Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 8
1.1 . Синтез осмолитов как способ повышения устойчивости к абиотическим стрессовым воздействиям . 8
1.2. Устойчивость растений к абиотическим стрессам 9
1.2.1. Солеустойчивость растений. 10
1.2.2. Засухоустойчивость растений. 12
1.2.3. Устойчивость к изменениям кислотности почвы 13
1.2.4. Устойчивость растений к токсическим концентрациям тяжелых металлов . 13
1.3. Роль пролина при стрессе. 24
1.4. Методы получения трансгенных растений. 30
1.5. Явление сайленсинга у трансгенных растений 32
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 36
2.1. Материалы 36
2.2. Методы получения трансгенных растений табака. 36
2.3. Анализ наследования маркерного гена nptll в поколениях растений табака . 37
2.4. Анализ содержания свободного пролина в тканях растений. 38
2.5. Анализ солеустойчивости ГМ растений. 38
2.6. Оценка уровня оводненности растений. 38
2.7. Анализ устойчивости ГМ растений к токсичным аналогам пролина. 39
2.8. Оценка устойчивости ГМ растений к повышенному уровню солей 39 тяжелых металлов.
2.9. Определение концентрации хлорофиллов а и b в листьях растений. 39
2.10. Оценка степени повреждения мембран в клетках растений в условиях осмотического стресса. 40
2.11. Оценка роста растений на твердых средах с повышенным содержанием агара. 41
2.12. Оценка всхожести семян и развития проростков растений табака в условиях осмотического стресса. 41
2.13. Влияние высоких температур на всхожесть семян табака. 41
2.14. Определение активности фермента пролиндегидрогеназы в тканях 41 растений.
2.15. Статистические методы исследования. 43
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 45
3.1. Получение генетически модифицированных растений табака . 45
3.2. Анализ числа встроенных инсерций по фенотипам проростков в 46 поколении Ті.
3.3. Солеустойчивость генетически модифицированных растений. 51
3.3.1. Влияние засоления на прорастание семян и развитие проростков. 51
3.3.2. Влияние засоления на развитие растений табака. 52
3.4. Устойчивость ГМ растений к токсичным аналогам пролина. 56
3.5. Устойчивость ГМ растений к осмотическому стрессу. 62
3.6. Устойчивость ГМ растений к воздействию высоких температур. 64
3.7. Устойчивость ГМ растений к повышенному уровню солей тяжелых металлов. 65
Заключение 72
Выводы 78
Цитируемая литература
- Синтез осмолитов как способ повышения устойчивости к абиотическим стрессовым воздействиям
- Устойчивость растений к токсическим концентрациям тяжелых металлов
- Анализ наследования маркерного гена nptll в поколениях растений табака
- Получение генетически модифицированных растений табака
Введение к работе
Актуальность проблемы. Неблагоприятные факторы внешней среды, такие как засоление, высокая или низкая температура, недостаток влаги, недостаток кислорода, высокая щелочность или кислотность почвы, оказывают отрицательное воздействие на рост и развитие растений. Одним из существенных факторов, ограничивающих выращивание сельскохозяйственных растений во многих агроклиматических зонах, является засоление почв. Избыточные концентрации соли в почве вызывают осмотический и оксидативный стрессы, а ионы хлора оказывают токсический эффект. Растения реагируют на воздействие внешних стрессорных факторов изменением экспрессии генов, интенсивности метаболизма, проницаемости клеточных мембран, баланса ионов в клетках и др. (Чиркова, 2002; Eimer, 2004; Кузнецов, Дмитриева, 2005; Ермакова и др., 2005). В частности, при стрессовом воздействии на растения в клетках начинают синтезироваться белки, участвующие в транскрипционном контроле, белки теплового шока, осмопротектанты (аккумулируются пролин, бетаины, полиамины и т.д.), что обеспечивает нормальное протекание клеточных процессов (Kuznetsov et al., 1993; Кузнецов, Шевякова, 1999; Баранова и др., 2006).
