Содержание к диссертации
Введение
1. Актуальность проблемы 6
2. Цели и задачи работы 8
3. Научная новизна 9
4. Обзор литературы 10
4.1. Теломеры и их функция 10
4.2. Молекулярная организация теломерного повтора 13
4.3. Белки, связывающиеся с теломерами 18
4.4. Роль теломеразы в восстановлении теломерных последовательностей 19
4.5. Альтернативные механизмы поддержания структуры теломер 24
4.6. Структура теломер в онтогенезе растений 28
4.7. Молекулярная организация субтеломерных повторов 30
4.8. Особенности организации теломерной ДНК у Аспараговых (Asparagacea) 31
4.9. Особенности организации генома Луковых 36
4.9.1. Ботаническая характеристика лука-батуна (Л. fistulosum) 37
4.9.2. Практическая ценность использования Л. fistulosum в селекции лука репчатого 37
4.9.3. Молекулярно-генетическая и цитогенетическая характеристика A. fistulosum 39
4.10. Особенности молекулярной организации теломер у Allium 42
5. Материалы и методы 49
5.1. Растительный материал 49
5.2. Получение цитологических препаратов 49
5.3. Выделение ДНК 50
5.4. ПЦР-анализ 51
5.5. Гибридизация по Саузерну 53
5.6. Флюоресцентная in situ гибридизация (FISH) и получение растянутой ДНК 54
6. Результаты исследований 56
6.1. Геномная организация сателлитной ДНК 56
6.1.1. ПЦР анализ с праймерами на сателлитный повтор 56
6.1.2. Саузерн-гибридизация продуктов амплификации праймеров 34902 и 34903 58
6.1.3. Рестрикционный анализ 59
6.1.4. Саузерн-гибридизация продуктов амплификации праймеров 34905 и 34906 61
6.1.5. Саузерн-гибридизация с геномной ДНК A. fistulosum 62
6.1.6. Гибридизация in situ на растянутую ДНК A. fistulosum 63
6.1.7. ПЦР анализ несателлитной ДНК 64
6.1.8. Саузерн-гибридизация с ПЦР-продуктами праймеров 34905 и PR2 68
6.2. Изучение локализации продуктов амплификации на хромосомах A. fistulosum 68
6.3. Слот-блот анализ геномной ДНК A. fistulosum с
меченным теломерным повтором -TTAGGG 73
6.4. ПЦР анализ геномной ДНК с праймерами на теломерный повтор TTAGGG и TTTAGGG 74
6.5. Локализация продуктов амплификации праймеров HTelol и НТ1ео2 на хромосомах A. fistulosum 78
6.6. Сиквенирование продуктов ПЦР праймеров HTelol и НТе1о2 80
7. Обсуждение 84
7.1. Негомологичная рекомбинация в сателлитном повторе -механизм восстановления теломеры 84
7.2. Дрозофила-подобный механизм восстановления теломер 87
7.3. Восстановление теломер с помощью теломеразы 87
8. Выводы 93
9. Список использованной литературы
- Молекулярная организация теломерного повтора
- Получение цитологических препаратов
- Геномная организация сателлитной ДНК
- Негомологичная рекомбинация в сателлитном повторе -механизм восстановления теломеры
Введение к работе
Одним из основных элементов эукариотических хромосом являются теломеры, их физические окончания. Установлено, что теломеры защищают хромосомы от деградации нуклеазами и прогрессирующего укорачивания в результате незавершенной репликации в 5 -концах (Zakian, 1995). Имеются данные о важной роли теломер в коррекции спаривания гомологичных хромосом в мейозе (Heslop-Harrison et al.,1993; de Lange, 1998). Недавние исследования тонкой молекулярной структуры теломер указывают на их важную роль в процессах старения организма и пролиферации клеток (Егоров, 2001).
