Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы. серотониновая система мозга и защитное поведение. генетические аспекты 11
1.1. Общие представления о серотонииовой системе мозга млекопитающих . 11
1.2. Триптофангидроксилаза - ключевой фермент биосинтеза серотонина. Генетическая регуляция активности ТПГ. 22
1.3. Генетические и молекулярные основы серотонииовой регуляции защитного
поведения. 35
1.3.1. Основные подходы к анализу наследования поведения, 37
1.3.2. Межсамцовая агрессия 38
1.2.1. Агрессия по отношению к человеку 48
1.3.1. Реакция активного избегания 50
1.3.2. Реакция замирания (каталепсия) 52
ГЛАВА 2. Материалы и методы. 57
2.1. Животные. 57
2.1.1. Условия содерэюания экспериментальных животных 51
2.1.2. Гибридологических анализ 59
2.2. Поведенческие тесты, 60
2.2.1. Межсамцовая агрессия мышей. 60
2.2.2. Тестирование животных на выраженность каталепсии. 61
2.2.3. Тревожность у крыс. 62
2.3. Определение активности ТПГ в мозге. 64
2.3.1. Флюориметрический метод. 65
2.3.2. Определение активности ТПГ с помощью жидкостной хроматографии
высокого давления 68
2.4. Молекулярнобиологические методы. 69
2.4.1. Выделение геномной ДНК. 69
2.4.2. Выявление C1473G полиморфизма в гене tph2 мышей. 69 2.4..3. ПЦР с полиморфнымимикросателлитиымимаркерами. 70
2.5. Статистическая оценка полученных данных 71
2.5.1. Проверка гипотезы о моиогеппом наследовании. 71
2.5.2. Проверка гипотезы о сцеплении альтернативных признаков с неполной
пенетрантпостью. 73
ГЛАВА 3. Генетический контроль активности тпг в мозге мышей . 75
3.1. Межлинейные различия в активности ТПГ. 75
3.2. Гибридологический анализ наследования активности ТПГ в мозге. 81
3.3. Ассоциация C1473G полиморфизма в 11-ом экзоне гена iph2 с активностью ТПГ
в мозге мышей. 91
3.4. Роль обратимого фосфорилировапия в определении наследственных различий в активности ТПГ в головном мозге мышей. 92
ЗАКЛЮЧЕНИЕ. 94
ГЛАВА 4. Генетический контроль спонтанной агрессивности мышей и ее ассоциация с геном iph2. 95
4.1. Межлииейиые различия в спонтанной агрессивности мышей . 96
4.2. Наследование интенсивности и уровня спонтанной агрессии самцов мышей, 97
4.3. Связь спонтанной агрессии самцов мышей с геном tph2. 99
Заключение. 101
ГЛАВА 5. Активность ТПГ в мозге животных с наследственными различиями в агрессии на человека . 103
5.1, Изменение активности ТПГ в мозге серебристо-черных лисиц при доместикации. 103
5.2. Влияние селекции на отсутствие агрессии на человека на активность ТПГ в мозге серых крыс-пасюков. 106
Заключение.
- Общие представления о серотонииовой системе мозга млекопитающих
- Условия содерэюания экспериментальных животных
- Межлинейные различия в активности ТПГ.
- Межлииейиые различия в спонтанной агрессивности мышей
Введение к работе
Актуальной проблемой генетики поведения, нейрогенетики и нейробиологии является изучение молекулярного механизма развертывания информации, записанной в молекуле ДНК, в сложный поведенческий признак (Бензер, 1975; Crabbe, 1999; McClearn, 1999; Boguski, Jones, 2004). В настоящее время не вызывает сомнения ключевая роль медиаторов головного мозга в регуляции поведения животных и человека в норме и патологии. Одним из классических медиаторов является серотонин (5-гидрокситриптамин). Серотониновые нейроны лидируют по числу синаптических контактов (Jacobs, Azmitia, 1992). Кроме того, медиатор действует на 14 различных типов рецепторов, сопряженных со всеми основными механизмами внутриклеточной трансдукции сигнала (Saudou, Hen, 1994; Barnes, Sharp, 1999). Эти два фактора определяют удивительную полифункциональность серотонина - способность его контролировать большое количество различных процессов в ЦНС и форм поведения (Saudou, Hen, 1994; Попова, Куликов, 2003). С помощью фармакологических методов показано участие серотониновой системы в регуляции агрессивного, полового, пищевого и других форм поведения (Попова и др., 1978; Jacobs, Fornal, 1995; Lucki, 1998). Интерес к серотониновой системе мозга обусловлен еще и тем, что трансмембранный транспортер серотонина (Blakely et а!., 1994, 1998; Blakely, 2001) и рецепторы 5-HTja и 5-НТгА типов (Lucki et al., 1994; Blier, de Montigny, 1994; Eison, Mulins, 1996; Pineyro, Blier, 1999) вовлечены в молекулярный механизм действия антидепрессантов и анксиолитиков.
Ключевым ферментом биосинтеза серотонина является триптофангидроксилаза (1111), катализирующая гидроксилирование триптофана в 5-гидрокситриптофан, -первую и лимитирующую стадию биосинтеза медиатора (Fitzpatrick, 1999).
