Введение к работе
Актуальность проблемы. Янтарная кислота - двухосновная карбоновая кислота, интермедиат цикла Кребса, накапливается некоторыми анаэробными бактериями в качестве продукта брожения. Наличие двух карбоксильных групп, расположенных по краям молекулы, позволяет получать из нее многие химические соединения, среди которых важные предшественники органического синтеза, полимеры, растворители, детергенты и др. Янтарная кислота в виде солей, сукцинатов, в больших масштабах применяется в роли антиобледенителей на ответственных участках дорог и аэропортов. По оценке специалистов министерства энергетики США, янтарная кислота входит в список 12 веществ, которые в ближайшем будущем будут производиться из биомассы и придут на смену продуктам нефтехимии. Тем не менее, в настоящее время основным источником янтарной кислоты является 1,4-бутандиол, получаемый из нефти. Однако в Европе и США уже действуют 5 экспериментальных установок, производящих янтарную кислоту путем ферментации из возобновляемого сырья.
Производство янтарной кислоты с применением бактериальных культур имеет существенный недостаток с точки зрения экономичности процесса. В ходе ферментации происходит накопление кислоты, и, так как ферментацию необходимо вести при нейтральных значениях рН, необходим эквимолярный расход щелочи. Более подходящими для этих целей могли бы быть грибные или дрожжевые культуры, среди которых многие штаммы обладают способностью адаптироваться к кислотной среде. Однако в немногочисленных работах, опубликованных на данный момент и описывающих накопление сукцината эукариотами, уровни продукции несопоставимо низки по сравнению с результатами, продемонстрированными на бактериях. Исходя из этого, перед нами была поставлена задача конструирования дрожжевого штамма, накапливающего янтарную кислоту в условиях, не требующих добавления нейтрализующего агента. Потенциально применение такого штамма в промышленности может позволить снизить себестоимость производимой янтарной кислоты, а значит, увеличить конкурентоспособность продукта по отношению к янтарной кислоте, производимой из нефти.
Пели и задачи исследования. Данная работа посвящена изучению возможности микробиологической продукции янтарной кислоты в условиях, не требующих добавления титрующего агента.
В связи с этим ставились следующие задачи:
- выбор подходящего микроорганизма, оптимальных условий ферментации и пути синтеза для продукции янтарной кислоты в условиях без титрующего агента;
конструирование штамма дрожжей, накапливающего янтарную кислоту в аэробных условиях;
оптимизация штамма методом селекции для продукции янтарной кислоты в условиях без титрующего агента;
анализ и характеристика полученного дрожжевого штамма-продуцента.
Научная новизна. В работе впервые продемонстрирована потенциальная возможность микробного синтеза янтарной кислоты без добавления титрующего агента. До настоящего времени были описаны лишь бактериальные штаммы, продуцирующие значимые количества янтарной кислоты. В представленной работе синтез янтарной кислоты осуществляется в аэробных условиях дрожжами Yarrowia lipolytica. Благодаря активной дыхательной цепи клетки обладают большей энергией и способны адаптироваться к низким значениям рН и высокой концентрации янтарной кислоты в среде. В работе использован оригинальный подход для изоляции Ts-мутаций по гену SDH1, кодирующему флавин-содержащую субъединицу сукцинатдегидрогеназы. Полученный штамм использован для подбора условий для селекции трансформанта с делецией по гену SDH2. На основе штамма с делецией по гену SDH2 в три этапа селекцией получен мутант #18-12-35, накапливающий янтарную кислоту в условиях без нейтрализующего агента в количестве до 63 г/л. С использованием методов ЯМР и ПМР определены особенности биосинтеза янтарной кислоты у предшествующего мутанта #18-12. Необходимо отметить, что исходный штамм, несущий делецию по гену SDH2, оказался не способен утилизировать глюкозу, но рос на средах с глицерином. Однако в ходе селекции штамма с делецией были получены производные, способные утилизировать глюкозу и накапливать янтарную кислоту. Трудно предположить, будет ли такое предпочтение в отношении субстратов общим для других аэробных дрожжей, поскольку инактивация сукцинатдегидрогеназы у облигатно аэробного микроорганизма, т.е. микроорганизма, не способного к брожению, в работе показана впервые.
Практическая ценность работы. Производство янтарной кислоты является одним из приоритетных направлений современной биотехнологии. Наиболее затратной стадией при производстве янтарной кислоты является ферментация, требующая для поддержания нейтральных значений рН расхода эквимолярных количеств щелочи. В работе разработан дрожжевой штамм, синтезирующий янтарную кислоту через окислительную ветвь цикла Кребса. Такой путь синтеза позволяет вести процесс в аэробных условиях при активном дыхании, что обеспечивает клетку избытком энергии, необходимой для адаптации клеток к высокой концентрации кислоты и низкому значению рН. Полученные результаты исследования представляют потенциальный интерес для биотехнологии и могут
быть использованы для получения промышленного дрожжевого штамма-продуцента янтарной кислоты, обладающего рядом преимуществ по сравнению с существующими бактериальными продуцентами. Полученный дрожжевой штамм #18-12-35 накапливает янтарную кислоту в количестве до 63 г/л при росте на среде с глицерином и не требует поддержания нейтральных значений рН среды при ферментации.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на двух международных конференциях: «Российско-Германский Форум по Биотехнологии 2010» в Мюнхене и «Дрожжи, как Модель и Инструмент 2010» в Страсбурге.
Диссертационная работа была апробирована на заседании секции «Генетика микроорганизмов» Ученого совета ФГУП «ГосНИИгенетика».
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе статья и патент.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из следующих разделов:
введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение,
заключение, выводы, список литературы. Работа изложена на страницах
машинописного текста и содержит рисунков и таблиц. Список
цитируемой литературы содержит аЗ источников, в том числе У на русском языке.