Теломеры большинства групп организмов представлены простыми повторяющимися GC-богатыми последовательностями ДНК (Futch et. al.,1995). Для высших растений характерен теломерный повтор - TTTAGGG (арабидопсис-тип) (Richards and Ausubel, 1988). Показано, что представители филогенетической ветви - Аспараговые, к которой относится семейство Луковые, потеряли растительный теломерный повтор и взамен, на концах хромосом, содержат характерный для позвоночных повтор - TTAGGG (Adams et. al. 2001, Sykorova et. al. 2003a). Однако, в отличие от других видов растений, у лука репчатого {Allium сера), не обнаружены ни арабидопсис-тип ни характерный для позвоночных теломерный повтор (Fuchs et. al., 1995, Sykorova et. al. 2003). Показано, что окончания хромосом лука репчатого (А. сера) и лука-батуна (A. fistulosum) содержат сателлитную ДНК размером 378-380 пар нуклеотидов (Irifune et al.,1995). В настоящее время неизвестно, как Луковые защищают окончания своих хромосом и какие последовательности ДНК выполняют функцию теломер. Поэтому данные о строении и природе последовательностей ДНК составляющих теломеры A. fistulosum
дополнят наши знания по эволюции растительной теломеры, ее молекулярной организации и функционированию. Более того, данная работа представляет практический интерес для селекции лука репчатого, так как лук-батун (A. fistulosum L) является источником хозяйственно-ценных генов, таких как, устойчивость к ржавчине (Urocystis cepulae Frost), (Jones and Mann, 1963), шейковой гнили (Botrytis squamosa Walker), луковой мухе (Hylemyia antique Bouche), корневой гнили {Phoma terrestris E. M. Hans.), (Porter & Jones, 1933), устойчивость к холоду, а также генов контролирующих высокое содержание сухого вещества (Van Der Meer and Van Benekom 1978). Данные об организации теломерной ДНК A. fistulosum L. необходимы для мониторинга и успешной интрогрессии генов в селекционных программах (Khrustaleva et al., 2005).
2. ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ
С целью выяснения механизма восстановления теломерных окончаний хромосом у Л. fistulosum была изучена геномная организация теломерной ДНК. При этом были поставлены следующие задачи:
1. С помощью FISH и слот-блот анализа провести поиск последовательностей ДНК гомологичных теломерным повторам позвоночных и арабидопсиса.
2. Изучить организацию сателлитного теломерного повтора с помощью ПЦР, Саузерн-гибридизации и рестрикционного анализа.
3. Изучить организацию и локализацию сателлитной ДНК на митотических хромосомах и растянутой ДНК с помощью FISH анализа.
4. Определить наличие в структуре теломерных повторов микросателлитов и ретротранспозонов.
3. НАУЧНАЯ НОВИЗНА
Впервые применен комплексный подход для изучения геномной организации сателлитного терминального повтора Allium fistulosum (378 п.о.), включающий набор молекулярных (ПЦР, рестрикционный анализ, Саузерн-блоттинг) и молекулярно-цитогенетических (FISH на митотическую и растянутую ДНК) методов. Показано, что сателлитная ДНК A. fistulosum организована тандемно (в ориентации "голова-хвост") и содержит кластеры последовательностей ДНК с перестройками в исходном сателлитном повторе 378 п.н. Выявлено, что в области сателлитного терминального повтора присутствуют микросателлиты и ретротранспозоны.
Впервые показано, отсутствие на окончаниях хромосом A. fistulosum функционального теломерного повтора TTAGGG, характерного для позвоночных. Однако выявлено, что в терминальном гетерохроматине присутствуют фрагменты теломерного повтора TTAGGG.
На основе полученных данных построена модель организации ДНК терминального сателлитного повтора A. fistulosum и предложены возможные механизмы восстановления теломер у Луковых.
Полученные данные по молекулярной структуре теломерных повторов у Allium fistulosum могут быть использованы для мониторинга и успешной интрогрессии генов в селекционных программах. На основании данных о нуклеотидной последовательности клонов теломерной ДНК могут быть разработаны молекулярные маркеры.
