Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 12
1. Bacillus thuringiensis (Bt) и 5-эндотоксины 12
1.1. Общая характеристика бактерий Bt 12
1.2. Виды токсинов, образующихся в бактериях Bt ...14
Классификация штаммов и cry-генов Bt 17
1.4. Частные вопросы генетики и молекулярной биологии Bt.\9
2. Экспрессия cry-генов и синтез протоксинов 21
2.1. Транскрипционные механизмы 22
2.2. Посттранскрипционные механизмы 25
2.3. Посттрансляционные механизмы 27
2.4. Кристаллизация инсектицидных белков 28
2.5. Структура ifr-токсинов 32
2.6. Структурные сходства среди токсинов 35
2.7. Функционально- структурная интерпретация 2?ґ-токсинов38
3. Механизм действия Cry-токсинов 41
3.1. Общая характеристика 41
3.2. Роль петель домена II 44
3.3. Роль домена III в закреплении рецептора 45
3.4. Интеграция в мембрану 45
3.5. Образование ионных каналов 46
3.6. Получение мутантов для повышения токсичности 48
4. Использование Bt- генов в биотехнологии и генной нженерии...49
4.1. Использование Cry-белков для контроля численности вредителей и защиты растения 49
4.2. Разработка новых биопестицидов, основанных на Bt 51
4.3. Экспрессия cry-генов Bt в растениях 53
4.4. Устойчивость насекомых к ZJf-токсинам 55
4.5. Управление устойчивостью насекомых к 2?*-токсинам..61
5. Новые репортерные системы на основе лихеназы Clostridium thermocellum 66
Глава II. Материалы и методы 73
Заключение 126
Выводы 128
Список цитируемой литературы 130
- Виды токсинов, образующихся в бактериях Bt
- Кристаллизация инсектицидных белков
- Роль домена III в закреплении рецептора
- Устойчивость насекомых к ZJf-токсинам
Введение к работе
Открытие в начале XX века инсектицидного действия токсинов Bacillus thuringiensis (Bi) имело важные последствия в вопросе защиты растений от насекомых-вредителей. В последующие десятилетия для защиты растений от насекомых применялись, и по настоящее время применяются, биологические препараты, основой которых являются эти микроорганизмы и/или их метаболиты. Действующие агенты биопрепаратов являются компонентами природных биоценозов, что объясняет их относительную безопасность для окружающей среды, человека, животных, птиц, рыб и полезной энтомофауны. Следующим знаменательным событием, предопределившим ход событий в защите от насекомых, было создание растений, которые сами продуцировали данные токсины (Cry-белки). В настоящее время получены трансгенные растения кукурузы, картофеля, хлопка, риса, экспрессирующие cry-гены. Экспрессия нативных cry-генов Bacillus в растениях, даже при переносе делеционных вариантов нативных генов, которые кодируют только токсическую часть белка, малоэффективна. Причина низкого уровня экспрессии этих генов в эукариотических системах обусловлена рядом факторов. Во-первых, относительное содержание А+Т в ДНК Bacillus значительно выше, чем таковое в эукариотах, и в растениях в частности. Высокое содержание А+Т характерно для сайтов сплайсинга, полиаденилирования (polyA), сигналов деградации мРНК, и сайтов терминации транскрипции. Во-вторых, частоты использования кодонов в генах, которые кодируют токсины Bacillus, значительно отличаются от таковых для эукариот (дрожжей, растений). При замене . нуклеотидов в последовательностях Bacillus синонимичными кодонами растений экспрессия -модифицированных генов в растениях значительно увеличивается.
В настоящее время для идентификации трансгенов используется целый арсенал молекулярно-биологических методов: Нозерн- или Вестерн-блот гибридизация, визуализация РНК или белка in situ, определение ферментативной активности белкового продукта (если таковая имеется), и ряд других. Однако эти методы исследований в большинстве случаев требуют больших затрат времени, реагентов, а также специального оборудования, и исследователи для изучения структурно-функциональных характеристик интересующих их последовательностей часто используют стратегию репортерных систем. Используя репортерные системы, можно определять как уровень экспрессии исследуемых генов (транскрипционные репортеры), так и локализацию их продуктов (трансляционные репортеры). Такие исследования проводятся с использованием гибридных последовательностей, которые состоят из последовательности интересующего исследователя гена, слитого в рамке считывания с последовательностью репортерного гена. Это значительно облегчает проведение исследований, поскольку зачастую проще определить продукт репортерного гена, нежели продукт исследуемого гена.