В 2003 году было показано существование двух изоформ ТПГ - ТПГ-1 и 1111-2, которые кодируются генами tphl и tph2 (Walther et al., 2003). Изоформа, кодируемая геном tphl, экспрессируется только в периферических тканях, эпифизе и тучных клетках. В мозге синтез серотонина осуществляется изоформой, кодируемой геном tph2 (Walther et al., 2003; Zhang et al., 2004).
Открытый в 2004 году ген tph2 сразу же стал предметом интенсивного изучения. Были выявлены около 25 различных однолокусных мутаций в гене tph2 человека и показана ассоциация некоторых из этих мутаций с предрасположенностью к аффективным психозам (Breidenthal et al., 2004; De Luca et al., 2004; Harvey et al., 2004, 2004; Zill et al., 2004; Zhang et al., 2005). Однако до настоящего времени связь этих мутаций с активностью ТПГ в мозге установлена не была.
Несмотря на ключевую роль ТПГ в биосинтезе серотонина и в механизме передачи сигнала в серотониновой синапсе и на постулируемую связь изменений активности фермента с наследственными изменениями (и нарушениями) поведения, очень мало было известно о генетическом контроле активности фермента в мозге. Имеющиеся публикации демонстрируют только наличие межлинейных различий в активности фермента у мышей (Barchas et al., 1974; Diez et al., 1976; Natali et al., 1980; Knappetal., 1981).
Ген, кодирующий ТПГ в мозге, традиционно рассматривается как ген-кандидат, вовлеченный в регуляцию поведения и психики (Nielsen et al., 1994; 1996; Veenstra-VanderWeele et al., 2000; Gingrich, Hen, 2001, De Luca et al., 2004; Zill et al., 2004; Zhang etal.,2005).
Особое внимание привлекает возможная ассоциация ТПГ с выраженностью защитного поведения. Защитное поведение представляет собой комплекс эволюционно закрепленных врожденных реакций на неодушевленные и одушевленные угрожающие стимулы внешней среды. Можно выпеттить тяк^е рязигтипигнтги зяіттитнпго поведения как защита самцом территории (или социа тъяоа йОДИвМДдаОДяфдеванная страхом
* SFSXttfc
оборонительная агрессия, реакция активного избегания и реакция замирания (затаивание) (Dixon, 1998; Popova, 1999; Попова, 2004).
Генетико-молекулярные механизмы межеамцовой агрессии традиционно изучают на линейных мышах и гибридах (Maxson, 1992; 1999) Для изучения наследственных механизмов вызванной страхом агрессии на человека бьии созданы две модели доместикации - на серебристо-черных лисицах (Трут, 1978; 1981) и серых крысах-пасюках (Беляев, Бородин, 1982; Никулина и др., 1985) Классической моделью изучения реакции активного избегания являются Римские линии крыс RHA и RLA, различающиеся по выраженности реакции активного избегания в челночной камере (Overstreet, 1992) Наконец, для исследования генетического контроля реакции замирания (каталепсии) была создана линия крыс ГК (Колпаков, 1990; Kolpakov et al, 1996) Другой моделью естественной каталепсии является щипковая (pinch-induced) каталепсия мышей (Amir et al., 1981; Ornstein, Amir, 1981).
Цель и задачи исследования. Основной целью исследования было изучение закономерностей генетического контроля активности ТПГ в мозге и выяснение роли фермента в генетическом и молекулярном механизмах регуляции выраженности различных форм защитного поведения. Были поставлены следующие задачи-
-
Изучить закономерности генетического контроля активности ТПГ в мозге мышей.
-
Исследовать генетический контроль межеамцовой агрессии у мышей и связь межеамцовой агрессии с активностью ТПГ в мозге.
3. Проанализировать участие ТПГ в процессе доместикации серебристо-черных
лисиц и серых крыс-пасюков.
4. Исследовать роль ТПГ мозга в механизме регуляции генетически
детерминированных различий в проявлении реакции активного избегания у крыс
5. Изучить генетический контроль каталепсии мышей.
6 Выяснить связь ГПГ с наследственно детерминированными различиями в предрасположенности к каталепсии мышей и крыс.
Научная новизна. Были выявлены два типа наследственной изменчивости активности ТПГ в мозге мышей' конститутивный и регуляторний Конститутивная изменчивость обусловлена C1473G полиморфизмом в 11-ом экзоне гена tph2, а регуляторная изменчивость - наследственным полиморфизмом по степени фосфорилирования фермента
Выявлена ассоциация интенсивности драк с полиморфизмом C1473G в гене tphl мышей. Интенсивность драк была снижена у мышей с генотипом 1473G/G по сравнению с животными 1473С/С.
Установлено увеличение активности ТПГ в среднем мозге серебристо-черных лисиц и крыс-пасюков в процессе доместикации.
Выявлена ассоциация слабой выраженности реакции активного избегания со сниженной активностью ТПГ в среднем мозге крыс.
Показана связь наследственной предрасположенности к каталепсии с повышенной активностью ТПГ в стриатуме . мышей и крыс.
Ген, определяющий высокую предрасположенность к каталепсии, локализован в дистальном фрагменте хромосомы 13 мыши.