Молекулярная организация теломерного повтора
Вследствие этого, в каждом клеточном делении 5 -концы будут укорачиваться. Если теломеры станут короче определенного порогового значения, они будут неспособны к защите концов хромосомы. Это приведет к активированию механизма ареста клеточных делений (de Lange, 1994). Таким образом, теломеры можно считать молекулярными часами, определяющими срок жизни клетки. В генеративных клетках и быстроделящихся соматических клетках млекопитающих, например, таких как стволовые клетки, особый фермент теломераза защищает хромосомные окончания от укорачивания в каждом раунде репликации (Kipling, 1997). Роль теломеразы в защите от прогрессирующего укорачивания отстающей цепи во время репликации ДНК будет подробно рассмотрена в разделе 4.3
Помимо указанных выше основных функций, эта важная морфологическая структура хромосомы также вовлечена в ряд важных процессов, происходящих в ядре клетки. Так, теломеры могут взаимодействовать с ядерной мембраной и выполнять важную роль в организации ядерного хроматина в ядре, в частности организации отдельных функциональных доменов (Gilson et. al., 1993). Так, у инфузорий, теломеры макроядра ассоциированы с ядерным матриксом посредством теломеро-связанных белков, в результате чего формируется петлеподобная структура хромосом (Postberg et. al. 2001). Существуют четкие доказательства того, что у дрожжей и других высших эукариот теломеры ассоциированы с ядерным матриксом и эти взаимодействия очень важны (Croft et. al. 1999, de Lange 1992).
Также теломеры могут оказывать влияние на транскрипцию генов, которые тесно связаны с теломерами, и время начала ДНК-репликации (Gottschling et. al.,1990; Ferguson and Fangman, 1992; Nimmo et.al., 1994). Обратимая репрессия транскрипции генов, расположенных возле теломеры, была названа эффектом положения. Репрессия, и её обратимость легко детектируется, если ген кодирует фенотипический признак, например, определяет цвет глаз (у дрозофилы) или цвет колонии (у дрожжей).
Имеются данные о важной роли теломер в коррекции спаривания гомологичных хромосом в мейозе (Heslop-Harrison et al.,1993; de Lange, 1998). У различных организмов ассоциации гомологичных теломер наблюдали Фунабики и др. Авторы считают, что такие ассоциации обязательны в ранних стадиях мейоза, что наводит на мысль о важной роли таких взаимодействий для спаривания хромосом и рекомбинации (Funabiki et.al, 1993).
Теломеры большинства групп организмов, таких как простейшие, беспозвоночные и позвоночные животные, а также грибы, водоросли и высшие растения представлены простыми повторяющимися GC-богатыми последовательностями, имеющими сходный нуклеотидный состав (Futch et al.,1995, табл. 1). Таблица 1. Нуклеотидные последовательности теломерных повторов эукариот.
Нуклеотидная последовательность теломерных повторов довольно консервативна, однако количество повторов на концах хромосом сильно варьирует среди разных групп организмов. Например, теломеры арабидопсиса имеют длину около 2-4 тыс.п.н. и, следовательно, содержат 300 - 600 копий теломерного повтора (Richards and Ausubel, 1988), а у табака длина теломер достигает 150 тыс.п.н. и 20 000 копий повторов соответственно (Fajkus et. al. 1995).
Первые работы, выявившие такие повторы на концах молекул ДНК, были проведены на простейших, в частности на Tetrahimena. Этот организм имеет два ядра - диплоидный микронуклеус и полиплоидный макронуклеус. Геном макронуклеуса состоит из приблизительно 105 линейных молекул ДНК. При сиквенировании фрагментов ДНК, кодирующих рибосомальные гены, было обнаружено, что концы этих молекул содержат тандемно повторенную последовательность ДНК - TTGGGG (Blackburn and Gall, 1978). Последующий анализ окончаний хромосом у дрожжей (Shampay et. al.1984), растений (Richards and Ausubel 1988) и человека (Moyzis et. al., 1988) показал, что их теломеры также состоят из подобных GC — богатых повторов.
Получение цитологических препаратов
Цитологические препараты для флюоресцентной in situ гибридизации были приготовлены методом давления.
Предметные стекла обрабатывали 5N НС1 в течении 3 часов. Затем промывали в бидистиллированной воде (не менее 3 раз). Перед использованием стекла погружались в спирт на 10 мин. и высушивали на воздухе.
Семена проращивали на влажной фильтровальной бумаге, после 3-5 дней семена обрабатывали ц-бромнафталином при 4С в течение 24 часов. Корешки фиксировали в смеси из этанола и уксусной кислоты в соотношении 3:1 в течение часа и хранили при температуре +4С до использования.
Для приготовления препаратов корешки промывали в бидистиллированной воде 3 раза и в цитратном буфере. Затем обрабатывали в ферментной смеси: целлюлаза Onozuka 2%, пектинаназа 5S 2%, мацерозиме 2,5%, драйзелаза 1% в течение 1 часа при 37С. После этого корешки отмывали в цитратном буфере и готовили давленные препараты в 45% уксусной кислоте.
