Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы: Семейства генов: организация и структура 9
1.1. Введение 9
1.2. Определение семейства генов . 10
1.3. Как образуются семейства генов? II
1.4. Гены и псевдогены 14
1.5. Размеры семейства генов, 16
1.6. Организация семейств генов 20
1.7. Интронно-экзонная организация генов, входящих в состав семейств 22
1.8. Сравнение нуклеотидных последовательностей генов, входящих в состав семейств . 27
1.9. Семейства генов, кодирующих кристаллины хруста лика глаза 36
1.9.1. Гены, кодирующие ^-кристаллины 40
1.9.2. Гены, кодирующие ^-кристаллины 43
1.9.3. Гены, кодирующие ^-кристаллины 45
1.9.4. Гены, кодирующие -кристаллины 46
1.9.5. Регуляция активности кристаллиновых генов, 47
П. Материалы и методы , 50
П.І. Объект исследования 50
П.2. Препаративное выделение плазмидной ДНК . 50
П.З. Очистка плазмидной ДНК центрифугированием в
градиенте плотности хлористого цезия 52
П.4. Расщепление ДНК с помощью рестрикционных эндонуклеаз 53
П. 5. Электрофоретический анализ ДНК 55
П.5.1. Электрофорез ДНК в агарозном геле 55
П. 5.2. Электрофорез ДНК в полиакриламидном геле . 55
П.6. Детекция фрагментов ДНК 56
П. 7. Гибрид-селектированная трансляция 57
П.7.І. иммобилизация плазмидной ДНК на нитроцеллюлозных фильтрах 57
П.7.2. Гибридизация поли(А+)РНК с иммобилизованной на нитроцеллголозных фильтрах [32Р]-ДНК 58
П.7.3. Трансляция индивидуальной мШК в бесклеточной системе ретикулоцитов кролика 59 П.8. Электрофорез продуктов трансляции в 12,5^
ПААГ-ДДС-Яа 60
П. 9. Йммунопреципитация продуктов трансляции РНК 61
П. 10. Детекция меченых полипептидов в ПААГ-ДДС-Na . 63
ЇЇ.ІЇ. Мечение ДНК in vitro с помощью метода никтрансляции 63
П. 12. Перенос РНК на нитроцеллюлозу и гибридизация с [32Р]-ДНК . 65
П.13. Мечение 3 —концов рестрикционных фрагментов ДНК с помощью Кленовского фрагмента ДНК-по-лимеразы I Е. coli 67
П. 14. Мечение рестрикционных фрагментов ДНК по 5'-
концам с помощью полинуклеотидкиназы 68
П. 15. Разделение комплементарных цепей меченых фрагментов ДНК в ПМГ 69
П. 16. Элюция меченых фрагментов ДНК из ЇЇААГ 70
П.17. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 71
П.І7.І. Химические реакции специфической модификации и расщепления меченых фрагментов ДНК 71
П.17.2. Секвенирувдие (структурные) ПААГ 73
Ш. Результаты; 75
Ш.І. Выделение и характеристика клонов, кодирущих и -кристаллины лягушки . 75
Ш.2. Рестрикционное картирование кДНК вставки клона pRt (1 ) 27 85
Ш.З. Первичная структура кДНК вставки клона pRt (1 ) 27 91
Ш.4. Анализ последовательности кДНК клона pRt (1 ) 27 98
Ш.5. Рестрикционное картирование и частичное сек-венирование кДНК вставок клонов pRt (і ) и pRt (і ) 57. Ill
Ш.6. Сравнительный анализ генов, кодирующих кристаллины. 114
Ш.7. Сравнение аминокислотных последовательностей -кристаллинов 118
Ш.8. Сравнение /-кристаллинов с другими белками. 122 Ш.9. Идентификация клона рекомбинантной кДНК, кодирувдей ^А2-кристаллин 128
Ш.9.І, Рестрикционное картирование кДНК вставки клона pRt (1 ) 297 128
Ш.9.2. Нуклеотидная последовательность кДНК вставки клона pRt (l ) 297 130
ШЛО. Сравнение генов, кодиррщих
ШЛІ. Наличие частичной гошлогии Аз-кристаллинов с другими белками . 145
IV. Обсуждение результатов 149
Выводы
- Определение семейства генов
- Сравнение нуклеотидных последовательностей генов, входящих в состав семейств
- Препаративное выделение плазмидной ДНК .