Теоретическая и практическая значимость работы. Основным вкладом данного исследования в генетику и нейрогенетику поведения является экспериментальное доказательство генетической ассоциации активности ТПГ в мозге с наследственно детерминированным полиморфизмом по вьфаженности различных форм защитного поведения. Другим важнейшим теоретическим положением, продемонстрированным в работе, является экспериментальное доказательство того, что в основе селекции на выраженность защитного поведения лежит отбор генетических факторов, регулирующих активность ТПГ в головном мозге.
Показано существование связанной с геном tph2 (конститутивной) и не связанной с ним (регуляторной) изменчивости активности ТПГ в мозге. Установлена связь конститутивной и регуляторной изменчивости с наследственным полиморфизмом основных типов защитного поведения. Выявление ассоциации C1473G полиморфизма в гене tph2 с интенсивностью драк у самцов мышей имеет существенное эвристическое значение для понимания молекулярно-генетического механизма регуляции агрессии и жестокости. Показана ассоциация наследственно детерминированных особенностей агрессии на человека, активного избегания и каталепсии с регуляторной, но не конститутивной изменчивостью ТПГ в мозге. Полученные данные указывают на существенную роль генов, контролирующих посттрансляционную модификацию ТПГ, в регуляции наследственного полиморфизма по выраженности этих форм защитного поведения.
Обнаружена линия мышей СВА с чрезвычайно высокой предрасположенностью к каталепсии. Эта линия может использоваться как модель для изучения генетико-молекулярных механизмов естественной защитной реакции замирания. Разработан чувствительный флуориметрический метод измерения активности ТПГ в тканях.
Положения, выносимые на защиту.
-
Выявлены два типа наследственной изменчивости активности ТПГ в мозге: конститутивный и регуляторний Конститутивная изменчивость обусловлена C1473G полиморфизмом в 11-ом экзоне гена tph2, кодирующего ТПГ. Регуляторная изменчивость связана с различиями в механизме обратимого фосфорилировании уже синтезированных молекул фермента.
-
Активность ТПГ в мозге ассоциирована с наследственной изменчивостью по выраженности различных форм защитного поведения у разных видов животных. Конститутивная изменчивость активности фермента ассоциирована с интенсивностью межсамцовой агрессии мышей. Регуляторная изменчивость - с выраженностью агрессии на человека, реакцией активного избегания и каталепсией.
-
Изменчивое гь порога (уровня, предрасположенности) и интенсивности (числа драк) межсамцовой агрессии мышей в значительной степени определяется генетическими факторами. Однако эти два показателя межсамцовой агрессии регулируются разными генетическими механизмами. В то время как доминирует низкий порог агрессивной реакции, интенсивность драк имеет промежуточный тип наследования. Обнаружена ассоциация числа драк между самцами мышей с полиморфизмом C1473G в гене tph2.
-
Селекция серебристо-черных лисиц и серых крыс-пасюков на отсутствие агрессии на человека (доместикация) приводит к сходному увеличению активности ТПГ в среднем мозге.
-
Наследственно детерминированное отсутствие реакции активного избегания у крыс линии RLA ассоциировано со сниженной активностью ТПГ в среднем мозге.
6. Предрасположенность к реакции замирания (каталепсии) у мышей
контролируется в основном геном, локализованным в дистальном фрагменте
хромосомы 13.
7. Наследственная каталепсия у мышей каталептической линии СВА и крыс линии ГК, селекционированной на каталепсию, сопровождается локальным увеличением активности ТПГ в стриатуме.
Апробация работы. Результаты данной работы были представлены и обсуждены на Ученых Сессиях Института цитологии и генетики в 1988, 1991, 2000, 2003 годах, Всесоюзной конференции "Химия, биохимия и фармакология производных индола" (Тбилиси, 1986), Всесоюзной конференции «Медиаторы в генетической регуляции поведения» (Новосибирск, 1986), XV съезде Всесоюзного физиологического Общества им. И.П. Павлова, (Ленинград, 1987), 5-ом съезде ВОГИС (Москва, 1987), конференции "Медиаторы и поведение" (Новосибирск, 1988), 3 школе-семинаре по генетике и селекции животных (Бийск, 1989), Всемирном конгрессе по психиатрической генетике (Новый Орлеан, 1993, США), 4-ой Международной конференции Общества Нейробиологии Поведения (Сантьяго де Компостела, Испания. 1995), XIX съезде Российского физиологического Общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004) и на конференции Российского нейрохимического общества «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005).
Публикации. Материал диссертации изложен в 54 публикациях в отечественных (31) и международных (23) реферируемых журналах
Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, описание используемых методик, 5 глав результатов исследования, общее обсуждение, выводы, список цитируемой литературы (771 работа) и список публикаций автора по теме диссертации (54 работы) Работа изложена на 221 страницах машинописного текста, содержит 46 рисунков и 21 таблицу.
Общие представления о серотонииовой системе мозга млекопитающих
Серотониновая система мозга представлена совокупностью нейронов, способных синтезировать и секретировать серотонин (5-гидрокситриптамии, 5-НТ). Она является одной из филогенетически наиболее древних и консервативных медиаторных систем мозга и уже хорошо развита у круглоротых и других примитивных позвоночных (Parent, 1981).