Для перевода временных препаратов в постоянные использовали метод замораживания - скалывания. Для этого свежеприготовленные препараты замораживали при температуре - 70С в течение 30 минут. После этого снимали покровное стекло и обрабатывали препарат 96% спиртом в течение 5 минут и высушивали на воздухе. Постоянные препараты хранили при температуре - 20С до использования.
Основными критериями отбора стекол для in situ гибридизации служили: - количество полных метафазных пластинок; - разброс хромосом; - отсутствие цитоплазмы и клеточной стенки; - отсутствие «мусора и грязи»; ДНК выделяли из молодых листьев по методу Bernatzky и Tanksley (1986) с некоторыми модификациями.
Молодые листья растирали в буфере для экстракции (0.35 М сорбитол, 100 мМ трис-HCl, 5мМ ЭДТА, рН 7) на холоду. Центрифугировали 10 мин. 14000 об/мин. Сливали надосадочную жидкость, добавляли буфер для экстракции, интенсивно встряхивали. Лизировали при 65С в буфере для лизиса (1 М трис- НС1 рН 7.5, 0.5 ЭДТА, 5 М NaCl, 2% СТАВ) с добавлением 5 % саркосила. После лизиса, производили очистку смесью хлороформ-изоамиловый спирт (24:1) и центрифугировали при 14 000 об/мин. в течении 10 мин. Отбирали надосадочную жидкость и осаждали ДНК в одном объеме изопропанола. Центрифугировали в 14 000 об/мин. в течение 10 мин., осадок высушивали и растворяли в MQ-воде. Размер выделенной ДНК и степень загрязненности РНК оценивали методом электрофореза в 1% агарозном геле.
Для изучения структуры сателлитного повтора использовался метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).
На основании данных о нуклеотидной последовательности сателлитного повтора лука-батуна (Irifune et al. 1995) были подобраны и синтезированы праймеры: 0 5 -ATCGATTCTTCGGACGGCCT-3 1 5 -ATCCGCAGGGTGCAACATCTGCGG-3\ Праймеры, обратные выше названным: 0 5 -AGATGTTGCACCCTTCGGAT-3 1 5 GGCCGTCCGAAGAATCGAT-3\
Для определения наличия теломерных повторов были использованы праймеры специфичные для растительного теломерного повтора: PTELOl 5 ТТТ AGG GTT TAG GGT ТТА GGG ТТТ AGG GTT TAG GG 3 PTEL02 5 ССС ТАА АСС СТА ААС ССТ AAA ССС ТАА АСС СТА АА 3 Также праймеры, специфичные для теломерного повтора млекопитающих: HTELOl 5 ТТА GGG ТТА GGG ТТА GGG ТТА GGG ТТА GGG 3 HTELQ2 5 ССС ТАА ССС ТАА ССС ТАА ССС ТАА ССС ТАА 3 . В 25 мкл смеси для ПЦР содержалось: 0.2 мМ каждого нуклеотида 1х буфер для ПЦР 100 нг ДНК-матрицы 20 нг каждого праймера 2.5 U ДНК-полимеразы.
Для мечения продуктов ПЦР использовалась смесь нуклеотидов, содержащая biotin-11-dUTP или Dig-11-dUTP ("Синтол", Москва). Амплификацию проводили на амплификаторе "Терцик" ("ДНК-технология", Москва) при следующих параметрах: Для амплификации сателлитного повтора 94С - 2 минуты; 94С - 30 с, 57С - 30 с, г 30 циклов 72С - 30 с, 72С -7 мин. Для амплификации теломерного повтора 94С - 5 минут; 94С - 1 мин . 15 циклов 55С - 40 с 72С - 2 мин 30 с 94С -1 мин 60С - 40 с L 25 циклов 72С - 2 мин 30 с J 72С - 7 мин.
Продукты ПЦР разделяли в 1,5% агарозном геле с буфером ТВЕ при напряженности поля б V/см. В качестве маркера размеров использовали "100 bp leader" (Fermentas).
После окрашивания бромистым этидием продукты ПЦР были визуализированы с помощью трансиллюминатора и задокументированы цифровой камерой «NIKON».
