Введение к работе
Актуальность темы. Лук репчатый (Allium cepa L.) является второй самой важной овощной культурой, уступая лишь томату (FAO, 2010). Лук входит в ежедневное меню питания человека. В нашей стране его выращивают на 12% площадей открытого грунта, занятых под всеми овощными культурами (, 2007). Химический состав луковиц и зеленых листьев включает в себя множество полезных веществ. Обилие витаминов и их удачная комбинация в луке способствуют профилактике многих заболеваний. Исследования последних лет показали, что содержащиеся в луке сульфорганические соединения обладают выраженным противораковым эффектом и снижают агрегацию тромбоцитов, т.е. предупреждают образование тромбов (Imai et al., 2002; Голубев и др., 2003).
На сегодня в мире в селекции лука репчатого существует большая проблема обедненного генофонда этой культуры, как результат более 5000-летнего периода целенаправленной селекции и утери при этом ряда ценных признаков. В современной селекции лука репчатого близкородственный вид лук-батун (Allium fistulosum L.) является уникальным источником многих ценных признаков (высокое содержание сухого вещества, холодостойкость, устойчивость к ржавчине, шейковой гнили, луковой мухе, корневой гнили), которые могли бы быть использованы для создания новых сортов лука репчатого.
Необычайно огромный геном лука (1С = 16 415 млн. п.н.) является главной причиной, по которой задерживается создание генетических ресурсов для этого экономически и филогенетически важного растения. Геном лука в 103 раза больше генома арабидопсиса, в 34 и 6 раз больше генома риса и кукурузы, соответственно (King et al., 1998).
Исследования последних лет по организации и эволюции генома растений с крупным геномом показали, что плотность генов увеличивается по направлению к дистальному концу хромосомы и коррелирует с чаcтотой рекомбинаций (Akunov et al., 2003; Khrustaleva et al., 2005). В связи с этим возникает вопрос об организации генов у таких видов, как A. cepa и A. fistulosum, которые диаметрально отличаются по распределению частот рекомбинаций вдоль физической хромосомы (Albini et al., 1988). У A. cepa точки рекомбинации локализованы в дистальном и интерстициальном регионах, a у A. fistulosum - вблизи центромерного района.
Недавно было установлено, что положение гена на хромосоме играет важную роль в изменении признаков и эволюции организмов (Rockman et al., 2010). Возможность увидеть ген/гены на физической хромосоме и сравнительный анализ положения гена на хромосоме у разных видов, объединенных в определенную таксономическую группу, значительно обогатят наши знания в области функциональной и сравнительной геномики и эволюции видов.
Учитывая масштабы выращивания лука, его ценность как продукта питания и как сырья для фармацевтической индустрии, являются актуальными расширенные исследования по изучению его генома, клонированию, секвенированию и физическому картированию генов.
Цели и задачи работы. Цель работы – изучить особенности хромосомной организации протеин-кодирующих генов у A. cepa и A. fistulosum.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
-
Провести биоинформатический анализ ДНК сиквенсов лука, размещённых в международном банке данных (NCBI) и нуклеотидных последовательностей EST клонов лука в двух имеющихся у нас EST библиотеках;
-
Провести клонирование 700 EST клонов в E. coli, выделение плазмидной ДНК и приготовление меченных ДНК проб для гибридизации in situ;
-
Усовершенствовать метод приготовления цитологических препаратов метафазных хромосом A. cepa и A. fistulosum для молекулярно-цитогенетических исследований;
-
Провести Tyramide-FISH локализацию 631 EST клона на хромосомах A. cepa и A. fistulosum и сделать сравнительный анализ локализации генов на хромосомах этих двух близкородственных видов;
-
Провести картирование индивидуальных EST клонов на хромосомах A. cepa с помощью Tyramide-FISH;
-
Подобрать праймеры на известные нуклеотидные последовательности генов аллиназы, фактора элонгации 1B- и -комплекса зарождающегося полипептида. Получить ПЦР-продукты с подобранными праймерами и геномной ДНК A. cepa и A. fistulosum;
-
Провести клонирование и секвенирование экзон-интронных фрагментов генов аллиназы, фактора элонгации 1B- и -комплекса зарождающегося полипептида;
-
Провести Tyramide-FISH-картирование экзон-интронных последовательностей фрагментов генов аллиназы, фактора элонгации 1B- и -комплекса зарождающегося полипептида;
-
Провести интегрирование сконструированных физических карт и ранее полученных генетических карт A. cepa.
Научная новизна. Впервые проведены широкомасштабные исследования по хромосомной организации протеин-кодирующих генов на луковых: проведен сравнительный анализ распределения 631 EST клона на физических хромосомах у A. cepa и A. fistulosum. Впервые физически картирован ген (EST клон API66), кодирующий транспортазу сахарозы A. cepa и установлено положение генов семейства транспортаз сахарозы на физических хромосомах A. cepa. Впервые с помощью Tyramide-FISH физически картированы на хромосомах A. cepa ген аллиназы (экзон-интронный фрагмент) и ген (EST клон API20), кодирующий светопоглощающий белок 3. Впервые клонированы, секвенированы и физически картированы на хромосомах A. cepa и A. fistulosum экзон-интронные фрагменты генов фактора элонгации 1B- и -комплекса зарождающегося полипептида. Впервые проведено интегрирование созданных ранее генетических карт A. cepa и физических карт, полученных нами с помощью молекулярно-цитогенетического картирования генов на хромосомах A. cepa, что позволило установить положение маркеров относительно теломеры и центромеры на физической хромосоме и определить физическое расстояние между ними.
Практическая значимость. Физическое картирование генов позволяет определить точное местонахождение конкретного гена на хромосоме, связать физическую и генетическую карты, что дает возможность определить распределение частот рекомбинаций вдоль физической хромосомы и тем самым установить положение гена относительно частоты рекомбинации.
Результаты работы могут быть использованы в селекции лука. Полученные знания о физическом положении генов на хромосомах позволяют прогнозировать возможности их переноса от одного генотипа к другому, определять размеры селекционной популяции, время и экономические затраты на получение нужных форм.
Полученные интегрированные карты могут быть использованы при секвенировании генома лука. Наличие интегрированных карт намного облегчает процесс секвенирования, что было наглядно показано при секвенировании генома человека (Yu et al., 2001), риса (Chen et al., 2002) и томата (Szinay et al., 2008).
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на XI молодежной научной конференции, секция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2011), XII Международной научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования, разработка и применение высоких технологий в промышленности» (Санкт-Петербург, 2011), II Международной школе-конференции молодых учёных «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» (Москва, 2011), 35-й Международной конференции студентов сельскохозяйственной и ветеринарной медицины (Сербия, Нови-Сад, 2011), Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 146-летию Академии имени К.А.Тимирязева (Москва, 2011), 6-ом Международном симпозиуме по съедобным Alliaceae (Фукуока, Япония, 2012), Международной конференции: Молекулярное картирование и селекция с помощью маркеров (Вена, Австрия, 2012).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 120 страницах машинописного текста и включают 35 рисунков, 5 таблиц, 1 приложение. Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследований и их обсуждение», «Выводы», «Заключение», «Список литературы», «Список иллюстративного материала» и «Приложения». Список литературы включает 162 источника, из них 146 иностранных.