У млекопитающих серотониновые нейроны локализованы в ядрах шва среднего мозга и организуются в 9 кластеров - В1-В9 (Dahlstrom, Fuxe, 1964; Fuxe, 1965), которые по расположению, направлению проекций и по времени появления в онтогенезе разделяются на две группы: переднюю и заднюю (Jacobs, Azmitia, 1992) (Рис.1).
Серотониновые нейроны передней группы расположены ростральиее, посылают преимущественно восходящие проекции и появляются в онтогенезе раньше, чем нейроны задней группы (Wallace, Lauder, 1983; Jacobs, Azmitia, 1992). Заднюю группу составляют 4 кластера (В1 - В4), которые организуются в 3 ядра: п. raphe pallidus (В1 и В4), п. raphe obscums (В2) и п. raphe magnus (ВЗ). Серотониновые нейроны, локализованные в задней группе кластеров, проецируются в продолговатый и спинной мозг. Важнейшей функцией нисходящей серотониновой системы является регуляция активности мотонейронов спинного мозга и поведенческих стереотипов, таких как, рефлекс мокрой собаки (wet dog shake) (Jacobs, Fomal, 1995). Переднюю группу составляют 5 кластеров (В5 - В9), которые организуются в 4 ядра: п. caudal linear (В8), п. raphe medianus (В8 и В5), п. raphe dorsalis (В7 и В6) и В9. N. raphe dorsalis является самым крупным скоплением серотониновых нейронов и включает около половины всех серотониновых нейронов мозга (Wiklund et al., 1981, цит. по Jacobs, Azmitia, 1992). Серотониновые нейроны, локализованные в п. raphe dorsalis и п. raphe medianus, порождают основную массу восходящих серотониновых волокон.
Большинство из этих волокон являются пемиелинизированными: 25% волокон миелинизированы у обезьяны и только 0.7% - у крысы (Azmitia, Gannon, 1983). В экспериментах по избирательному разрушению п. dorsalis и п. medianus было установлено, что нервные волокна из п. dorsalis иннсрвируют преимущественно базальные ганглии и s. nigra, а волокна из п. medianus - преимущественно лимбическую систему и перегородку. Миндалина и кора мозга получает иннервацию от обоих ядер (Jacobs et al., 1974; Lorens, Guldberg, 1974; Geyer et al., 1976; Bobillcr ct al., 1975,1976).
В коре мозга крысы (Kohler et al., 1981; Kosofsky, Molliver, 1987; McLean, Shipley, 1987; Mamounas et al., 1991), кошки (Mulligan, Tork, 1988; DeFelipe et al., 1991) и обезьяны (Wilson et al., 1989; Wilson, Molliver, 1991) обнаружены серотониновые волокна двух морфологических типов: 1)"тонкие" волокна с небольшими (менее 1 микрона) варикозными утолщениями по всей длине и 2) "четковидные" волокна с большими (около 2 микрон) варикозными расширениями. "Тонкие" и "четковидные" волокна формируют две различных серотониновых системы и происходят, соответственно, из п. raphe dorsalis и п. raphe medianus (Kosofsky, Molliver, 1987; Mamounas, Molliver, 1988; Mamounas et al, 1991). Показано, что эти два типа волокон не могут превращаться друг в друга (Mulligan, Tork, 1988). Плотность "четковидных" волокон меньше чем "тонких", и они в основном ограничены внешними слоями коры.
Серотониновая система мозга является самой экспансивной: она образует многочисленные окончания во всех структурах мозга, кроме мозжечка. Насчитывают около 6 млн. серотониновых окончаний на мм2 коры мозга крысы, что соответствует 0.5% всех окончаний переднего мозга. Один серотоииновый нейрон в среднем образует около полумиллиона окончаний. Каждый нейрон коры в среднем получает 200 серотониновых окончаний (Audet et al., 1989). Одни серотониновые окончания образуют классические синапсы, в то время как другие не имеют постсинаптической части и обеспечивают секрецию медиатора прямо в межклеточное пространство (Descarries et al., 1975; Beaudet, Descarries, 1976; 1987). Доля каждого типа окончаний варьирует в зависимости от структуры (Beaudet, Descarries, 1987). Так, синаптические
контакты редки в коре мозга (Beaudet, Descarries, 1976; Descarries et al., 1975) и стриатуме (Arluison, De la Manche, 1980; Soghomonian et al., 1989). Наличие серотониновых синапсов является доказательством того, что ссротонин является классическим медиатором в мозге, в то время как паличие большого числа несинаптических серотониновых окончаний свидетельствует о возможной роли серотонина как нейрогормона, оказывающего модулирующее действие па процессы в мозге (Jacobs, Azmitia, 1992).
Чрезвычайная экспансивность серотониновой системы является анатомической предпосылкой ее поли функциональности, вовлеченности в регуляцию многих (практически всех) форм поведения и физиологических функций млекопитающих.
