Введение к работе
Актуальность проблемы.
Использование микроорганизмов и их ферментов для устойчивого и экологически безопасного получения разнообразных химических соединений является одним из приоритетных направлений развития биотехнологии. По оценкам экспертов в течение текущего десятилетия доля биотехнологических продуктов в общем объеме химической продукции возрастет в 10 раз. Особенно быстрыми темпами (более чем в 15 раз) будет увеличиваться производство полимеров из мономеров, получаемых с помощью биотехнологий. Сегодня в промышленных масштабах с помощью биотехнологий уже производится 3 мономера: акриламид, молочная кислота и 1,3 - пропандиол. Реализованные проекты продемонстрировали значительные преимущества биотехнологий в сравнении с традиционными химическими технологиями: биокатализаторы позволяют осуществлять процессы при мягких условиях (низкие температуры, нейтральная водная среда) и с высокой селективностью. Однако главное преимущество биокаталитических процессов состоит в том, что они, в целом, экологически безопаснее традиционных химических процессов и приводят к снижению выбросов и отходов (ионов металлов, различных солей, растворителей и пр.). Несмотря на явные преимущества биокаталитических систем, масштабы их использования в современной химической индустрии и, в частности, для получения мономеров, все еще ограничены. Для расширения спектра получаемых мономеров требуются новые биокаталитические системы с уникальными свойствами, которые позволят разработать экономически эффективные технологии, способные составить конкуренцию существующим технологиям. Синтез акриловых мономеров с использованием биокаталитических систем микроорганизмов является одной из немногих областей промышленной биотехнологии, где у России имеются приоритетные достижения в практической области. Данная работа направлена на решение проблемы экологически-безопасного и конкурентоспособного получения новой группы мономеров полимерного качества - N-замещенных акриламидов,
продуктами сополимеризации которых с акриламидом являются катионные флокулянты для очистки воды, повышения нефтеотдачи, добычи полезных ископаемых, а также полимеры с температуро-зависимой растворимостью, т.н. «smart» полимеры. Решение этой проблемы связывается с обнаружением новых ферментов, способных синтезировать N-замещенные акриламиды путём ацилирования аминов ацильным остатком акриламида в водной среде.
Цель и задачи работы.
Целью данной работы являлось обнаружение и характеристика нового фермента, способного синтезировать N-замещенные акриламиды путём ацилирования аминов ацильным остатком акриламида в водной среде, изучение гена кодирующего этот фермент, а также оценка биокаталитического потенциала нового фермента в области органического синтеза. В процессе работы решались следующие задачи:
-
Скрининг микроорганизмов, способных гидролизовать амидную связь в N-изопропилакриламиде.
-
Выбор лучшего штамма, катализирующего синтез N-изопропилакриламида.
-
Изучение особенностей биосинтеза ациламидазы и оптимизация условий, обеспечивающих максимальную активность клеток выбранного штамма.
-
Выделение ациламидазы и изучение её каталитических свойств.
-
Клонирование гена, кодирующего ациламидазу, секвенирование и анализ последовательности.
-
Интегративная инактивация гена ациламидазы в выбранном штамме и проверка фенотипа мутантов.
-
Гетерологичная экспрессия гена, кодирующего ациламидазу, в Escherichia coli.
-
Разработка процесса биокаталитического синтеза N-замещённых акриламидов с использованием новой ациламидазы.
Научная новизна и практическая значимость.
Обнаружен новый бактериальный фермент ациламидаза в клетках Rhodococcus erythropolis ТА37, способный гидролизовать N-замещённые амиды и осуществлять перенос ацильного остатка акриламида на алифатические амины в водной среде. Аминокислотная последовательность ациламидазы значительно отличается от последовательностей всех известных белков (уровень гомологии с известными белками не превышает 37%). Уникальные свойства обнаруженного фермента и созданного на его основе катализатора позволили впервые в мировой практике использовать биокаталитические системы для синтеза N-замещенных акриламидов путем непосредственного взаимодействия акриламида и аминов в водной среде при температуре 20-30С.
Апробация работы.
Диссертационная работа была апробирована на семинаре секции «Генетика
микроорганизмов» Учёного Совета ФГУП «ГосНИИ генетики и селекции
промышленных микроорганизмов» в ноябре 2010 года. Материалы диссертации
докладывались на Международной конференции «Биология - наука XXI века»,
Пущино 19 апреля - 23 апреля 2010 г.
Публикации.
По теме диссертации опубликовано три печатных работы, из них одна статья в
журнале, входящем в список, рекомендованный ВАК, один патент и одно
тезисное сообщение в материалах научной конференции, а также
зарегистрирована заявка на патент.
Структура работы.
Диссертация состоит из 6 разделов: «Введение», «Обзор литературы»,
«Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы», «Список
цитируемой литературы». Работа изложена на Цу страницах, включая ">о
рисунков и ' таблиц. Список цитируемой литературы содержит т/
источников, в том числеУЬ на русском языке.