Ранее в нашей лаборатории была разработана репортерная система на основе термостабильной лихеназы Clostridium thermocellum (Tiruzian et al, 1985, 1998, 2000, 2002). Свойства лихеназы соответствуют многим требованиям, предъявляемым к репортерным белкам. Лихеназа - термостабильный белок с температурным оптимумом 70°С, имеет небольшой размер (28 кДа), высокую удельную активность. Эти свойства позволяют тестировать ее активность простыми, и чувствительными методами. Помимо этого, лихеназа сохраняет свои основные свойства - активность и термостабильность - при значительных достройках в N- и С-концевых областях белка, что позволяет ее использовать как трансляционный репортер.
В настоящее время проблемы биобезопасности трансгенных растений, в том числе экспрессирующих cry гены, являются актуальными. Cry белки изучаются достаточно долго, и не являются токсичными для млекопитающих, птиц, амфибий, рептилий, и очень специфично влияют на определенные группы насекомых и беспозвоночных вредителей. В то же время, наиболее острым остается вопрос неконтролируемого переноса генетической информации от трансгенов в окружающую среду, в дикорастущие растения, в том числе сорные. Несмотря на многочисленные исследования, этот вопрос пока не до конца разработан. В связи с этим разработка новых подходов, позволяющих производить такие исследования быстро, точно и с минимальными затратами является актуальной.
Цель исследования: провести сравнительное изучение экспрессии нативного и модифицированного генов сгуЗа в клетках про- и эукариот. Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:
1. Клонирование нативного гена сгуЗа, определение его нуклеотидной последовательности и анализ последовательности сгуЗа гена.
2. Модификация последовательности гена сгуЗа с помощью компьютерных программ для эффективной экспрессии в клетках эукариотах (дрожжи и растения).
3. Химический синтез и клонирование фрагментов модифицированного гена с последующей проверкой корректности сборки последовательности модифицированного гена сгуЗаЫ секвенированием.
4. Конструирование бактериальных и дрожжевых экспрессионных векторов, в которых нативный и синтетический гены слиты с новым универсальным репортерным геном ИсВМ2, кодирующим термостабильную лихеназу.
5. Сравнительное изучение экспрессии нативного, модифицированного и гибридных генов в клетках Е. coli и дрожжей.
6. Проведение биотестов на личинках первого возраста колорадского жука (Leptinotarsa disemlineata) с использованием белковых экстрактов, полученных из дрожжевых трансформантов.
7. Конструирование растительных экспрессионных векторов, в которых сгуЗаЫ и гибридный сгуЗаМ-НсВМ2 гены находятся под контролем светоиндуцибильного промотора малой субъединицы гена РБФК Arabidobsis thaliana и последовательности лидерного пептида гена РБФК гороха.
8. Получение и молекулярно-биологический анализ первичных трансформантов растений картофеля, экспрессирующих сгуЗаМ и стуЗаМ-licBMl гены.
9. Проведение биотестов первичных трансформантов растений картофеля, экспрессирующих сгуЗаЫ и сгуЗаМ-ІісВМ.2 гены, с использованием личинок колорадского жука.