Серотониновые нейроны головного мозга представляют собой среднего размера униполярные клетки около 15-25 микрон в диаметре (Beaudet, Descarries, 1987; Jacobs, Azmitia, 1992). Они обладают регулярной эндогенной спайковой активностью около 1-3 спайков/с у бодрствующего животного (Aghajanian et al., 1968; 1970; Mosko, Jacobs, 1977; VandcrMaelen, Aghajanian, 1983; Burlhis, Aghajanian, 1987; Jacobs, Azmitia, 1992). Спайковая активность зависит от состояния животного: она заметно снижается и становится нерегулярной во время медлен но волнового сна и полностью прекращается во время парадоксальной фазы сна (Jacobs, Azmitia, 1992). Серотониновые нейроны помимо серотонина способны синтезировать субстанцию Р и тиреолиберип (Hokfelt, 1986).
В серотоииновом нейроне серотонин синтезируется из незаменимой аминокислоты L-триптофана. Количество триптофана, поступающего с пищей, невелико (Рудзит, 1973) и концентрация свободной аминокислоты в крови и в тканях недостаточна, чтобы вызвать насыщение механизмов, транспортирующих триптофан в нейрон и превращающих его в серотонин. Действительно, поступление триптофана с пищей (Green et al., 1962; Wurtman, Femstrom, 1972; Fernstrom, Wurtman, 1974), внутрибрюшипное (Moir, Eccleston, 1968; Grahame-Smith, 1971; Fernstrom, Wurtman, 1971; 1974) или внутримозговое (Consolo ct al., 1965) введение этой аминокислоты существенно увеличивают содержание и усиливают обмен серотонина в головном мозге. Напротив, диета, обедненная триптофаном, снижает концентрацию и уменьшает интенсивность обмена серотонина в мозге (Gal, Drewes, 1962; Biggio et al., 1974; Kantaketal., 1980).
Условия содерэюания экспериментальных животных
Каталепсия представляет собой состояние длительной обездвиженности с пластическим (каталепсия) или ригидным (кататопия) тонусом мускулатуры. Животное или человек в состоянии каталепсии не способны длительное время изменять приданную им неудобную позу.
Каталепсия широко распространена в природе и наблюдается у многих представителей класса позвоночных, от рыб до млекопитающих (Карманова, 1977). У низших позвоночных, рыб и амфибий, каталепсия и кататония являются неотъемлемыми фазами суточного ритма активности, а точнее - цикла сон-бодрствовапие (Карманова, 1977). У высших позвоночных, птиц и млекопитающих каталепсия под названием животный гипноз, тоническая неподвижность и мнимая смерть является разновидностью пассивно-оборонительной реакции затаивания при появлении хищника (Sergeant, Eberhardt, 1975; Gallup, 1977; Gallup et al., 1983; Klemm, 1990; Dixon, 1998; Popova, 1999; Попова, 1997, 2004). У некоторых млекопитающих каталептоподобная неподвижность наблюдается как элемент субмиссивного поведения, которое демонстрирует субординаптный самец, будучи атакован более агрессивным сородичем (Erskine et al., 1980; Кудрявцева, Ситников, 1986; Dixon, 1998). Кроме того, каталептическое замирание проявляется у самок крыс при копуляции (Komisaruk, 1974) и у крысят при их транспортировке матерью (Brewster, Leon, 1980).
У человека в выраженной форме каталепсия наблюдается при некоторых тяжелых формах нервных и психических патологий (Авруцкий, Недува, 1981; Duvoisin, 1976; Abrams et al., 1979; Wilcox, Nasrallah, 1986; Garver, 1984; Sanberg et al„ 1988; Singerman, Raheja, 1994) или как негативный эффект лечения нейролептиками (Burki, 1979; Fricchione, 1985; Singerman, Raheja, 1994).
Каталепсия наиболее часто возникает при нарушении функции полосатого тела (стриатума) (Koffer et al., 1978; Honma, Fukushima, 1978; Costall, Naylor, 1974; 1979; Costall et al., 1978; Scheel-Kruger et al., 1981; Dray, 1981; Chozick, 1983; Di Chiara, Morelli, 1984; Klemm, 1990). Именно с нарушением дофаминовой иннервации этой структуры связывают каталептогешгое действие нейролептиков (Carey, 1983; Sanberg et al., 1988; Gao, Bin, 1987; Calderon et al., 1988; Klemm, 1990), Другие структуры мозга, такие как прилежащее ядро (п. accumbens), также вовлечены в регуляцию нейролептической и морфиновой каталепсии (Costall et at, 1978; Honma, Fukushima, 1978; Carey, 1983; Hartgraves, Kelly,. 1984). Латеральный гипоталамус и вентромедиальпые таламические ядра участвуют в ГАМК-эргической регуляции каталепсии (Wolfarth et al., 1985; Wuellner et al., 1987; Kolasiewicz et aL, 1988). Вентральная ретикулярная формация вовлечена в холинергическую регуляцию каталепсии (Hartgraves, Kelly, 1984).