Геномная организация сателлитной ДНК
ПЦР анализ с праймерами на сателлитный повтор Для ПЦР-анализа были использованы две пары праймеров: первая пара праймеров 34902 и 34903 в прямой ориентации и вторая пара праймеров 34905 и 34906 в обратной ориентации (Рис. 5). При этом праймер 34902 был комплиментарен 34906, а праймер 34903 комплиментарен 34905.
При проведении ПЦР с праймерами 34902 и 34903 амплифицировали два фрагмента ДНК размером 378 и 760 п.н. (данные не представлены), что соответствует длине единицы сателлитного повтора. Фрагмент 760 п.н. был вырезан из геля и амплифицирован с теми же праймерами. При этом ПЦР выявила только фрагмент 378 п.н., что свидетельствует о тандемном расположении "голова-хвост" сателлитного повтора 378 п.н. Однако, возможные нарушения в структуре сателлитного повтора можно выявить с помощью одностороннего ПЦР. При правильной тандемной организации "голова-хвост" односторонний ПЦР не даст амплификацию четких фрагментов ДНК.
При использовании только одного праймера 34902 мы получили амплификацию сдвоенных фрагментов длиной от 195 до 1040 п.н. Амплификация таких фрагментов ДНК показывала некоторую периодичность с шагом 380-400 п.н. (рис.6, первая дорожка).
При одностороннем ПЦР с праймером 34903 амплифицировалась лестница фрагментов являющихся мультимерами фрагмента 395 п.н. (рис.6, вторая дорожка). При использовании праймера 34903 в обратной ориентации (праймер 34905) также амплифицировалась лестница фрагментов с шагом в 400 п.н. (рис.6, третья дорожка). Однако размер фрагментов ДНК, амплифицируемых этим праймером не совпадал с продуктами, амплифицируемыми праймером 34903. При ПЦР с праймером 34906, амплифицировалась лестница фрагментов, начиная с фрагмента, размером 400 п.н. (рис. 7-4). Показано, что условия ПЦР сильно влияли на количество и размер амплифицируемых фрагментов. Так, при изменения температуры отжига от 57 до 70С появлялись и исчезали дополнительные фрагменты ДНК, а также выраженный шмер, который присутствовал при амплификации на 57 градусах, а при температуре отжига 70С - исчезал.
Для оценки степени гомологии между продуктами одностороннего ПЦР с сателлитными праимерами и сателлитной ДНК 378 п.н., была использована гибридизация по Саузерну. Для Саузерн-гибридизации в качестве метки был выбран фрагмент 195 п.н., наименьший из продуктов амплификации праймера 34902 (рис.6, первая дорожка). Этот фрагмент, проявил гомологию к теломерной последовательности 378 п.н., амплифицированной с помощью праймеров 34902 и 34903, а также ко всем продуктам односторонней Для более детального изучения перестроек в сателлитном повторе был проведен рестрикционный анализ трех фрагментов: 395 п.н. - продукт праймера 34903, 195 п.н. - продукт праймера 34902 и 378 п.н. - единица сателлитного повтора. Фрагменты были обработаны восемью рестриктазами (Bam HI, EcoRI, EcoRV, Нае III, Hindlll, Pst I, Taq I, Hindi).
В исходной последовательности 378 п.н. согласно рестрикционной карте, имеются сайты рестрикции для трех рестриктаз: НаеШ, Hindi и TaqI, которые были найдены и у фрагментов 395 п.н. и 195 п.н. Остальные пять рестриктаз не имели сайтов рестрикции на рестрикционной карте 378 п.н. и не были обнаружены у двух исследуемых фрагментов. Продукты рестрикции фрагментов 378 п.н. и 395 п.н. с использованием Нае III и TaqI совпадали. Однако, на последовательности 395 п.н. было обнаружено по одному дополнительному фрагменту для каждой из двух рестриктаз. Появление дополнительного фрагмента, по-видимому, связано с увеличением длины данной последовательности. Перестройка, приведшая к образованию последовательности 395 п.н. могла реализоваться вследствие инверсии участка содержащего сайт для праймера 34903 (Рис. 9). Причем такая перестройка, по-видимому, возникла непосредственно в тандеме, о чем говорят данные ПЦР.