В последнее время для придания растениям полезных признаков в процессе выведения новых сортов для различных зон возделывания широко применяются достижения генетики и молекулярной биологии. Одно из таких достижений - получение методами генной инженерии растений, устойчивых к различным неблагоприятным факторам окружающей среды. Современный этап развития генетической инженерии растений получил название "метаболическая инженерия". К задачам этой отрасли биотехнологии можно отнести создание растений, накапливающих осмолиты (например, пролин), способствующих поддержанию тургора клеток, нейтрализующих радикалы и т.д. В работах многих авторов показана положительная связь между уровнем накопления пролина и стрессоустойчивостью растений (Сохансандж и др., 1997; Кузнецов, Шевякова, 1999). Однако, роль пролина в обеспечении устойчивости к различным видам стресса изучена недостаточно. В частности, это касается взаимосвязи между катаболизмом пролина и стрессоустойчивостью: исследования, проведенные на
растениях арабидопсиса с супрессированным геном пролиндегидрогеназы (ПДГ), дали противоречивые результаты (Nanjo et al., 1999; Mani et al., 2002).
Цель и задачи настоящего исследования. Целью настоящей работы было исследование взаимосвязи между метаболизмом пролина и устойчивостью к различным видам абиотических стрессов на модели генетически модифицированных (ГМ) растений табака. В связи с этим были поставлены следующие экспериментальные задачи:
1. Получить линии ГМ растений табака, несущие антисмысловой супрессор
гена пролиндегидрогеназы (ПДГ) и характеризующиеся повышенным
содержанием пролина.
Изучить наследование генетической конструкции в потомствах генетически модифицированных растений, полученных от самоопыления растений трансформантов.
Проанализировать устойчивость ГМ и контрольных растений к следующим стрессовым факторам: засолению, токсичным аналогам пролина, осмотическому стрессу, воздействию высоких температур, повышенным концентрациям тяжелых металлов
Научная новизна и практическая ценность.
Впервые получены линии ГМ растений табака, экспрессирующие антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы. Впервые показана повышенная устойчивость полученных ГМ растений к широкому спектру абиотических стрессовых факторов: засолению, присутствию токсичных аналогов пролина, к токсическим концентрациям тяжелых металлов, к осмотическому стрессу, воздействию засухи и повышенных температур. Стрессовые воздействия окружающей среды угнетают рост и развитие растений, снижая их продуктивность. Важными задачами для современной биотехнологии и селекции является повышение устойчивости сельскохозяйственных растений к засухе, засолению, заморозкам и другим неблагоприятным средовым воздействиям. Полученные ГМ растения табака можно использовать в качестве модели для изучения роли пролина в обеспечении стрессоустойчивости. Разработанный подход также можно рекомендовать для получения сортов хозяйственно-ценных растений, характеризующихся повышенной комплексной устойчивостью к различным абиотическим стрессам.
Положения, выносимые на защиту.
ГМ растения табака, экспрессирующие антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы, характеризуются увеличенным содержанием пролина (до пятого поколения от самоопыления включительно).
Линии ГМ растений табака, экспрессирующие антисмысловой супрессор гена ПДГ, характеризуются повышенной устойчивостью к широкому спектру абиотических стрессов (засолению, токсическим концентрациям тяжелых металлов, осмотическому стрессу, воздействию засухи, повышенных температур)
Апробация работы. Результаты работы докладывались на российских и международных конференциях: 7-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых, 2003; конференции МОГИС, 2003; Международной конференции «Биология растительных клеток in vitro и биотехнология», Саратов, 2003; Съезде ВОГиС, Москва, 2004; III международной научной конференции «Факторы экспериментальной эволюции организмов», Украина, Алушта, 2006.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ и подана заявка на патент.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 97 страницах, включает 19 рисунков и фотографий, 15 таблиц в тексте диссертационной работы. Библиографический указатель включает 206 источников.