В настоящее время имеются экспериментальные доказательства вовлечения многочисленных медиаторных систем мозга в регуляцию реакции каталептического замирания, У лабораторных грызунов каталепсию можно вызвать введением морфина или его производных (Vander-Wende, Spoeriein, 1979; De Ryck et al., 1980; De Ryck, Teitelbaiim, 1984; Malec, 1980), 9-тетрагидрокашіабинола (Gao, Bin, 1987; Pertwee, Greentree, 1988; Little et al., 1989), холиномиметиков (Fuenmayor, Vogt, 1979; Hartgraves, Kelly, 1984) или агонистов ГАМК-А и ГАМК-Б (Klockgether et al., 1985; Wardas et al., 1987; 1988; Mehta, Ticku, 1987; Wuellner et al., 1987). Однако наиболее выраженную каталепсию вызывают антагонисты D2 дофаминовых рецепторов (Koffer et al., 1978; Costall, Naylor, 1974; 1979; De Ryck et al., 1980; Ogren, Fuxe, 1988; Undie, Friedman, 1988; Sanberg et al., 1988; Klemm, 1989).
Дофаминовая гипотеза рассматривает гипофункцию дофаминовой системы мозга как главную причину каталепсии (Ungerstedt et al., 1982). Основным экспериментальным доказательством этой гипотезы является каталептогенное действие нейролептиков, большинство которых являются антагонистами D] и D2 дофаминовых рецепторов и снижают секрецию дофамина в стриатум (Sanberg et al., 1988; Calderon et al., 1988; Klemm, Block, 1988; Klemm, 1990). Действительно, введение анти смысловых иуіслеотидов к D2 рецепторам вызывает развитие выраженной каталепсии у крыс (Zhang, Creeze, 1993; Qin et al., 1995; Davidkova et al., 1996). Более того, нейролептики галоперидол и раклоприд не вызывают каталепсии у мышей с генетическим нокаутом по D2 рецепторам (Boulay et al., 2000; Wang et al., 2000). Недавно с помощью набора полиморфных микросателлитных маркеров, покрывающих геном мыши, было показано тесное сцепление чувствительности к катал епто ген ному действию галоперидола у мышей с геном D2 рецептора (Kanes et al., 1996; Patel, Hitzemann, 1999),
Однако дофаминовая гипотеза не способна объяснить все случаи каталепсии. Например, значительная дегенерация дофаминовых нейронов черной субстанции у пациентов с болезнью Паркинсона обычно не сопровождается развитием каталепсии. С точки зрения дофаминовой гипотезы парадоксальным выглядит катал епто генное действие дофаминовых агонистов, например, LY 171555 вызывает каталепсию в широком диапазоне доз (Puglisi-AIlegra et al., 1990). Дофаминовые агописты апоморфин и амфетамин усиливают галоперндоловую каталепсию при низких дозах (Carter, Русоск, 1977). Самым сильным аргументом против универсальности дофаминовой гипотезы каталепсии является отсутствие какой-либо спонтанной каталепсии у мышей, лишенных D2 дофаминовых рецепторов (Boulay et al., 2000).
В настоящее время накоплены многочисленные экспериментальные доказательства важной роли серотониповой системы мозга в регуляции каталепсии. Несмотря на то что не имеется данных о каталептогенном действиии серотониновых агонистов или антагонистов, многочисленные экспериментальные наблюдения свидетельствуют об участии серотониповой системы в регуляции нейролептической каталепсии. Действительно, долговременная блокада ТПГ п-хлорофенилаланипом предотвращает нейролептическую каталепсию (Kostowski et al., 1972; Wambebe, 1987) или снижает ее выраженность (Fuenmayor, Vogt, 1979). Авторы высказали предположение, что целостность серотониповой системы мозга является необходимым условием развития каталепсии. Неселективные ингибиторы 5-НТ2А рецепторов ципрогептадин (Maj et al., 1975) и метисергид (Balsara et al., 1979; Fuenmayor, Vogt, 1979) ослабляют нейролептическую каталепсию. Блокатор обратного захвата серотонина, хлоримипрамин, напротив, усиливает каталепсию, вызванную галоперидолом (Balsara et al., 1979) и цис-флупентиксолом (Davies, Williams, 1983). Предшественники серотонина, триптофан и 5-гидрокситриптофан (Fuenmayor, Vogt, 1979), а также неспецифические агонисты серотонина квипазин (Carter, Русоск, 1977; Balsara et al,, 1979) и 5-метоксидиметилтриптамин (Carter, Русоск, 1977) усиливали каталепсию. Ингибирование синтеза серотонина п-хлорметамфетамином (Groppe, Kuschinsky, 1975) или п-хлорфенилаланином (Malec, Langwinski, 1980), а также блокада серотониновых рецепторов метерголином (Scbeel-Kruger et al., 1977; Broekkamp et al., 1988) снижали выраженность морфиновой каталепсии у крыс. С другой стороны, 5-гидрокситриптофан усиливал морфиповуто каталепсию у крыс (Groppe, Kuschinsky, 1975; Malec, 1980), но не у мышей (Vander-Wende, Spoerlein, 1979).
Межлинейные различия в активности ТПГ.
Активность ТПГ была определена в стволе головного мозга у самцов мышей 12 инбредных линий: А/Не, A/Y, AKR/j, BALB/c, СЗН/Пе, C57BL/6, СВА, CC57BR, DBA/1, DD, РТ, YT, а в полушариях - у животных 7 инбредных линий (DBA/1, BALB/c, DD, C57BL/6, AKR, СЗН/Не, СВА).