- Выделение и характеристика клонов, кодирущих и -кристаллины лягушки
Введение к работе
Кристаллины - это структурные белки хрусталика глаза позвоночных животных. Изучение кристаллинов имеет большое теоретическое и практическое значение, так как изменение этих белков в хрусталике приводит к его помутнению, следствием чего является образование катаракт и потеря зрения. Кроме того, система кристаллинов является удобной моделью для исследования ряда фундаментальных проблем молекулярной биологии и биологии развития, таких как дифференцировка, трансдифференцировка, эмбриональная индукция, старение, молекулярная эволюция. Этим объясняется большой интерес к кристалликам, которые интенсивно исследуются на протяжении последних 20-ти лет,
О генах, кодирующих кристаллины, до последнего времени было известно мало, несмотря на то, что исследование генов позволяет ставить и успешно решать ряд принципиально важных вопросов, ответы на которые невозможно или трудно получить на уровне исследования белков. Развитие методов рекомбинантной ДНК позволяет выде -лять и исследовать гены, кодирующие кристаллины, В настоящее время такие исследования ведутся в ряде лабораторий мира.
Настоящая диссертация является частью исследований, проводимых в группе молекулярных основ генетических процессов Института биологии развития им,Н.К.Кольцова АН СССР , руководимой доктором биологических наук Гаузе Г,Г, и посвященных изучению генов, кодирующих кристаллины хрусталика глаза лягушки Rana temporaria.
Целью настоящей работы явилось выделение и характеристика клонированных кДНК-генов, кодирующих различные классы кристаллинов хрусталика глаза лягушки. Экспериментальной основой для решения поставленных задач явилась совокупность методов генной инженерии, включающая молекулярную гибридизацию нуклеиновых кислот, иммунохимическую технику, рестрикционное картирование, определение нуклеотидной последовательности ДНК.
Результатом настоящей работы явилось выделение клонированных кДНК-генов, кодирующих полипептиды Х- и -кристаллинов, доказательство множественности генов, кодирующих -кристаллины лягушки, определение первичной структуры двух генов, один из которых кодирует -кристаллин, а другой о -кристаллин.
Детальный анализ полученных структурных данных позволил сделать выводы о структуре мРНК -Я-кристаллина и А2-кристалли-на, о темпе эволюции этих кристаллиновых генов, высказать предположение о механизме возникновения различных кристаллиновых генов в эволюции, а также выявить гомологию кристаллинов с полипептидами, принадлежащими к другим классам белков.
Определение семейства генов
Изучение структуры и механизма регуляции активности индивидуальных генов представляет собой одну из центральных и наиболее актуальных проблем молекулярной биологии, генетики и биологии развития. Огромный прогресс в этой области был достигнут в связи с использованием методов генной инженерии.
За последние десять лет об организации генов мы узнали больше, чем за весь предшествующий период развития науки, особенно это касается генов эукариот. К настоящему времени выделены сотни генов из широкого круга организмов, установлена первичная структура многих из них, выявлены некоторые закономерности организа -ции генов.
Анализ данных, полученных к настоящему времени в отношении индивидуальных генов, позволяет сделать ряд обобщений относительно организации генетического аппарата эукариотической клетки. Один из выводов состоит в том, что многие гены представлены в геноме в нескольких копиях и формируют семейства генов.
Такой принцип прослеживается в частности для генов, кодирующих основные классы клеточных РНК (рРНК и тРНК), и для многих структурных генов, принадлежащих к "уникальным" генам. Открытие того, что многие гены существуют в геноме как "семейства" ставит вопрос о том, почему существует такой принцип организации генов. Является ли он почему-то выгодным для клетки? Каковы принципы организации генетического материала, следствием которых является наличие в геноме групп генов, формирующих семейства?
Как организованы семейства генов, являются ли принципы их организации сходными или различными для различных семейств? Как возникли семейства генов в эволюции? Как происходит функционирование семейств генов? Все или только некоторые из генов, входящих в состав семейства являются способными к экспрессии?
Вот лишь некоторые из тех вопросов, которые встали перед исследователями в связи с обнаружением существования семейств генов.
