Введение к работе
Актуальность темы. В последние годы существенно возрос интерес к биоразнообразию и экологии микроорганизмов экстремальных местообитаний. Изучение экстремально кислых местообитаний (рН<3) становится значимым, так как кислотность природных и техногенных экосистем часто является последствием микробной активности (Ehrlich, 1996; Hallberg, Johnson, 2001; Nordstrom, Southam, 1997; Nordstrom, Alpers, 1999).
СРП, обнаруженные в кислых местообитаниях, в основном представлены спорообразующими организмами. Известны примеры выделения СРП рода Desulfosporosinus как с использованием культивирования (Johnson B.D., Hallberg, 2003), так и молекулярными методами (Kiisel et al., 2001; Nevin et al., 2003; Saunders et al., 2005; Winch et al., 2009; Kimura et al., 2006 и др.) из кислых местообитаний, загрязненных металлами. Немногие полученные из таких экосистем чистые культуры были активны при рН<4,9 (Johnson et al., 2006; Kimura et al., 2006).
Изучение биоразнообразия СРП в кислых шахтных дренажах, загрязненных металлами, имеет большое практическое значение. В последние годы возрос интерес к изучению возможностей стимулирования активности аборигенной микрофлоры в загрязненных местообитаниях. Целью подобных исследований является поиск новых путей развития биоремедиапионных технологий. В связи с этим, данные о численности и биоразнообразии СРП в экосистемах, загрязненных стоками металлургических и горнодобывающих производств, представляют особую ценность.
Другим местообитанием, характеризующимся экстремальными условиями рН, являются глубоководные гидротермальные поля - области на поверхности океанического дна, характеризующихся выходами геотермальных растворов, обогащенных восстановленными соединениями серы, газами и тяжелыми металлами. Микробные сообщества глубоководных гидротерм представляют значительный интерес с точки зрения эволюции биосферы и, по мнению многих исследователей, являются аналогами сообществ, доминировавших на ранних этапах развития жизни на Земле (Заварзин, 2001; Nisbet, 1986; Walter et al., 1998; Nisbet, Sleep, 2001).
Уникальное глубоководное гидротермальное поле Лост Сити, отличающееся от всех известных глубоководных гидротерм низкой температурой (40-90С), щелочным рН (9-9.8)и составом гидротермального раствора, рассматривается некоторыми авторами как аналог экосистемы, где могли зародиться первые формы жизни (Proskurowski et al., 2008). Изучение биоразнообразия микробных сообществ флюидов и построек Лост Сити, проведенное американскими учеными (Brazelton et al., 2006) с помощью молекулярного клонирования, по мнению авторов, не показало присутствия организмов, способных восстанавливать сульфат. Однако наличие процессов сульфатредукции в поле Лост Сити показано методом измерения скоростей сульфатредукции (Леин и др., 2002; Дулов и др., 2005) и посевом на
элективные питательные среды (Дулов и др., 2005). В связи с этим, представляется важным поиск и идентификация СРП, обитающих в этой уникальной экосистеме.
Изучение структуры и разнообразия микробных сообществ природных экосистем долгое время было ограничено морфологическим описанием микроорганизмов, а физиолого-биохимические исследования проводились с чистыми культурами на лабораторных питательных средах. Однако лабораторное культивирование не дает полного представления о разнообразии микробного сообщества. Использование молекулярных методов, основанных на анализе универсального филогенетического маркера, гена 16S рРНК, а также некоторых функциональных генов, комбинируемых с физиологической характеристикой выделенных штаммов, позволяет более подробно изучить филогенетическое разнообразие микробных сообществ разнообразных экосистем (Harmsen et al., 1997; Slobodkin et al., 2001; Takai et al, 2003).
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в выяснении филогенетического разнообразия микробного сообщества с целью поиска СРП в кислых осадках хвостохранилища золотообогатительной фабрики на месторождении «Новый Берикуль» в Кузбассе и микробных обрастаниях карбонатной постройки глубоководного гидротермального поля Лост Сити.
Для достижения цели поставлены следующие задачи:
Определить численность сульфатредуцирующих микроорганизмов микробиологическими методами в осадках хвостохранилища.
Выделить культивируемые формы СРП из осадков хвостохранилища и изучить их физиологию и филогению.
Определить филогенетическое разнообразие микробного сообщества, диссимиляционно восстанавливающего сульфаты в осадках хвостохранилища, методами денатурирующего градиентного гель-электрофореза и молекулярного клонирования генов 16S рРНК и функционального гена на сульфатредукцию dsrAB.
Определить филогенетическое разнообразие сульфатредуцирующих организмов в пробах микробных обрастаний карбонатной постройки глубоководного гидротермального поля Лост Сити методом молекулярного клонирования генов 16S рРНК и dsrAB.