Синтез осмолитов как способ повышения устойчивости к абиотическим стрессовым воздействиям
На уровне целого растения реакция на засоление, засуху, воздействие низких или высоких температур довольно однотипна: происходит ингибирование роста побегов, снижается устьичная проводимость, стимулируется рост корневой системы, через некоторое время происходит завядание нижних листьев. Все это направлено на повышение уровня оводненности путем снижения испарения воды и усиление поглотительной способности корневой системы. На клеточном и молекулярном уровнях происходит индукция экспрессии генов, ответственных за синтез антиоксидантных ферментов, ферментов синтеза и деградации совместимых осмолитов - низкомолекулярных органических соединений, которые в высоких концентрациях не тормозят протекание клеточного метаболизма. К таким осмолитам относятся аминокислоты (например, пролин, аланин), четвертичные ионы (например, бетаин, глицин-бетаин), сахара и сахароспирты (маннитол, сорбитол, трегалоза, инозитол), углеводы. Они понижают водный потенциал клеток, защищают ферменты от инактивации, обеспечивают целостность структурных белков и пр. (Кузнецов, Дмитриева, 2006). Повышение концентрации совместимых осмолитов в цитоплазме достигается за счет двух противоположных процессов: активации экспрессии генов, кодирующих ферменты синтеза осмолитов, или ингибирования экспрессии генов, ответственных за их деградацию. Одним из способов повышения устойчивости растений является дополнительный синтез некоторых биологически важных веществ. Так, абсцизовая кислота (АБК) играет важную роль у высших растений в формировании ответа на стрессовые воздействия окружающей среды, регулируя экспрессию многочисленных генов, функционирующих в стрессовых условиях. Были получены трансгенные растения салата латука (Lactuca sativa L) с геном ABF3 арабидопсиса, кодирующим транскрипционный фактор для экспрессии АБК-чувствительных генов. Данные ГМ растения гораздо лучше переживали засуху и холодовой стресс, по сравнению с растениями дикого типа. Поскольку ГМ растения показали устойчивость как к засухе, так и к воздействию низких температур (до -4С), возможно, что на молекулярном уровне механизмы ответа на эти воздействия схожи (Vanjildorj et al., 2005).
Известно, что накопление специфических низкомолекулярных органических осмолитов, таких как пролин, маннитол, сорбитол, глицин-бетаин и т. п., усиливает устойчивость растений к водному дефициту, температурному, солевому и другим типам абиотических стрессов (Delauney and Verma, 1993; Кузнецов, Старостенко, 1994; Кузнецов, Шевякова, 1999; Willenbrink and Husemann, 1995; Eimer, 2004). Этот факт неоднократно отмечен как для нативных (природных), так и для трансгенных растений, накапливающих повышенное количество таких совместимых осмолитов. В настоящее время созданы растения с повышенным содержанием маннитола, D-ононитола, фруктанов, полиаминов, глицинбетаина, пролина (Tarczynski et al., 1993; Sheveleva et al., 1997; Shen et al., 2002; Lee et al., 2003; Sawahel, 2003; Han et al., 2005; Knipp, Honermeier, 2006).
Ответ организма на действие экстремальных факторов реализуется в виде двух последовательных стадий — стрессорной реакции и специализированной адаптации (Селье, 1977; Кузнецов и др., 1987; Чиркова 2002). Если первичная (стрессорная) реакция направлена на предотвращение интенсивного повреждения клеток, т.е. на осуществление «срочной» адаптации, то специализированная адаптация обеспечивает жизнедеятельность организма на фоне постоянного действия экстремального фактора. В основе долговременной адаптации лежит новообразование отсутствовавших ранее макромолекул и формирование механизмов специализированной устойчивости (Кузнецов и др., 1990).
Сильный стресс нарушает водный гомеостаз растений и распределение ионов внутри клеток и тканей. Глубокие изменения в ионном и водном гомеостазе приводят к остановке роста и даже к гибели растений. Для достижения стрессоустоичивости важны три взаимосвязанных аспекта функциональной активности растений. Во-первых, последствия стрессового воздействия могут быть смягчены. Во-вторых, гомеостаз устанавливается в новых стрессовых условиях. В-третьих, рост продолжается, хотя и с меньшей скоростью (Zhu, 2001). Замедление роста является адаптивным симптомом при выживании растений в условиях стресса, поскольку позволяет растениям использовать разнообразные ресурсы (например, построение защиты и запасание энергии) для преодоления стресса. В природе мера соле- или засухоустойчивости часто оказывается в обратной зависимости от скорости роста растительных организмов. Одной из причин снижения скорости роста в условиях стресса является снижение уровня фотосинтетической активности клеток листа вследствие закрытия устьичных клеток, что ограничивает поглощение углекислого газа. Однако более важно то, что стресс может полностью подавлять клеточные деления, что ведет к нарушению развития растений (Zhu, 2001).