Гены, кодирующие кристаллины хрусталика глаза, которые являются предметом исследования в данной работе, также представлены семействами, но данные о них немногочисленны. Поэтому в обзоре литературы мы решили основное внимание уделить рассмотрению имеющихся данных по общей организации семейств генов, используя главным образом данные по относительно хорошо изученным семействам актаГновых и тубулиновых генов.
В 1975 году Худ и соавторы (Hood et al., 1975) определяли семейство генов как группу нуклеотидных последовательностей, обладающих следующими свойствами: множественность, сцепленность, структурная гомология, связанные или перекрывающиеся фенотипичес-кие функции. Однако понятие семейства генов за последние годы претерпело некоторую эволюцию и сегодня доминирует более широкое, накладывающее меньше ограничений, определение семейства генов. Семейство генов теперь часто определяют как группу сходных нуклеотидных последовательностей, имеющих общее эволюционное происхождение, которые могут быть как сцеплены, так и несцеплены в геноме (McCarthy, 1980; McAllister and Sanders, 1980). ГОМОЛОГИЯ может существовать в структурных или регуляторних частях генов семейства, или же и в тех и других. Это определение не накладывает принципиальных ограничений на размер области гомологии и на степень гомологии нуклеотидных последовательностей.
Последнее определение, на наш взгляд, также несовершенно и, вероятно, при отнесении генов к семейству в ряде случаев целесообразно использовать, по крайней мере, некоторые элементы более старого определения.
В случае семейств генов, кодирующих актины и тубулины,проблем с отнесением генов к соответствующему семейству не возникает, так как эти гены консервативны в эволюции и проявляют высокую степень гомологии в структурной части (Hanukoqlu et al., 1983).
Процессы, которые приводят к образованию семейств генов в эволюции, в настоящее время еще далеко не изучены, однако, основные положения эволюционной истории семейств генов должны включать этапы, схематично изображенные на рисЛ, взятом из работы Мак-Карти ( McCarthy, 1980).
Начальным этапом образования семейства является дупликация одиночного гена. Это событие происходит с низкой частотой. После того, как произошла первая дупликация, дальнейшее увеличение числа генов в семействе может происходить быстрее в результате актов неравного кроссинговера. Следствием является формирование тандемного семейства генов, то есть семейства,у которого все или большинство генов локализованы рядом и формируют кластер генов. В ряде случаев вслед за первой дупликацией или на последующих стадиях увеличения числа копий генов может происходить транслокация гена в другие области генома.
Сравнение нуклеотидных последовательностей генов, входящих в состав семейств
Для большинства семейств генов характерен какой-то определенный тип организации: тандемный или дисперсный. Так, глобино-вые гены практически у всех изученных видов формируют два кластера генов - -глобиновый и /5-глобиновый (Лимборская, 1982). Тандемная организация присуща также семейству гистоновых генов ( Kedes, 1979; Hentschel and Birnstiel, 1981), ГЄНОВ малых бел-KOB ТЄПЛОВОГО шока Drosophila melanogaster ( Wadsworth et al., 1980; Craig and McCarthy, 1980).
Напротив, гены актинового и тубулинового семейств у большинства видов диспергированы по различным хромосомам ( Firtei,i98I; Fyrberg et al., 1980; Cleveland et al., 1981). Предполагается даже, что такая дисперсная организация характерна для семейств генов, рано возникших в эволюции (Cowan et al., 1981).
Однако правило единой (тандемной или дисперсной) организации генов того или иного семейства не является абсолютным. Так, в то время как для большинства видов характерна дисперсная организация семейства тубулиновых генов у Trypanosoma , например, гены об- и Л-тубулинов физически сцеплены друг с другом и образуют тандемные повторы размером 13-17 копий на гаплоидный ге -НОМ (Thomashow et al., 1983).
У морского ежа семейства - и /5-тубулинов довольно мно-гочислены (10-20 копий на геном), для которых характерной считается дисперсная организация. Однако некоторые из генов семейства -тубулинов сцеплены друг с другом, как и некоторые из генов семейства Д-тубулиН0В у ЭТОГО вида (Alexandraki and Rud erman, 1981).
Ранее отмечалось, что у большинства позвоночных глобиновые гены существуют в виде двух независимых кластеров ( 1- и/3 ). В то же время у Xenopus laevis наблюдается сцепление некоторых как d- так и уЗ-глобиновых генов (Jeffreys et al., 1980; Patient et al., 1980).