Научная новизна работы. Впервые исследовано разнообразие и численность СРП в осадках хвостохранилища золотообогатительной фабрики на месторождении «Новый Берикуль» в Кузбассе с помощью традиционных микробиологических методов и методов, основанных на анализе последовательностей ДНК. Анализ разнообразия генов универсального филогенетического маркера 16S рРНК и функционального гена-маркера сульфатредукции dsrAB проведен методами ПЦР-амплификации и последующего разделения методами денатурирующего градиентного гель-
электрофореза (ДГГЭ) и молекулярного клонирования. Установлено, что микроорганизмы, способные к восстановлению сульфатов, представлены в исследуемом местообитании филотипами, родственными спорообразующим СРП рода Desulfosporosinus. Также обнаружены последовательности, родственные генам dsrAB некультивируемых микроорганизмов, существенно удаленных от всех Bacteria, для которых известна способность к диссимиляционной сульфатредукции и, вероятно, относящихся к неизвестным сульфидогенам. Комбинирование методов молекулярной биологии (ДГГЭ и молекулярное клонирование генов) и традиционных методов культивирования позволило наиболее подробно охарактеризовать сообщество микроорганизмов в кислых осадках хвостохранилища.
Из микрокосмов, полученных из проб осадков хвостохранилища на среде с лактатом и низким рН (2,5) с содержанием меди (II) 200 мг/л, выделена чистая культура Desulfosporosinus sp. DB, отличающаяся от известных представителей рода Desulfosporosinus умеренно-ацидофильным характером роста и устойчивостью к высоким концентрациям тяжелых металлов (меди, никеля, кобальта и кадмия). Изучена способность штамма образовывать сульфиды меди, показано накопление сульфидов в виде микрокристаллов на поверхности бактериальных клеток.
Исследовано бактериальное разнообразие в пробе микробного обрастания карбонатной постройки гидротермального поля Лост Сити. Впервые в этом местообитании обнаружены гены dsrAB, родственные представителям СРП рода Desulfotomaculum. Параллельное клонирование генов 16S рРНК и dsrAB свидетельствует, что спорообразующие Firmicutes, родственные Desulfotomaculum, являются единственными организмами в сообществе микробного обрастания из Лост Сити, для которых вероятна способность к диссимиляционной сульфатредукции.
Личный вклад соискателя. Автор принимал участие в отборе проб с территории бывшего хвостохранилища золотообогатительной фабрики на месторождении «Новый Берикуль» в Кузбассе, определении численности СРП и получении микрокосмов. Выделение чистой культуры и изучение ее физиологических характеристик проводилось совместно со студентами лаборатории биотехнологии и биоинженерии ТГУ. Изучение разнообразия микроорганизмов с помощью молекулярного клонирования генов проводились автором самостоятельно, ДГГЭ-анализ - совместно с магистрантом ТГУ Г.А. Стыкон. Филогенетический анализ микробных сообществ выполнен в партнерстве с научным руководителем - д.б.н. О. В. Карначук. Формулирование целей, задач и обсуждение полученных результатов проводилось под руководством научного руководителя.
Практическая значимость работы. Данные о численности и разнообразии СРП в осадках хвостохранилища золотообогатительной фабрики на месторождении «Новый Берикуль» в Кузбассе могут быть использованы при разработке технологий ремедиации, основанных на
стимуляции аборигенного сообщества микроорганизмов, способных к переводу растворенных металлов в нерастворимую форму.
Чистая культура СРП, выделенная и охарактеризованная в ходе настоящей работы, обладает свойствами, важными с точки зрения использования в биотехнологиях осаждения металлов, а именно: устойчивостью к металлам, ацидотолерантностью, способностью к использованию дешевых органических субстратов (этанола, глицерина). Осаждение ионов меди в виде халькопирита и ковеллита в процессе роста штамма делает его перспективным для использования в технологиях биоремедиапии. Штамм может быть рекомендован для тестирования в in situ и ex situ технологиях очистки стоков от металлов.
Результаты исследования микробного сообщества гидротермального поля Лост Сити позволили идентифицировать представителей СРП в изученной экосистеме.
Основные защищаемые положения:
Спорообразующим Desulfosporosinus принадлежит важная роль в процессе диссимиляционного восстановления сульфатов в осадках хвостохранилища, характеризующихся высоким содержанием металлов и низкими значениями рН.
Выделенный штамм СРП Desulfosporosinus sp. DB является перспективным для использования в технологиях биоремедиапии загрязненных металлами и сульфатами экосистем.
3. Диссимиляпионное восстановление сульфата в микробных обрастаниях
карбонатных построек Лост Сити могут осуществлять родственные
Desulfotomaculum организмы.
Апробация работы. Материалы исследований по теме диссертации были представлены на II Международной молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2006); 11th International Symposium on Microbial Ecology (Vienna, Austria, 2006); II International Conference on Environmental, Industrial, and Applied Microbiology (Seville, Spain, 2007); Международной научной конференции «Микроорганизмы и биосфера» (Москва, 2007); 6th International Copper Meeting «Copper and related metals in biology» (Alghero, Sardinia-Italy, 2008); IV Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2008); Российской школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, 2008); школе-семинаре «Современные фундаментальные проблемы физиологии и биотехнологии растений и микроорганизмов» (Томск, 2008), V Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2009).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, включая 2 статьи и 9 тезисов докладов. Одна статья находится в печати.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей методы, результаты исследования и обсуждение, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 132 страницах машинописного текста и включают 39 рисунков и 18 таблиц.
