диагностику [Kashork et al., 2003]. Поэтому наиболее удобным методом диагностики дупликации/делеции гена РМР22 все же можно считать регистрацию дозы аллелей полиморфных микро- или минисателлитных ДНК-локусов, расположенных внутригенно или рядом с геном. Это наиболее дешевый, быстрый и простой в исполнении метод. Для получения достоверного результата часто бывает достаточно использования двух - трех таких полиморфных локусов, характеризующихся высоким уровнем гетерозиготности в популяции. Чем выше степень гетерозиготности STR или VNTR локуса, тем меньше вероятность наличия гомозиготного состояния аллелей, затрудняющего интерпретацию результата (в частности, гомозиготу по двум локусам можно ошибочно принять за делецию гена, либо двойная доза одного из аллелей может быть трудно различима из-за излишнего количества нанесенного на электрофорез продукта амплификации). При выборе между STR и VNTR локусами безусловное предпочтение отдается VNTR - тетра-, пентануклеотидным последовательностям, поскольку при использовании микросателлитных маркеров (чаще всего СА-повторов) ложные бэнды, образуемые в результате отставания полимеразы, могут привести к неправильной интерпретации дозы различных аллелей, что усложняет постановку точного диагноза. Как уже было сказано, ранее нами была определена частота дупликации/делеции гена РМР22 у больных с НМСН из Республики Башкортостан. Данное исследование было проведено с использованием набора реактивов «CMT-dup» (производства ООО «Центр Молекулярной Генетики» г.Москва) для идентификации аллелей двух минисателлитных ДНК-локусов. В отдельных случаях идентификация дупликации и в одном случае - делеции гена по необходимости была дополнительно уточнена с помощью трех минисателлитных локусов, предложенных для этих же целей Latour Р. с соавторами, (2001). Учитывая относительную дороговизну коммерческого набора «CMT-dup», а также потребность в дополнительных информативных маркерах, мы посчитали актуальным исследование полиморфизма данных трех локусов (4А, 9А, 9В) в этнических группах русских, башкир и татар, проживающих в РБ, с целью определения возможности дальнейшего использования их для идентификации дупликации/делеции гена РМР22 у больных НМСН.

Идентификация дупликации гена РМР22

ДНК выделяли из периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции из цельной венозной крови [Mathew С. С, 1984]. Кровь набирали в пробирки с консервантом (глюгицир) в соотношении 4:1, тщательно перемешивали и хранили при температуре 4С не более одной недели.

Для выделения ДНК к 5 мл крови добавляли 30 мл лизирующего буфера, содержащего 320мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5мМ MgC , ЮмМ трис-НС1, рН 7,6. Полученную смесь перемешивали и центрифугировали при 4С, 4000 об./мин. в течение 20 минут. Надосадочную жидкость сливали, к осадку добавляли 20 мл лизирующего буфера и центрифугировали при 4С, 4000 об./мин. в течение 10 минут. Далее надосадочную жидкость вновь сливали, к осадку добавляли 800 мкл буфера, содержащего25 мМ ЭДТА, рН 8,0 и 75 мМ NaCl, ресуспензировали и переносили полученный раствор в двухмиллилитровые стерильные пластиковые пробирки. Туда же добавляли 40 мкл 10% SDS, 20 мкл протеиназы К (10мг/мл) и инкубировали образец при 37С в течение 16 часов. После этого последовательно проводили экстракцию ДНК растворами забуференного фенола (200 мкл меркаптоэтанола на 50 мл фенола -Трис-HCI, рН 7,8) объемом ЮООмкл, фенола (500мкл) и хлороформа -изоамилового спирта (29:1) объёмом 500 мкл, хлороформа-изоамилового спирта (ЮООмкл) с плавным перемешиванием на ротаторе в течение 10 мин., центрифугированием при 10000 об./мин. в течение 10 минут и отбором водной фазы после каждого этапа. ДНК осаждали из раствора в стеклянных плоскодонных конических колбах объёмом 50 мл 96% раствором охлажденного этанола в соотношении 1:3. Сформированную ДНК промывали 70% раствором этилового спирта, подсушивали на воздухе, растворяли в деионизированной воде и хранили при -20С. Выделенную ДНК использовали для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК, рестрикционного анализа, SSCP анализа (анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК) и секвенирования.