Таким образом, дисперсная и тандемная организации семейств могут как бы дополнять или переходить друг в друга, что было проиллюстрировано на нескольких примерах Чайлдсом и соавторами ( Ghiids et al., 1981). Ими было показано, что гистоновые гены морского ежа и рибосомные гены Xenopus laevis, которые дают классические примеры тандемной организации семейств, представлены в геноме не только в кластерах, но и одиночными копиями, рассеянными по геному. Такие копии получили название орфонов ( orphon ). Локализация орфонов в популяции полиморфна, в отличие от локализации соответствующих кластеров, а темп эволюции орфонов превосходит темп эволюции генов в пределах кластера. Авторы предположили, что сравнительно высокая частота орфонов в тестированных ими семействах может указывать на их функциональную роль и на то, что орфоны создают потенциал для образования новых белков, синтез которых контролируется различными регуляторними элементами.
Возможно некоторые семейства, которые являются дисперсными у большинства видов, например, семейства актиновых и тубулиновых генов, исходно были организованы тандемно. В пользу такого предположения, в частности, говорит факт существования тандемной организации семейства тубулиновых генов у Trypanosoma (Thomashow et al., 1983).
Говоря о функциональном значении организации семейства генов,следует отметить, что тандемная организация в большей степе ни свойственна семействам генов, члены которых координированно экспрессируются. В качестве примера можно привести семейство гис-ТОНОВЫХ генов (Kedes, 1979; Hentschel and Birnstiel, 1981) И СЄМЄЙСТВО МаЛЫХ белков ТеПЛОВОГО ШОКа Drosophila melanogaster ( Wadsworth et al., 1980).
Дисперсная организация более характерна для семейств генов с независимым контролем индивидуальных генов в пределах семейства; Например, В Семействе аКТИНОВЫХ ГеНОВ (Fyrberg et al,, 1980),
Препаративное выделение плазмидной ДНК .
Объектом исследования служили клоны рекомбинантной кДНК, выделенные из клонотеки, описанной ранее (Козлов и др., 1980; То-marev et al., 1982).
Клонотека представляла собой коллекцию клонов, содержащих последовательности поли(А+)РНК, выделенной из хрусталика глаза лягушки Rana temporaria . Клонирование ДНК комплементарной по-ли(А+)РНК осуществлялось по Pst I сайту плазмидного вектора pBR 322 с помощью метода dG-dC коннекторов. В качестве хозяина использовали штамм клеток Е. СОІІ НВІ0І. (Birnboim and Doly, 1979) Реактивы и растворы: Среда УТБ: % дрожжевой экстракт 10$ бактотриптон % NaCL , рН 7,5 ТЭГ-буфер: 25 мМ трис-нсь, рН 8,0 10 мМ ЭДТА 50 мМ глюкоза НаОН-ДЦС -Na: 0,2 М NaOH , J% ДЦС -Na Раствор РНК-азы:РНК-аза I мг/мл в 10 мМ трис-НСЪ , рН 8,0 (прогретый в течение 10 мин при Ю0С) 13-буфер: 50 мМ трис-HCL , рН 8,0, 10 мМ ЭДТА Фенол - свежеперегнанный, насыщенный 50 мМ трис-нсь рН 8, Процедура:
Все объемы растворов указаны для препаративного выделения плазмидной ДНК из I литра бактериальной культуры.
1. Бактериальный клон высевали в колбу с 10 мл среды УТБ с тетрациклином (10 мкг/мл) и выращивали ночь при 37С.
2. По I мл ночной культуры переносили в колбы с 200 мл среды УТБ и растили в термостатированной качалке при 37С до 0Д55д=0,6-0,8 (10 кл/мл), что обычно занимало 2-3 часа. В среду добавляли хлорамфеникол до конечной концентрации 170 мкг/мл и продолжали инкубацию в течение 16-18 часов.
3. Культуру охлаждали во льду, клетки осаждали центрифугированием при 10000 g , 4С, 10 мин. Осадки суспендировали в 50 мл ТЭГ-буфера (4С) и осаждали при тех же условиях.
4. Осадки ресуспендировали в 20 мл ТЭГ-буфера с лизоцимом (3 мг/мл) и оставляли на 30 мин во льду. К лизату добавляли 40 мл раствора NaOH-ДЦС -На , перемешивали и инкубировали 5 мин во льду. Затем добавляли 30 мл Зм На -ацетата рН 4,8 (4С), перемешивали и оставляли на I час во льду. Хромосомную ДНК осаждали центрифугированием при 40000 g в течение 20 мин.