Научная новизна работы. Впервые термостабильную лихеназу (LicBM2) успешно использовали в качестве трансляционного репортерного для проведения сравнительных исследований экспрессии нативного и синтетического белков СгуЗа в клетках про- и эукариот. Показано, что термостабильная лихеназа может использоваться в качестве удобного репортера для отбора трансгенных организмов, определения молекулярной массы гибридных белков и уровня их экспрессии. Для эффективной экспрессии в клетках эукариот ген сгуЗа (сгуЗаМ) был модифицирован, и проведены его синтез и клонирование с использованием новой стратегии. Показано, что модификация последовательности сгуЗа гена позволила значительно увеличить уровень его экспрессии в клетках эукариот (дрожжи, растения) с сохранением биологической активности белкового продукта. Впервые для экспрессии модифицированного сгуЗаЫ и гибридного сгуЗаЫ-ИсВЫ2 генов в растениях картофеля был использован светоиндуцибильный промотор малой субъединицы гена РБФК Arabidobsis thaliana, который обусловливает преимущественную экспрессию контролируемого им гена только в зеленых тканях растения (листьях) - органах-мишенях для личинок колорадского жука. Апробация результатов работы. Результаты работы были представлены на XVII European Association for Research on Plant Breeding Conference on "Genetic Variation for Plant Breeding" (Tulln, Austria, 2004); International Organization for Biological and Integrated Control of Noxious Animals and Plants (IOBC) Conference on "Breeding for plant resistance to insects, mites and pathogens" (Bialowieza, Poland, 2004); 9th Iranian Students Seminar in Europe (Birmingham, UK, 2002); 2th International Seminar presentation on "Innovational scientific- technical projects of Biotechnology" (Pushino, Russia, 2003); 3th Iran- Russia International Conference on " Agriculture and natural resources" (Moscow, Russia, 2002); 12th Iranian Researchers Conference in Europe (IRCE) (Manchester, United Kingdom, 2004); 4th International Iran and Russia Conference on " Agriculture and Natural recourses" (Sharekord, Iran, 2004); 3th international scientific conference on "Biotechnology in plant and animal production, and veterinary" (Moscow, Russia, 2004); International scientific conference on "Molecular genetics, Genomics and Biotechnology" (Minsk, Belarus, 2004); 11th International Congress on "Molecular Plant-Microbe Interactions" (Saint-Petersburg, Russia, 2003); Международной конференции "Современное состояние проблем и достижений в области генетики и селекции" (Almata, Kazakhstan, 2003); III съезде ВОГиС "Генетика в XXI веке, Современное состояние и перспективы развития" (Москва, Россия, 2004); Международной конференции "Клеточные ядра и пластиды растений: биохимия и биотехнология" (Minsk, Belarus, 2004); II Конференции Московского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова "Актуальные проблемы генетики" (Москва, Россия, 2003); Конференции, посвященной 100-летию научной селекции в России (Москва, Россия, 2003); на заседании научного семинара Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН и на семинарах лаборатории функциональной геномики Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.
Виды токсинов, образующихся в бактериях Bt
Самыми важными токсинами, образующимися . в Bt, являются параспоральные кристаллические белки (ICP или дельта-эндотоксины), которые играют важную роль в специфичном инсектицидном действии бактерий. Эти токсины синтезируются во время формирования спор и имеют размер от 60 до 130 кДа. Каждая клетка синтезирует более 10 миллионов молекул эндотоксинов, которые формируют один кристалл [Agaisse et al, 1995; Bravo et al, 1997; Lereclus etal,1992].
Кроме кристаллических токсинов ряд пестицидных белков, не связанных с Cry-белками (так называемые, вегетативные инсектицидные белки, VIP), синтезируются некоторыми штаммами Bt в течение вегетативного роста. VIP не формируют параспоральные кристаллические белки и, очевидно, секретируются из бактериальной клетки.
В настоящее время VIP исключены из номенклатуры Сгу-белков, поскольку не формируют кристаллических белков, и нет данных относительно наличия v/p-генов в геноме Bt, хотя, возможно, они локализуются на плазмидах, на которых встречаются и cry-гены. Механизм действия VIP схож с таковым для Сгу-белков [Butko et al, 1997; Hosan et al, 2003; Thomas et al 1983]. Например, ген vipla. кодирует белок с молекулярной массой 100 кДа. Во время секреции белка его N-концевая часть, очевидно, подвергается действию гидролитических ферментов и в результате этого секретируемый белок Vipla имеет молекулярную массу 80 кДа. Показано, что Vipla вместе с Vip2a обладает токсичностью к личинкам вредителя корней кукурузы [Schneps et al, 1998].
Кроме cry- и vip-гепов, современные исследования показали, что цитолитические белки (Cyt-белки) в Bt также имеют специфичное инсектицидное действие и формируют кристаллические формы, но в отличие от делта-эндотоксинов имеют небольшую молекулярную массу (20 кДа) и образуются в вегетативной фазе [Agaisse et al, 1996; Cheng et al, 2002; Joung et al,2002].
Следует отметить, что эндотоксины, VIP-токсины и цитолитические токсины специфично влияют на насекомых, однако в некоторых штаммах Bt обнаружен ряд внеклеточных компонентов, которые оказывают неспецифичное действие на насекомых. Среди них выявлены протеазы, хитиназы, фосфолипазы, термолабильный алфа- и бета-экзотоксины. Бета-экзотоксин является термостабильным токсином и мутантным аналогом нуклеотида аденина. В Bt также образуются вещества с противогрибковым действием. Поэтому Сгу-токсины являются самыми важными факторами вирулентности Bt, которые позволяют бактериям влиять на насекомых и жить в мертвых или ослабленных личинках насекомых. Пестициды на основе Bt, в отличие от синтетических пестицидов, являются природными и не оказывают влияния на млекопитающих, и влияют только на определенные виды насекомых. В настоящее время пестициды, созданные на основе Bt, составляют около 3% всех производимых инсектицидов.