"Ц место инверсии Для рестриктазы Hindi сайт рестрикции на фрагменте 395 п.н. и на фрагменте 195 п.н. был обнаружен в том же положении, что и на исходной последовательности 378 п.н. На основании данных рестрикции фрагмента 195 п.н. рестриктазами НаеШ, Hindi и TaqI можно предположить, что этот фрагмент, по-видимому, является результатом инверсии в исходной последовательности 378 п.н.
При амплификации с праймером 34905 были получены фрагменты 180, 560, 940 п.н. и выше (рис.6 третья дорожка). Исходя из предложенной выше модели инверсии сайта содержащего праймер 34903, ожидаемый ПЦР продукт от обратного к нему праймера 34905 должен составить 400 п.н. Амплификация фрагмента меньших размеров (180 п.н.) может свидетельствовать о наличии наряду с инверсией также делеции. Рестрикционный анализ с Нае III, Hinc II, EcoRV, TaqI показал, что делеция произошла в области близкой к сайту инверсии (рис. 10).
Негомологичная рекомбинация в сателлитном повторе -механизм восстановления теломеры
Для изучения организации сателлитного повтора л былприменен комплексный подход, включающий набор молекулярных (ПЦР, рестрикционный анализ, Соузерн-блоттинг) и молекулярно-цитогенетических (FISH на митотическую и растянутую ДНК) методов. Было показано, что сателлитная ДНК локализуется в теломерном конце хромосом A. fistulosum, что совпадает с данными полученными ранее на А. сера и A. fistulosum (Irifune et. al., 1995; Pich et. al., 1996). Поскольку теломерный повтор арабидопсис-типа не был обнаружен у Луковых (Fuchs et. al., 1995), то наиболее вероятным кандидатом на его роль можно рассматривать сателлитную ДНК. Известно, что теломерный повтор митохондриальной ДНК Tetrahymena восстанавливается путем негомологичной рекомбинации (Morin and Cech, 1986). Видимо, подобный процесс может происходить в теломерах A. fistulosum. Утрата теломерного повтора может быть связана с мутациями, затрагивающими теломеразу. В таком случае теломерный повтор TTTAGGG мог быть утерян в результате незавершения репликации, а теломерные функции стали выполняться сателлитным повтором. Восстановление длины теломер в этом случае может происходить в результате негомологичной рекомбинации. Результатом такой рекомбинации является возникновение в строго тандемном сателлитном повторе перестроек, нарушающих его упорядочность. Нами были выявлены перестройки в тандемно организованной в ориентации "голова-хвост" сателлитной ДНК. Полученные продукты ПЦР с одним праймером указывают на то, что перестройки сателлитной ДНК, такие как делеции, инсерции и инверсии происходили довольно часто. Следует отметить, что размеры ПЦР-продуктов, образующихся при амплификации с одним из теломерных праймеров, практически во всех случаях (за исключением праймера 34903) были меньше исходной единицы повтора. Такие данные говорят о том, что перестройки в теломерных регионах A. fistulosum не являются результатом образования в структуре тандемного теломерного повтора участков с организацией единиц повтора в ориентации голова-к-голове и хвост-к-хвосту (рис. 32), как это было описано Вершининым с соавторами на ржи (Vershinin et al.,1995).
Таким образом, можно сделать вывод, что изменения 4І структуры сателлитной ДНК затрагивают часть единицы теломерного повтора. Это приводит к образованию новых последовательностей в тандемно организованном сателлитном повторе. Поскольку ПЦР-продукты того же самого размера образуются постоянно, в каждой проводимой ПЦР, то инверсии частей теломерной последовательности, видимо, происходят в постоянных точках. Механизм образования подобных элементов не ясен. Такие элементы могли образоваться на границах теломерного повтора, где сателлитная последовательность 378 п.н. может граничить с каким-либо субтеломерным повтором. Возможно, в таких точках может происходить некоторое «перемешивание» этих двух повторов с образованием некой (Щ регулярной структуры. Также, мы получили результаты, свидетельствующие о присутствии микросателлитных мотивов в терминальном гетерохроматине. Образовавшийся фрагмент ДНК при использовании теломерного праймера 34902 и праймера на межмикросателлитные последовательности (GA) 8 YC показал гибридизацию к теломерным районам всех хромосом. Вставки в теломерный повтор микросателлитных мотивов, видимо, произошли вследствие рекомбинации участков сателлитного повтора.
