Введение к работе
Актуальность темы Разработка проблемы генетической регуляции систем размножения растений имеет важное теоретическое и прикладное значение. Выявление закономерностей, лежащих в основе проявления и наследования признаков репродуктивных структур способствует решению многих актуальных задач генетики и селекции растений, связанных, в частности, с вопросами стерильности, гибридизации, изменения уровня плоидности, создания гомозиготных форм, закрепления гетерозиса путем перевода на апомиксис. В настоящее время получена информация по генетике цветения (Okada et al., 1994), мейоза (Голубовская, 1975; Golubovskaya, 1989; Соснихинаи др., 1994), развития мужского гаметофита (Mascarenhas, 1990), эмбрио- и эндоспермогенеза (Meinke, 1985, 1997; Sheridan, Neuffer 1986; Sheridan, Clark, 1993; Olsen et al., 1995; Cerioli et al., 1995), цитологическому эффекту некоторых мутаций на стадии ме-гаспороцита (Батыгина и др., 1994; Батыгина, Воронова, 2000).
Женский гаметофит или зародышевый мешок (ЗМ), является ключевым элементом системы размножения. В нем происходит оплодотворение и разви-тиа зародыша и эндосперма, и по сути ЗМ выполняет роль связующего звена между двумя поколениями, обеспечивая непрерывность наследственной информации; от особенностей формирования и функционирования ЗМ в значительной степени зависит не только гарантия передачи этой информации, но и генетическая конституция потомства. Однако, лишь единичные работы посвящены генетическому исследованию женского гаметофита (см. обзор Drews et al., 1998).
Существенным препятствием к изучению генетического контроля развития ЗМ являются методические трудности его визуализации. Вследствие расположения ЗМ под непроницаемыми слоями клеток в завязи требуется применение специальной довольно трудоемкой техники приготовления препаратов для микроскопирования.
Разработанная нами ускоренная методика вычленения зародышевых мешков (Еналеева и др., 1972) в сочетании с техникой просветлении семяпочек (Негг, 1971) значительно упрощает процедуру микроскопического анализа и пелаег реальным генетическое исследование ЗМ.
Один из перспективных подходов к этому может заключаться в изучении потенциальной фенотипнческой изменчивости ЗМ. Как известно, изменчи-зость является универсальным свойством, проявляющемся на всех уровнях организации живого, и эффективный эвристический прием состоит в изучении сарактера варьирования в пределах конкретного вида. На этой основе может Зыть получена информация, проливающая свет на проблемы морфогенеза, ис-орического развития, дискретности признаков, а также могут быть выявлены 1>акты, представляющие практический интерес.
Развитие ЗМ (мегагаметофитогенез), как и любой другой формообразовательный , процесс, реализующийся по определенной программе, является результатом последовательной экспрессии генов, а значит, признаки зрелого ЗМ, являющегося итогом этого развития, наследственно обусловлены. Конечную структуру ЗМ можно представить как суммарный эффект неких элементарных морфогенетических актов, согласованное и сбалансированное осуществления которых приводит к формированию типичного (= нормального) для конкретного вида растений ЗМ. В этом случае следует ожидать, что "выключение" или изменение фенотипического проявления хотя бы одного из составляющих его элементарных событий приведет к разбалансированности или "сдвигу" данной развивающейся системы, в результате чего финальная структура окажется измененной. Характер изменения, то есть морфологический тип ЗМ и степень его отклонения от нормы, вероятно, будут зависеть от того, какие процессы и на каком этапе развития были модифицированы. Это означает, что в результате анализа полиморфизма структурной организации ЗМ могут быть выявлены его дискретные признаки, то есть, морфологические единицы или фены, имеющие собственный генетический контроль.
Как известно, аналогичный прием, заключающийся в расчленении («дис-секции») морфогенетического процесса на отдельные составляющие его фрагменты, широко используется в экспериментальной биологии. Практически он заключается в анализе внутривидового разнообразия, выделении уклоняющихся фенотипов и последующем их изучении. Источником фенотипиче-ской вариабельности могут быть спонтанные или индуцированные мутации разного типа, рекомбинации и модификации (изменения признаков, обусловленные факторами внешней среды). Из выделенных форм с наследственными морфологическими (или иными) изменениями составляются генетические коллекции.
Исходя из этой схемы, программа исследования закономерностей развития ЗМ должна включать определение потенциала внутривидовой изменчивости его морфологической организации, выявление форм с изменениями конкретных признаков и создание коллекции гаметофитных мутантов.