В настоящее время изолировано много штаммов Bt и каждый год добавляются новые штаммы этих микроорганизмов. Штаммы Bt идентифицируются несколькими методами: серотайпингом, по серологии кристаллов, по морфологии кристаллов, по белковым компонентам, по картированию пептидов, по гибридизации ДНК, по молекулярным маркерам и инсектицидному действию [Crickmore et al 1998]. Метод серотайпинга основан на системе антиген-антитело, и работает на основе агглютинации флагелл (Н). В настоящее время идентифицировано более 80 серотайпов. Интересно, что разные серотипы (штаммы) могут иметь как одинаковые, так и разные кристаллы [Li et al, 2002; Robertson et al, 1995].
Лучший метод классификации Cry-токсинов основан на гомологии последовательности генов токсинов и спектре инсектицидного действия. Первоначально было классифицировано 42 Cry-токсина, которые были сформированы в 5 групп: Cryl (проявляют инсектицидное действие на бабочках), Сгу2 (проявляют инсектицидное действие на бабочках и двукрылых), СгуЗ (проявляют инсектицидное действие на жесткокрылых), Сгу4 (проявляют инсектицидное действие на двукрылых) и Сгу5 (проявляют инсектицидное действие на нематодах) [Hofte et al, 1989]. Следует отметить, что в настоящее время число генов токсинов намного увеличилось. Сейчас идентифицировано около 150 cry-генов, которые классифицированы в 24 группы (Табл. 1.1) [Rajamohan et al, 1998]. Таблица 1.1- Гены кристаллических белков
Кристаллизация инсектицидных белков
После того как токсины сформировались, они обычно собираются и формируют кристаллы, эти кристаллы в зависимости от подвида и токсина имеют разные формы. В составе кристаллов могут быть разные токсины или один токсин. Например, Bt подвид israelensis, который влияет на двукрылых, формирует многоугольные кристаллы, в состав которых входят четыре дельта-эндотоксина и один цитотоксин, и это может уменьшать развитие устойчивости насекомых к токсинам Bt [Federici et al, 1990]. У разных протоксинов Cryl которые входят в состав одного кристалла, обнаружены гомологичные С-концы в состав которых входят 16-19 цистеинов. Эти гомологичные концы соединяются дисульфидными связями. В кристаллах, которые состоят из протоксина Сгу2 или СгуЗ, их протоксины соединяются ионными связями. Несколько подвидов формируют и Cryl и Сгу2, т.е. формируют два вида кристалла [Bietlot et al, 1990].
Другим фактором является место кристаллов в спорулирующей клетке. Некоторые подвиды Bt формируют кристаллы внутри экзоспории, другие снаружи экзоспории, а также внутри и снаружи экзоспории. Известно, что сгу гены, белки которых формируют кристаллы внутри или снаружи экзоспории, находятся на разных плазмидах. Показано, что если одну из этих плазмид трансформировать в В. cereus, то кристаллы формируются в ожидаемом месте. Поэтому гены, определяющие место кристалла в клетке, находятся на плазмиде, на которой встречается cry-ген. Одним из возможных механизмов является соответствием времени синтеза протоксина со спором и поэтому этот комплекс формируется во время спорообразования [Gilbert et al, 1997].
Для получения высоких концентраций белков, одним из важнейших факторов является их уровень стабильности. Протеолитическое расщепление белков является общей проблемой промышленной биотехнологии, и в настоящее время используют целый ряд подходов, чтобы уменьшить этот эффект, включая секрецию, использование ингибиторов протеаз или использование мутантных штаммов, у которых уменьшена активность протеаз, получение конструкций слитых белков для формирования кристаллов, и т.д. [Rajamohan et al. 1998; Schnepfetal. 1998].