Для идентификации дупликации гена РМР22 в представленной выборке больных применялась мультиплексная ПНР с использованием двух минисателлитных ДНК-локусов, содержащих пента- и тетрануклеотидные повторы. Анализ проводился с помощью набора реактивов «CMT-dup», выпускаемого ООО «Центр Молекулярной Генетики» (г. Москва), согласно прилагаемой инструкции. Результаты реакции оценивались путем проведения вертикального электрофореза в 8% полиакриламидном геле (ПААГ) (соотношение акриламида и метиленбисакриламида - 29:1,3). Электрофорез проводили в 1 ХТБЕ буфере (0,089 М трис-НС1; 0,089 М борная кислота; 0,002 М ЭДТА, рН=8,0). Перед нанесением на гель пробы смешивали в соотношении 5:1 с краской, содержащей 0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола и 15% фикола.

По окончании электрофореза гель окрашивали раствором бромистого этидия (0,1мкг/мл) в течение 15 мин с последующей идентификацией аллелей исследуемых ДНК-локусов в проходящем ультрафиолетовом свете.

Документирование результатов электрофореза проводили с использованием видеосистемы «Geldokulant» (Франция).

Анализ полиморфизма трех внутригенных минисателлитных ДНК -локусов, проведенный для оптимизации методов выявления дупликации/делеции гена РМР22, проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПНР) синтеза ДНК. Для амплификации фрагментов были использованы праймеры, предложенные P. Latour с соавторами (табл. 2) [Latour P. Et al., 2001]. Реакция была выполнена в 25 мкл общего объема смеси, содержащей 67 мМ трис-HCl (рН 8,8), 16,6 мМ (NH4)2 S04,, 1,5мМ MgCl2, 0,01% Tween-20, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу ДНК-полимеразы. Для каждой пары праймеров нами были индивидуально подобраны температура отжига и режим амплификации (табл. 2).

Результаты амплификации оценивались путем проведения вертикального электрофореза в 8% полиакриламидном геле (исходное соотношение акриламида и метиленбисакриламида 29:1,3) при напряжении 300В в течение четырех часов. В качестве электрофорезного буфера использовали IxTBE (трис-боратный буфер).

По окончании электрофореза гель окрашивали раствором бромистого этидия (0,1мкг/мл) в течение 15 минут и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете. Размеры аллелей определяли путем одновременного электрофореза с ДНК фага X, гидролизированного рестриктазой Pst I.

Для анализа исследуемых генов использовались методы полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК и анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (SSCP - single strand conformation polymorphism) с последующим секвенированием.

ПЦР производилась на амплификаторе "Терцик" производства компании «ДНК-технология» с использованием ДНК-полимеразы Thermus aquaticus производства фирмы «Силекс».

Для анализа спектра мутаций гена GJB1 (Сх32) амплификация трех фрагментов кодирующего региона проводилась с использованием праймеров, последовательности которых были предложены Bergoffen J. с соавторами (1993) (табл.3).

Анализ полиморфизма ДНК-локусов 4А, 9А и 9В, сцепленных с геном РМР22, в некоторых этнических группах Башкортостана

На сегодняшний день наиболее дешевым, быстрым и простым в исполнении методом детекции дупликации/делеции гена РМР22 является регистрация дозы аллелей полиморфных микро- или минисателлитных (VNTR) ДНК-локусов, расположенных внутригенно или рядом с геном. При этом, важной характеристикой используемых в этих целях полиморфных маркеров является их гетерозиготность в популяциях. Чем выше степень гетерозиготности STR или VNTR локуса, тем меньше вероятность наличия гомозиготного состояния аллелей, затрудняющего интерпретацию результата. Наиболее удобными полиморфными маркерами являются тетра- и пента-нуклеотидные последовательности ДНК, которые легко разделяются при электрофорезе, не образуя ложных «бэндов», движущихся в геле рядом с основными аллелями.