Были обнаружены существенные межлинейпые различия в активности фермента в полушариях (Рис. 18, F i " 42.9, р 0.001) и в стволе головного мозга (Рис. 19, Fn,io6 = 45.5, рО.001). Коэффициенты внутриклассовой корреляции оказались очень высокими, равными, соответственно, 0.87 и 0.83. Большие значения критерия Фишера свидетельствуют о наличии существенной генетической регуляции признака.
Активность ТПГ у контрастных по этому признаку линий различалась в полушариях в 4 раза (Рис. 18), а в стволе - в 2.5 раза (Рис. 19). Активность фермента в полушариях головного мозга у мышей липни DBA/1 равна 3,3 пикомоль/мг/мин, в то время как у животных линии СВА она составляла 14 пикомоль/мг/мин, В стволе головного мозга наиболее низкая активность ТПГ отмечена у мышей линии DBA/1 (13.8 пикомоль/мг/мин), а самая высокая - у животных линии C57BL/6 (32 пикомоль/мг/мин).
Следует отметить, что активность ТПГ в стволе головного мозга гораздо выше, чем в полушариях. Например, у мышей линий AKR, СЗН/Не, СВА активность фермента в стволе вдвое, а у линии BALB/c - в 5.5 раз выше, чем в полушариях. Этот факт хорошо согласуется с литературными данными (Barchas et al., 1974; Knapp et al., 1981), полученными на других линиях и с использованием другой методики.
Более высокая активность ТПГ в стволе головного мозга по сравнению с таковой в полушариях не является неожиданной. Известно, что серотонин синтезируется в основном в телах серотонииовых нейронов, расположенных в стволе, и, следовательно, высокая активность ключевого фермента его синтеза необходима в этом отделе для осуществления данного процесса. Кроме того, сам фермент синтезируется в телах серотонииовых нейронов и доставляется в полушария аксональным транспортом (Knapp, Mandell, 1972). Этот процесс довольно медленный, и, по мере продвижения, ТПГ частично разрушается и теряет свою активность.
Тем не менее, обнаруживается определенная связь между активностью фермента в стволе мозга и его активностью в полушариях. Высокая активность фермента отмечается в полушариях у мышей тех линий, для которых показана высокая активность фермента в стволе. И наоборот, линии с низкой активностью фермента в стволе головного мозга имеют низкую его активность в полушариях. В самом деле, линии DBA/1 и BALB/c, имеющие низкую активность ТПГ в стволе головного мозга, характеризуются низкой его активностью в полушариях, а линии DD, C57BL/6, AKR, СВА и СЗН/Не обнаруживают высокую активность фермента в обоих отделах головного мозга. Коэффициент межлинейной корреляции этих признаков оказался положительным и значимым (Рис. 20, г = 0.89, р 0.05).
При дальнейшем анализе межлипейных различий была сделана попытка разделить линии мышей на группы в отношении активности ТПГ в головном мозге. Для этого проводились парные сравнения средних значений активности фермента всех линий по методу множественных сравнений Шеффе (1980). Оказалось, что семь линий мышей по активности ТПГ в полушариях головного мозга можно разделить на две контрастные группы: с низкой активностью фермента (3.4 ± 0.2 пикомоль/мг/мин) и с высокой его активностью (12.1 ± 0.5 пи комол ь/мг/мин). В первую группу входят линии DBA/1 и BALB/c, во вторую - DD, AKR, C57BL/6, СЗН/Не и СВА (Табл. 6). С одной стороны, между любыми двумя линиями, принадлежащими к разным группам, существуют достоверные различия по этому признаку. С другой стороны, между линиями из одной группы достоверных различий не обнаружено.
Наличие существенных межлинейных различий в активности ТПГ как в стволе, так и в полушариях мозга свидетельствует о существенном генетическом контроле этих признаков. Можно сказать, что у исследованных животных фенотипическое разнообразие по активности фермента в этих отделах более чем на 80% определяется генотипом. Тот факт, что все линии можно разделить только на две группы, животные из которых существенно различаются как по активности фермента, так и по его кинетическим характеристикам, позволяет высказать предположение о моногенном контроле активности триптофангидроксилазы в мозге мышей.
Для проверки предположения о моногенном контроле активности триптофангидроксилазы и выяснения характера наследования активности фермента был проведен гибридологический анализ данного признака на контрастных по нему линиях - BALB/c (низкая активность) и C57BL/6 (высокая активность).
Оказалось, что активность ТПГ в стволе головного мозга у реципрокных гибридов первого поколения несколько выше (р 0.05), а у гибридов второго поколения близка к среднему арифметическому значению признака у родительских линий BALB/c и C57BL/6, равному 25.3 пмоль/мг/мин (р 0.5) (Табл.8). Различий в активности фермента у реципрокных гибридов первого поколения не обнаружено (р 0.05).
Аналогичная закономерность наблюдается и при наследовании активности ТПГ в полушариях головного мозга (Табл. 8). Выраженность признака у гибридов первого поколения и гибридов второго поколения равна среднему арифметическому значений признака у родительских линий (7.4 пмоль/мг/мин) (р 0.05). Различий в активности фермента у реципрокных гибридов первого поколения также не обнаружено (р 0.5).