Механизм, с помощью которого Bt избегает протеолитического расщепления белков - это формирование устойчивых к протеазам телец включения. Однако, эти белковые включения должны легко раствориться в кишечнике личинок насекомого, чтобы проявить токсичность. Форма кристаллической структуры и ее свойство растворимости зависят от многих факторов, включая вторичную структуру Cry-белков, энергию дисульфидных связей и присутствие дополнительных компонентов [Sanchis et al. 1996; Slatin et al. 1990]. Эксперименты показали, что Cryl белки могут формировать биологически активные тельца включения в Е. coli и В. subtilis, а также в других бактериях. Это позволяет предложить, что Cry-белки могут спонтанно формировать кристаллы, вне зависимости от бактерии-хозяина. Надо отметить, что для формирования растворимого и активного кристалла в Е. coli, В. subtilis и других бактериях, необходимы специальные условия. Когда кристаллы Cryl растворяют в 8М мочевине, то после перекристаллизации они теряют свою токсичность, помимо этого изменяется их растворимость в зависимости от рН буферного раствора (со значениями от 8 до 12). Известно, что С-области Cryl, Сгу4А, и Сгу4В белков имеют структурное сходство, и их кристаллизация, возможно, происходит схожим образом. Действительно, большая часть С-области этих молекул состоит из цистеинов и не влияет на токсичность протоксина. Поэтому предполагается, что эти области вносят вклад в стабильность кристаллов за счет формирования дисульфидных связей [Aronson et al. 1995; Masson et al. 1995].
Кристаллизация СгуЗА (73 кДа) белка может проходить несколько по-другому. Этот белок формирует плоский прямоугольный кристалл и в В. Subtilis, и В, thuringiensis, но кристаллы, полученные при перекристаллизации этих белков из растворов бромистого натрия (NaBr) и последующего диализа, остаются растворимыми и активными против личинок жесткокрылых. Различие между характеристиками растворимости Cryl и СгуЗА кристаллов, вероятно, определяется отсутствием цистеин-богатой С-области протоксина СгуЗА. Кристаллы СгуЗА составлены из полипептидов, которые не связаны дисульфидными связями. Анализ трехмерной структуры белка СгуЗА предлагает, что четыре межмолекулярных мостика участвуют в формировании его кристалла [Altre et al. 1996].
Роль домена III в закреплении рецептора
Предполагается, что домен III также участвует в закреплении рецептора и специфичности. Мутации в гипервариабельном участке домена III Cry 1 Ас (остатки от 500 до 509), привели к уменьшению закрепления токсина на BBMV белках, а также к уменьшению токсичности к М. sexta [Aronson et al,1995]. Исследователи заменяли домен III у CrylAa и Cry 1 Ас. Гибридные белки, содержащие домен III CrylAa, закреплялись на рецепторе 210 кДа М. sexta, а гибридные белки, содержащие домен III Cry 1 Ас, закреплялись на рецепторе 120 кДа моли [Lee et al, 1996, 1997].
Мутации в домене I показали, что этот домен участвует в диссоциации токсина от комплекса закрепления. Было получено несколько мутаций в домене I [Wu & Aronson, 1992]. Мутации в аЗ резко снизили токсичность токсина к М. sexta. Эксперименты по замене остатков в 92 и 93 позициях показали, что замена в позиции 92 отрицательно заряженного остатка приводит к потере токсичности. Любая замена в остатке 93, кроме положительно заряженного лизина, также приводила к потере токсичности. Поэтому можно заключить, что положительно заряженная поверхность является важной для проявления токсичности. Мутации в позиции 153 петли, которая находится между а4 и а5, тоже могут отрицательно влиять на интеграцию токсина в мембрану [Chen et al. 1995].
Изучение закрепления токсинов методом мутагенеза позволили установить следующее. Некоторые мутации в домене II (мутанты А) влияют на конкуренцию по закреплению, но не на диссоциацию. Другие мутации в домене II (мутанты В) воздействуют на диссоциацию, но не на конкуренцию по закреплению. Некоторые мутации (мутанты С) в домене I оказывают влияние на интеграцию токсина в мембрану [Chen et al. 1995; Ives et al. 2002].
Образование ионных каналов широко исследовано различными методами. Участие токсинов в этом процессе изучено с использованием нативных белков, отдельно домена I, синтетического пептида а-спиралей, а также мутаций, которые снижают образование ионных каналов (рис. 1.9 стр. 41) [Siatin et al. 1990; Chen etal. 1995].