Цель данной работы состояла в изучении фенотипической изменчивости зародышевого мешка табака и оценке перспектив ее использования для выявления цитологических и генетических закономерностей мегагаметофитогенеза.
В задачи исследований входило:
1. Установить диапазон изменчивости ЗМ в экспериментально полученном материале (на основе мутагенеза, гаплоидии in vitro и in vivo, межвидовой гибридизации), а также в некоторых, коммерческих сортах и формах табака с ЦМС и выявить специфику вариаций в зависимости от генотипа.
2. Получить формы с изменениями отдельных признаков ЗМ и создать коллекцию гаметофитных мутантов.
-
Провести подробное цитоэмбриологическое и генетическое изучение экспериментально полученного гаметофитного мутанта, характеризующегося стабильным фенотипическим проявлением.
-
Исследовать закономерности модификационной изменчивости ЗМ. Установить диапазон морфологической изменчивости ЗМ, индуцированной влиянием температурного фактора (с использованием методов in situ и изолированных завязей in vitro).
-
Изучить функциональные особенности экспериментально реконструированных ЗМ на основе цитологического анализа оплодотворения. Исследовать возможность реализации полиэмбрионии и гаплоидии у растений с индуцированными «эмбриологическими предпосылками» этих явлений.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
1. Морфологическая структура ЗМ может специфически изменяться под влиянием генетических и паратипических факторов. Существует принципиальная возможность получения и сохранения в коллекции форм с мутациями, изменяющими проявление конкретных признаков мегагаметофита: числа ядер, целлюляризации, дифференциации клеток.
2. В основе изменения структурно-функциональной организации ЗМ могут лежать мутации, проявляющиеся на стадии мейоза. Выделенная нами мутация Dsyl, вызывающая специфический десинапсис по одной хромосоме, и как следствие - ее утрату в ходе мейоза, является причиной формирования анеуп-лондных мегаспор. Отсутствие хромосомы в МКЗМ в свою очередь приводит к выпадению или аномальному протеканию митозов в ценоцитной фазе мегага-метофитогенеза и нарушению функциональной специализации клеток ЗМ.
-
Морфологическое проявление признаков ЗМ может быть модифицировано влиянием экстремальных температур. В основе значительного совпадения спектров двух типов изменчивости - генотипической и модификационной -лежат единые цитологические механизмы преобразования признаков ЗМ.
-
Изолированные завязи in vitro являются удобной модельной системой для исследования модификационной изменчивости ЗМ. Возможность изменения морфологического проявления ряда признаков ЗМ путем варьирования состава питательной среды открывает перспективы разработки физиолого-биохимического аспекта мегагаметофитогенеза.
5. Экспериментально вызванное нарушение морфологической структуры зародышевых мешков (путем мутаций или модификаций) может изменять ход оплодотворения и генетическую конституцию потомства, что позволяет использовать индуцированную изменчивость в качестве инструмента для исследования закономерностей оплодотворения, а также в прикладных целях, в частности, для получения гаплоидов. Научная новизна.
Впервые на основе обширного эмбриологического анализа генотипически разных форм Nicotiana tabacum L. установлен диапазон внутривидовой измен-
чивости ЗМ и дана классификация их морфологических типов. Выявлена специфика структурных аномалий ЗМ и их частота у отдельных растений линий, сортов, форм с ЦМС, радиомутантов, гаплоидов и межвидовых гибридов.
Впервые на N. tabacum L. показана возможность экспериментальной индукции мутаций, затрагивающих проявление конкретных гаметофитных признаков (число элементов, цитокинез, характер дифференциации) и создания на их основе генетических коллекций. Получено фактическое доказательство длительного сохранения выделенных гаметофитных мутантов с использованием методов in vivo и in vitro.
Впервые получена мутация (Dsyl), вызывающая специфический десинап-сис и как следствие - утрату конкретной хромосомы в инициальной клетке ЗМ. Установлен характер наследования мутации и ее цитологический эффект на этапе формирования микро- и мегагаметофитов. Впервые показано, что мейо-тические мутации могут быть использованы как инструмент для вычленения вклада гаметофитных факторов в мегагаметофитогенез.