С целью оптимизации метода идентификации дупликации/делеции гена РМР22 был проведен анализ полиморфизма трех STR - локусов, описанных в работе Latour с соавторами [Latour P. et al., 2001], в выборках здоровых доноров из Башкортостана, представляющих три этнические группы - русских, башкир и татар.

Для разрешения проблем с идентификацией дупликации гена РМР22, Philippe Latour с соавторами проанализировали десять ДНК-локусов, содержащих высокополиморфные тандемные повторы, расположенные в дуплицируемой области гена РМР22. В результате, из десяти ДНК-локусов в качестве маркеров было предложено использовать три - 4А, 9А и 9В. На рисунке 4 представлено схематическое расположение изученных авторами ДНК-локусов относительно гена РМР22. Они захватывают область размером в 0,55 Mb в центре дупликации. Один из маркеров, 4А, локализован непосредственно в гене РМР22, в его первом интроне, на 3500 п.о. выше (дистальнее) экзона второго и является микросателлитом с повторяющейся мономерной единицей,

По данному локусу в выборках доноров русской и татарской этнической принадлежности выявлено по 6 аллельных вариантов, в выборке башкир - 8. Во всех этнических группах наиболее часто встречаются четыре аллельных варианта - 2, 3, 4 и 5, их частота варьирует в пределах 16-32% (собственное обозначение аллелей: 1 - аллель с минимальным размером фрагмента, 8-е максимальным). Аллель 7 встречается во всех группах с низкой частотой - от 0,7% среди татар до 1,6% среди русских и башкир. Аллели 1 и 8 выявлены только среди башкир с частотой 3% и 0,8%, соответственно. По распределению частот аллелей локуса 4А наблюдается определенная этническая неоднородность: выборка татар достоверно отличается от выборок русских и башкир (р 0,004).

Как уже было сказано, наиболее важным показателем полиморфного маркера, используемого в популяционно-генетических исследованиях, при анализе сцепления, а так же, как в данном случае - для определения дозы аллелей, - является его гетерозиготность. Для исследуемого ДНК-локуса 4А установленные значения гетерозиготности варьировали от 57% у русских до 66% у татар (табл. 8). Такие показатели не считаются высокими, т.к. существует множество полиморфных локусов, гетерозиготность которых может достигать более 80%). Однако, ввиду того, что 4 аллельных варианта распределены среди населения с частотой, не превышающей 40%, и аллели легко идентифицируются методом ПЦР и электрофореза, данный полиморфный локус можно считать пригодным для использования при диагностике дупликации/делеции гена РМР22.

В отличие от полиморфного ДНК-локуса 4А, мономерной единицей локуса 9А является пентануклеотид СААТА, а локуса 9В - тетрануклеотид ТТТС.

Согласно литературным данным, локусы 9А и 9В имеют по одиннадцать аллельных вариантов, однако в наших этнических группах выявлено только по восемь различных аллелей.

Наиболее часто во всех трех обследованных выборках встречаются аллели №№ 2, 3, 4 и 5, их частота находится в пределах 18-26% среди русских, 7-32% среди татар и 14-30% среди башкир. Вторым по частоте является аллель 6, встречающийся среди русских, татар и башкир с частотой, соответственно, 9%, 14% и 3%. Аллель 1 достаточно часто встречается среди русских - 3,3% несколько ниже среди башкир - 1,7% и татар - 0,8%. Более редкими являются аллели 7 и 8 (с наибольшим молекулярным весом): частота аллеля 7 составляет среди русских 0,8%, среди татар - 1,5%, среди башкир -3%. Аллель 8 обнаружен только среди татар с частотой 0,8%. По распределению частот данного локуса установлены достоверные различия между выборками татар и русских (р=0,02). Гетерозиготность по данному локусу оказалась выше, чем по локусу 4А, составив 75% во всех исследованных группах (табл. 8).

Похожие диссертации на Молекулярно-генетическое изучение наследственных моторно-сенсорных нейропатий I типа в Республике Башкортостан