Большинство результатов было получено на культуре ткани клеток насекомых. Работа с клетками позволила предложить коллоидно-осмотическую модель распада цитолитического действия Cry-токсинов. Эта модель предполагает, что присутствие воды с ионами приводит к набуханию клеток и в конце концов их распаду. При действии активированного токсина в мкг количествах клетки пропускают ряд электролитов, включая Сг042- уридин, и Rb+. В этих условиях Cry-токсины формируют неспецифичные ячейки. Эксперименты на культуре ткани клеток показывают, что Cry-токсины обладают способностью встраиваться в мембрану и формировать большие неспецифичные ячейки при определенных условиях, таких как высокая концентрация токсина, длительность инкубации, и относительно низкие рН [Siatin et al. 1990; Choma et al. 1990].
Несколько групп исследователей изучали формирование ионного канала при действии Cry-токсина в двухслойной плоской липидной (PLB) системе. Исследованы Cry 1 Ас и СгуЗА в PLB мембранах различного состава, и показано, что токсины формуют катионновыборочные каналы [Siatin et al. 1990]. Cry 1 Ac обычно формирует каналы 600 pS в размере (в 300 мМ КС1) и СгуЗА формирует большие каналы 4,000 pS. Каналы не формируются при рН 7, но формируются при рН 9.7. В щелочных условиях (рН 9.5) формируются катионные каналы от 100 до 200 pS. При кислых условиях (рН 6.0) образуются анионные каналы различных размеров (от 8 до 120 pS). Было высказано предположение, что рН изменяет расположение а-спиралей домена I и изменяет характер ионного канала. Роль рН, как полагают, заключается в титровании заряженных аминокислот [Choma et al. 1990].
Формирование канала в PLBS также наблюдали с фрагментом N-конца (домен I) CrylAc и СгуЗВЬ, и с пептидами спирали а5 CrylAc и СгуЗА. Спираль а7 не формирует каналы, но в присутствии а5 канал формируется, и проникновение токсина в мембраны осуществляется лучше, чем в присутствии только а5. Каналы, сформированные спиралями а5, в отличие от тех, которые сформированы полным токсином, являются небольшими (60 pS) и гемолитическими, и предпочитают кислые пузырьки фосфолипидов. Эти результаты демонстрируют, что домен I участвует в образовании ионного канала. Показано, что домен III также играет роль в формировании и функционировании ионного канала. Мутации в семнадцатой р-складке этого домена вызывали изменения в функционировании ионного канала [Crawford et al. 1988; Schwartz et al. 1997].
Основная цель белковой инженерии Cry-токсинов - это синтез улучшенных пестицидов. Мутация (HI68 R) в спирали а5 домена I Cry 1 Ас приводила к двукратному увеличению токсичности против М. sexta [Schwartz et al. 1997]. Дальнейшее исследование этого мутанта показало, что это увеличение токсичности связано с увеличением коэффициента необратимого закрепления. Мутация R204A в домене I Сгу4В приводила к тройному увеличению токсичности против москитов, возможно, в результате удаления одного из сайтов протеолитического расщепления. Несколько мутаций в домене II также приводили к повышенной токсичности. Петля 3 (481 MQGSRG486) домена II СгуЗА была изменена аланинами, в результате этого токсичность против Tenebrio molitor увеличилась в 2.4 раз. Другие мутации в петле 1 СгуЗА значительно увеличивали токсичность против T.molitor (11.4 раз); Chrysomela scripta (2.5 раз); и Leptinotarsa decemlineata (колорадского жука) (1.9 раз). Увеличение необратимого закрепления было связано с увеличением токсичности этих мутантов [Poncet et al. 1997; Wu et al. 2002].
Устойчивость насекомых к ZJf-токсинам
Известно, что более 500 видов насекомых приобрело устойчивость к одному или многим синтетическим инсектицидам, хотя ранее полагали, что насекомые не приобретают устойчивость к /-токсинам, если Bt и насекомые развиваются одновременно. В середине 1980-х годов несколько популяций насекомых различных видов и с различными уровнями устойчивости к Сгу-белкам были получены в лабораторных условиях. Список насекомых, устойчивых к индивидуальным Cry-токсинам и отобранных в лаборатории, включает индийскую моль (Plodia interpunctella), моль миндаля {Cadra cautella), колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata), листового жука хлопка (С. Scripta), пяденицу капусты (Г. пі), червя листа хлопка {Spodoptera littoralis), червя свеклы (S. exigua), листовертку-почкоеда табака (Н. virescens), европейского мотылька кукурузы {О. nubilalis), и москитов (Culex quinquefasciatus) [Tabashnik et al.1994; Ferre et al. 1995].