5. К супернатанту добавляли раствор РНК-азы до конечной концентрации 25 мкг/мл и инкубировали I час при 37С.
6. Плазмидную ДНК осаждали в течение ночи при 4С полиэтилен-гликолем (м.в. 6000), добавленным до концентрации 10$. ДНК осаждали центрифугированием при 8000 g в течение 15 мин на холоду. Осадок растворяли в 10 мл ТЭ-буфера.
7. Раствор ДНК дважды депротеинизировали фенолом, следы фенола удаляли трехкратной экстракцией водонасыщенным эфиром.
8. К раствору ДНК добавляли З М На -ацетат до конечной концентрации 0,3 М и осаждали ДНК тремя объемами этанола. ДНК пере осаждали еще раз и промывали 70$ этанолом. Осадок ДНК растворяли в 10 мМ трис-нсь , рН 7,5, I мМ ЭДТА и хранили при -20С.
Выход ДНК составлял 500-1000 мкг из одного литра бактериальной культуры. Количество ДНК определяли спектрофотометрически, I ОД2о соответствовала 50 мкг ДНК.
Препараты плазмидной ДНК на этой стадии очистки пригодны для секвенирования, хотя мы, как правило, подвергали их дальнейшей очистке центрифугированием в градиенте плотности CsCL с ЭтБр. При выделении препаратов для гибрид-еелектированной трансляции из процедуры выделения исключали этап обработки препарата FHK-азой,
Ковалентно-замкнутую форму ДНК выделяли путем цльтрацентри-фугирования препаратов плазмидной ДНК, выделенных как описано в разделе П.2, в градиенте плотности CsCb с ЭтБр. Процедура:
1. В полиалломерные пробирки от ротора Ті -50 вносили по 3 мл (50 мкг) раствора ДНК в ТЭ-буфере с CsCL (плотность -1,3722 мг/мл, индекс рефракции - 1,4061) и 0,2 мг/мл ЭтБр. Перистальтическим насосом или пипеткой на этот раствор наслаивали равный объем раствора CsCL в ТЭ-буфере (плотность - 1,338, индекс рефракции - 1.3848) и 0,2 мг/мл ЭтБр.
2. Пробирки доверху заполняли вазелиновым маслом и центрифугировали в роторе Ті- 50 на ультрацентрифуге "Beckman " в течение 15 часов при 40000 g и 15С.
3. Пробирки освещали ультрафиолетовым светом и зону, соот -ветствующую ковалентно-замкнутой форме ДНК, отбирали шприцом, прокалывая пробирку сбоку.
4. ЭтБр удаляли трехкратной экстракцией раствора ДНК изоами-ловым спиртом, насыщенным CsCL . Раствор ДНК диализовали против 10 мМ трис-нсъ , рН 7,5; I мМ ЭДТА в течение ночи при 4С.
Выделение и характеристика клонов, кодирущих и -кристаллины лягушки
Ранее в лаборатории была получена и частично охарактеризо-зована клонотека рекомбинантных кДНК (Козлов и др., 1980; тота-rev et ai., 1982а), содержащих нуклеотидные последовательности мИЖ хрусталика глаза лягушки Rana temporaria , Полученная клонотека (КЛОНЫ сериИрИТ (I)- plasmid, Rana temporaria, lens ) Содержала несколько тысяч независимых рекомбинантов. Длина кДНК вставок в различных клонах составляла от 200 до 1200 нуклеотид-ных пар.
Для решения задачи по выделению рекомбинантных клонов, кодирущих различные классы криоталлинов, мы провели предварительное разбиение клонотеки на классы согласно критерию наличия или отсутствия сайтов расщепления для нескольких редкощепящих эндонук-леаз. Такой подход был успешно использован ранее другими авторами при классификации клонов из библиотеки кДНК хориона тутового шелкопряда ( Sim et al., 1979),
Для классификации из клонотеки было произвольно отобрано 25 клонов, содержащих кДНК вставки размером более 400 пар нуклеотидов по данным гель-электрофореза.