Межлииейиые различия в спонтанной агрессивности мышей
В качестве модели для изучения генетического контроля внутривидовой агрессии самцов была выбрана естественная (спонтанная) форма агрессивного поведения. Термин «спонтанная» ни в коем случае нельзя понимать как немотивированная, поскольку она возникает в ответ на вполне определенный стимул - присутствие другого самца. Этот термин, таким образом, используется, чтобы отличить данную модель от агрессии, вызванной длительной изоляцией, болью или страхом.
Наличие собственной территории резко усиливает агрессивность самцов мышей. Стимулом, вызывающим агрессивную реакцию, в данном случае является присутствие чужого самца на территории. Агрессия является проявлением защитного поведения, направленного на защиту важного жизненного ресурса - территории - от посягательств чужака. Поведение мыши, прогоняющей чужака со своей территории, по-видимому, существенно не отличается от борьбы двух самцов за лидерство в группе, однако более выражено.
Тестируемые самцы ведут себя различно по отношению к подсаженному чужаку: некоторые животные не проявляют агрессивности и ограничиваются обнюхиванием, а иногда груммингом чужака, другие после более или менее продолжительного латентного периода начинают подергивать хвостом, нападать и кусать чужака, а если последний убегает, то и преследовать его.
Спонтанную агрессивность у мышей оценивали по ее уровню - доле агрессивных животных в линии - и по интенсивности - выраженности возникшего агрессивного поведения (Куликов, Попова, 1980; Popova, Kulikov, 1986). Интенсивность агрессии характеризовали по числу нападений, совершаемых тестируемым самцом на чужака.
Целью данной части исследования было изучение закономерностей генетического контроля выраженности уровня и интенсивности спонтанной агрессии самцов мышей. Поставлены следующие задачи: 1. Изучить межлинейные различия по выраженности уровня и интенсивности агрессивного поведения самцов мышей. 2. Выявить закономерности наследования этих двух показателей агрессивного поведения. 3. Определить межлинейную корреляцию между проявлением межеамцовой агрессин и активностью ТПГ в мозге.
У самцов девяти инбредных линий были определены как интенсивность (Рис.27Л), так и уровень (Рис.27Б) спонтанной агрессивности. Были отмечены существенные межлинейные различия как по числу нападений па чужака (Fg(i34 = 6.52, р 0.001), так и по проценту агрессивных животных в линии (Fe,4i4= 6.9, рО.001).
Наивысшая интенсивность уже возникшей агрессии отмечена для мышей линий C57BL/6 и YT. Эти животные, начав драться, нападают на чужака в среднем 9 раз за 2 мин теста. Наименьшей агрессивностью характеризовались мыши линии DBA/1, они нападали на интрудера в среднем 3 раза за 2 минуты (Рис.27Л).
По уровню агрессивности все 9 исследованных линий можно разделить на две группы. В линиях DBA/1, CC57BR, AKR, СЗН/Не и C57BL/6 половина самцов нападает на подсаженного чужака, в то время как в линиях BALB/c, А/Не, DD и YT агрессивным является каждый пятый самец (Рис,27Б).
Не было отмечено межлинейной (генотипической) корреляции между числом драк за время наблюдения и процентом агрессивных животных в линии (г = -0.01, р 0.05). Действительно, несмотря на низкую интенсивность агрессии, характерную для животных линий DBA/1 и СС57Вг, уровень их агрессивности высок - на чужака нападало около половины животных этих линий (Рис. 27). Линии C57BL/6 и YT, сходные по выраженности уже возникшего агрессивного поведения, резко отличаются по его уровню: мыши линии C57BL/6 более чем вдвое чаше нападали на подсаженного самца по сравнению с животными линии YT (Рис. 27). Вероятно, интенсивность и уровень характеризуют разные стороны межеамцовой агрессии мышей.
Для изучения закономерностей наследования интенсивности и уровня спонтанной агрессивности проводили сравнение двух достаточно контрастных по этой форме поведения линий - BALB/c (С), характеризующейся сравнительно невысокими величинами интенсивности и уровня спонтанной агрессивности, и C57BL/6 (В6), одной из наиболее агрессивных среди изученных линий, а также их прямых (С х В6), обратных (Вбх С) гибридов F; и бэккроссов (Сх В6) х С (Табл.11).
Уровень спонтанной агрессивности у этих гибридов также сходен (% = 3.65, р 0.05). Поэтому при дальнейшем статистическом анализе они были объединены как реципрокные гибриды Fi, характеризующиеся средним числом драк (5,77 ± 0.45) и уровнем спонтанной агрессивности, равным 70%.
Установлено, что уровень спонтанной агрессивности у животных линии BALB/c существенно ниже по сравнению с таковым у мышей линии C57BL/6, реципрокных гибридов F] и бэккроссов. Сравнение уровня агрессивности родительских линий и Ft по критерию х2 показало высокую достоверность этого различия (Табл.12). В то же время, уровень агрессивности у животных линии C57BL/6 не отличался достоверно от такового у гибридов первого поколения и бэккроссов (Табл. 12). Различий в проценте агрессивных животных среди реципрокных гибридов первого поколения и бэккроссов также обнаружено не было (р 0,05). Иными словами, доминирует высокий уровень агрессивности.