Впервые установлен диапазон модификационной изменчивости, индуцированной внешними факторами, и показана специфика структурных нарушений ЗМ при воздействии экстремальными температурами во время его развития. Основной эффект пониженных температур заключается в формировании ЗМ с яйцеклеткоподобными синергидами (обеими или одной) и ЗМ с уменьшенным числом элементов, повышенных - в формировании ЗМ с синергидоподобной яйцеклеткой, с увеличенным числом элементов, в подавлении слияния полярных ядер.
Впервые показана принципиальная возможность использования культуры изолированных завязей in vitro в качестве модельной системы для изучения модификационной изменчивости ЗМ. Установлено, что состав питательной среды может влиять на проявление признаков развивающегося ЗМ.
Впервые показано, что экспериментально вызванное изменение степени разрастания ЗМ в процессе мегагаметофитогенеза взаимосвязано с числом ядерных делений и характером дифференциации клеток яйцевого аппарата. Обосновано предположение, что в основе этих явлений лежат универсальные морфогенетические закономерности, а именно - корреляции и позиционная информация.
Впервые на Nicotiana tabacum доказано, что экспериментально индуцированные (путем мутаций или модификаций) структурные изменения ЗМ могут служить цитологической основой полиэмбрионии и гаплоидии.
Научно-практическая значимость.
Полученные фактические данные о структурных вариациях ЗМ, индуцированных разными факторами, способствуют выявлению общебиологических закономерностей. Дальнейшее исследование материала с применением методов цитохимии, электронной микроскопии и молекулярной биологии позволит по-
нять механизмы, лежащие в основе некоторых «элементарных» цитологических и морфогенетическнх процессов и явлений.
Созданные на основе индуцированного мутагенеза и сохраненные в коллекции формы Nicotiana tabacum с измененной структурой ЗМ (уменьшенное или увеличенное число элементов, аномальная дифференциация, ценоцитное состояние) являются уникальным экспериментальным материалом, который может найти применение при исследованиях в разных аспектах эмбриологии и генетики развития.
Экспериментально доказанная возможность использования культуры изолированных завязей in vitro в качестве модельной системы для изучения развития ЗМ открывает широкие перспективы для выявления закономерностей его модификационной изменчивости, индуцированной воздействиями экзогенных факторов.
Установленная возможность возникновения двоен типа 2п-п в потомстве форм табака с экспериментально индуцированными аномалиями ЗМ открывает перспективы использования внутривидовой изменчивости ЗМ в качестве инструмента для получения гаплоидов в практических целях.
Результаты исследований и материалы диссертации могут быть использованы специалистами, работающими в области эмбриологии, генетики и цитогенетики, а также при чтении лекций по этим специальностям в ВУЗах.
Апробация работы.
Результаты исследований были представлены на Всесоюзных и Международных симпозиумах по эмбриологии растений (Москва, 1973; Киев, 1978; High Tatra, Rackova dolina, 1982; Ташкент, 1983; Телави, 1984; Кишинев, 1987; Ленинград, 1990), XII Международном ботаническом конгрессе ( Ленинград, 1975), Всесоюзнзных и Международых конференциях по культуре тканей и клеток растений (Абовян, 1979; Кишинев, 1983; Olomouc, 1984; Москва, 1985; Minnesota, 1986; Новосибирск, 1988), Всесоюзной конференции "Рекомбиноге-нез и его значение в эволюции и селекции" (Кишинев, 1985), совещаниях по филогении растений (Москва, 1986, 1999), съездах ВОГИС (Москва, 1987; Минск, 1992; Саратов, 1994; Санкт-Петербург, 2000), совещании по проблемам размножения цветковых (Пермь, 1987), Республиканской конференции "Га-метная и зиготная селекция растений" (Кишинев, 1987), симпозиуме "Генетика развития растений и животных" (Ташкент, 1990), IV Всесоюзной научной конференции "Экологическая генетика растений, животных, челове-ка"(Кишинев, 1991), Международном симпозиуме по апомиксису у растений (Саратов, 1994), Международной конференции по анатомии и морфологии растений (Санкт-Петербург, 1997); конференции "Animal and Cell Biology" (Canterbury, 1997); П(Х) съезде Русского ботанического общества (Санкт-Петербург, 1998).
Публикации. По материалам диссертации опубликована 73 работы.
Объем и структура работы. Работа изложена на 350 страницах и состоит из введения, обзора литературы, 7 глав экспериментальной части, обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, включающего 396 наименований, приложения; иллюстрирована 46 таблицами, 64 рисунками, 118 микрофотографиями.