В 1985г. исследователи сообщили [MacGughey et al.,1985], что у популяции индийской моли, которая была обработана подвидом kurstaki от 1 до 5 месяцев, увеличивалась среднесмертильная концентрация (LC50). Лабораторные испытания с колониями, собранными из популяций, обработанных Яґ-токсином, продемонстрировали, что их устойчивость во втором поколении значительно увеличилась. В 15-м поколении насекомые обработанной колонии показали LC50 почти в 100 раз больше, чем у контрольных. Признак устойчивости является рецессивным признаком [Estada et al. 1994].
Следует отметить, что когда обработку 5 -токсинами прекращали до того, как устойчивость закрепится, уровни устойчивости насекомых уменьшались. Последующие исследования показали, что устойчивость к Cryl АЬ коррелирует с уменьшением интенсивности закрепления токсина на рецепторе. Однако, популяции насекомых, устойчивых к токсину CrylAb, проявили повышение чувствительности к другому токсину - CrylCa, который обычно не используется в составе пестицидов Bt. Это увеличение чувствительности насекомых связано с увеличением закрепления на рецепторах кишечника насекомых. Несколько колоний P. interpunctella были отобраны по устойчивости к ряду Bt токсинов -CrylAc, CrylAa, CrylBa, CrylCa, и Cry2Aa. Показано, что среднесмертильная концентрация (LC50) значительно увеличилась. Причина устойчивости заключалась в уменьшении активации протоксина в кишечнике насекомого, а не в уменьшении закрепления на рецепторе. Эксперименты с протеазами кишечника насекомых показали, что одна из двух главных протеаз (схожих с трипсином) у устойчивых форм насекомых не активна или не синтезируется. В лабораторных условиях были получены колонии Н. virescens с различными уровнями устойчивости к пестицидам CrylAb и Сгу2Аа. У этих колоний уменьшается интенсивность закрепления на рецепторе, хотя эти токсины имеют различные механизмы устойчивости [Georghiou et al. 1997; Van Rie et al. 1990].
В экспериментах с токсином CrylCa были получены устойчивые штаммы различных видов Spodoptera. Одна колония S. littoralis была устойчива к CrylCa (примерно в 500 раз), CrylDa (примерно в 7 раз) и CrylEa (примерно в 34 раза). Однако чувствительность этой колонии к токсину Cry 1 Fa не изменялась, поскольку токсины Cry 1 Fa и CrylCa взаимодействуют с различными рецепторами. Анализ наследования устойчивости в штамме S. littoralis показал, что этот признак является частично рецессивным и, вероятно, многофакторным [Oppertetal. 1997]. Известно, что процесс активации протоксина до активного токсина включает несколько этапов (см. раздел "Механизм действия"), поэтому не удивительно, что популяции насекомых могут вырабатывать различные механизмы защиты против действия токсинов. Однако, важно иметь в виду, что селекция в лабораторных условиях может значительно отличаться от селекции в природных условиях. Популяции насекомых в лаборатории характеризуются значительно более низким уровнем генетического разнообразия, чем природные популяции. Несколько лабораторных экспериментов по селекции устойчивых Р. xylostella к /-токсинам были неудачными, хотя P. xylostella является единственным известным насекомым, для которого была показана устойчивость к Zfr-токсинам в природных условиях. Возможно, генетическое разнообразие популяций, использованных в экспериментах, было слишком узкое и, таким образом, не включало популяции насекомых, имеющих аллели устойчивости. В лаборатории популяции насекомых изолируются, и, кроме того, естественная среда может содержать факторы, воздействующие на жизнеспособность или фертильность устойчивых насекомых. Механизмы устойчивости могут быть связаны с некоторыми факторами, которые в естественных условиях могут нивелироваться. Естественные враги, например, хищники или паразиты, могут влиять на развитие устойчивости насекомых к 5/-токсинам, к примеру, за счет предпочтительного воздействия на отравленных и чувствительных, чем на здоровых и устойчивых насекомых. Однако, лабораторные эксперименты по изучению устойчивости являются ценными, поскольку они позволяют установить возможные механизмы устойчивости, что облегчает изучение генетики устойчивости насекомых к Яґ-токсинам [Teisyono et al. 1997; Chaufaux etal. 1997].