Поскольку молекулярные размеры полипептидов, входящих в состав криоталлинов, находятся в диапазоне от 17-18 кД до 35 кД, что соответствует размерам мШК от 600 до 1200 нуклеотидов, можно было предположить, что в кДНК вставках длиной более 400 пар нуклеотидов содержится значительная часть структурной информации о кристаллинах лягушки.
Для характеристики отобранных 25 клонов был использован гидролиз редкощепящими рестриктазами ECO RI, Hind НІЙ ВагаНІ. Следует отметить, что расщепление ДНК этих клонов рестриктазой Pat I, по сайту которой проводилось клонирование выявило, что кДНК вставка может быть выщеплена во всех отобранных клонах. Таким образом, в ходе клонирования произопша регенерация сайта для рестриктазы. Pst I во всех исследованных клонах.
Результаты характеристики выборки рекомбинантных клонов с помощью указанных реотриктаз приведены в таблице 10.
В результате среди исследованных 25 рекомбинантных клонов было выявлено пять классов, отличающихся друг от друга по наличию сайтов расщепления для трех использованных рестрикционных эндонуклеаз. Количество клонов в разных классах было неодинаковым. Наиболее многочисленным был класс І. В кДНК клонов, относящихся к этому классу, не содержатся сайты расщепления ни для одной из использованных рестриктаз. Наименее многочисленным был класс П. В кДЖ клонов этого класса, не содержатся сайты расщепления для рестриктаз Hind Ш и ваш ні, но содержится сайт рас -щепления для рестриктазы Есо RI . Клонов, кДНК которых содержала бы сайты расщепления для всех трех использованных рестриктаз, выявлено не было.
Очевидно, что при увеличении количества использованных рестриктаз, можно было бы получить больше различных классов. Однако на этом этапе работы важно было получить несколько отличавшихся друг от друга групп клонов и проведенная классификация представлялась нам достаточной.
В этих экспериментах не проводилось определение количества сайтов расщепления для каждой из рестриктаз в данных клонах; несколько сайтов, расположенных рядом, при использовании разделения рестрикционных фрагментов с помощью электрофореза в агароз геле ном огли бы выглядеть как один сайт.
Данные более подробного картирования кДНК некоторых из этих клонов приведены ниже в разделах Ш.2, Ш.5 и Ш.9,
Из каждого рестрикционного класса мы отобрали для идентификации по одному клону, а из У класса - два клона. Данные об этих клонах приведены в таблице II.
Идентификацию клонов проводили с помощью гибридизационно-трансляционного теста (Ricciardi et al., 1979). Шгазмидную ДНК клонов, иммобилизованную на нитроцеллюлозных фильтрах, гибриди-зовали с поли(А+)РНК в условиях, описанных в разделе П.7.2. мШК, вошедшую в состав гибрида, элюировали с фильтров и использовали в качестве матрицы для трансляции в бесклеточной системе из ретикулоцитов кролика с [Зн] -лейцином. Полученные меченые полипептиды анализировали с помощью электрофореза в ЇЇААГ-ДДС-Na с последующей флуорографией. В некоторых случаях меченые поли
По данным электрофоретического разделения продуктов трансляции тотальной поли(А+)ИЖ хрусталика глаза лягушки детектировался синтез не менее семи полипептидов с молекулярными весами от 17-18 кД до 35-36 кД. Эти результаты приведены на рис.4. Ранее было показано (Томарев и др., 1981), что шесть из них осаждаются иммунным igG к тотальным кристаллинам (см.рис.46) и, таким образом, являются полипептидами, входящими в состав этих белков. Полипептид размером 35-36 кД в этих экспериментах не осаждался IgG антисыворотки к тотальным кристаллинам, однако, позже в нашей лаборатории С.В.Лучиным был получен иммунный IgG к кристаллинам лягушки, который осаждал этот полипептид. Отсутствие осаждения данного полипептида иммунным IgG к тотальным кристаллинам в ранних экспериментах объясняется возможно его низкой иммуногенностью.
![Идентификация и характеристика генов, влияющих на поддержание и фенотипическое проявление прионоподобного детерминанта [ISP+], у дрожжей Saccharomyces cerevisiae](/i/i/4278/150135.png "Идентификация и характеристика генов, влияющих на поддержание и фенотипическое проявление прионоподобного детерминанта [ISP+], у дрожжей Saccharomyces cerevisiae Аксенова Анна Юрьевна")