Устойчивость растений к токсическим концентрациям тяжелых металлов
Тяжелые металлы, накапливаясь в почве, тормозят рост корней, увеличивают проницаемость мембран, изменяют процессы вакуолизации цитоплазмы, повреждают процесс сборки микротрубочек, тормозят синтез ДНК, ингибируют процессы фотосинтеза, нарушают транспорт ассимилятов и минеральное питание, изменяют водный и гормональный статус организма и т.д. (Чиркова, 2002; Кузнецов, Дмитриева, 2005). В основе токсического действия лежит их способность связываться и образовывать прочные комплексы с серосодержащими соединениями. Однако, при наличии тяжелых металлов растения способны включать различные механизмы детоксикации, что повышает их устойчивость. Для растений характерны различные адаптационные механизмы, которые можно разделить на две большие группы: ограничение попадания ионов тяжелых металлов внутрь клеток и их детоксикация.
Предотвращение проникновения ионов тяжелых металлов в растительную клетку Связывание тяжелых металлов непосредственно клеточной стенкой происходит при помощи белков, силикатов, карбоксильных групп уроновых кислот слизи, Сахаров, фенолов и др. (Чиркова, 2002; Кузнецов, Дмитриева, 2005). К числу таких белков относятся белки теплового шока (БТШ), некоторые из которых могут синтезироваться в ответ на присутствие тяжелых металлов: происходит синтез низкомолекулярных белков (с молекулярной массой 16-20 кДа) и высокомолекулярного БТШ70. Считается, что БТШ 70 связывается с диссоциированными или денатурированными белками, которые образуются при токсическом воздействии тяжелых металлов (Феник и др., 1995; Серегин, 2001; Hall, 2002). У арабидопсиса обнаружены специальные обогащенные цистеином белки (Atpcrs), локализованные на плазматической мембране и обеспечивающие устойчивость к кадмию. Гомологи таких белков обнаружены и у других видов растений. При дополнительной экспрессии этих генов наблюдали повышенную устойчивость к кадмию (Song et al., 2004).
Интоксикация может быть предотвращена посредством работы трансмембранных клеточных насосов с последующим выбросом токсичных ионов наружу. Перенос и экспрессия генов ZntA у Escherichia coli и CAD2 у дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Shiraishi et al., 2000) обеспечивает значительное увеличение устойчивости к цинку. Ген ZnTA, кодирующий Pb(ll)/Cd(ll)/Zn(ll) насос, обеспечивающий выведение ионов этих металлов из клетки, был взят для трансформации арабидопсиса (Lee J. et al., 2003). У полученных генетически модифицированных растений белок, кодируемый этим геном, был локализован в плазматической мембране. Выведение токсических веществ в межклеточное пространство привело к нормализации роста в присутствии ионов кадмия (70 цМ) и свинца (0.7 мМ). При этом также наблюдали позитивные фенотипические отличия: в сравнении с контрольными ГМ растения имели большие по размеру листья без признаков хлороза и их вес был больше.
У табака был выделен белок NtCBP4, который связан с плазматической мембраной, а по структуре сходен с калиевыми и неселективными ионными каналами. ГМ растения табака, дополнительно экспрессирующие этот белок, были более устойчивы к повышенным концентрациям никеля (Arazi et al., 1999). В присутствии Ni2+ у ГМ растений содержание хлорофилла было выше, чем у растений дикого типа. При этом устойчивость к никелю не зависела от стадии развития растений и выявлена даже у каллусной культуры. Это объясняется тем, что ГМ растения аккумулируют меньшие количества Ni2+ по сравнению с контрольными.
Внутриклеточные механизмы устойчивости к воздействию тяжелых металлов. Детоксикация путем формирования комплексов. Связывание металлов в цитозоле аминокислотами, органическими кислотами и другими соединениями с образованием хелатов или других комплексов обеспечивает снижение уровня окислительного стресса. Так, в ответ на повышенное содержание меди у растений арабидопсиса может наблюдаться увеличение синтеза глутатиона (Wojcik, Tukiendorf, 2003). Глутатион низкомолекулярный пептид, часто встречающийся у растений, характеризующийся высоким содержанием серы и повышающий устойчивость растений к воздействию тяжелых металлов (Noctor et al., 1996; Kim et al., 2006). В частности, глутатион способен формировать устойчивые комплексы с ионами ртути и серебра (Феник и др., 1995; Чиркова, 2002). При понижении уровня глутатиона из-за мутации, повлекшей недостаток углутамилцистеинсинтазы, была выявлена гиперчувствительность растений арабидопсиса к ионам кадмия (Cobbet et al., 1998). Растения арабидопсиса, экспрессирующие митохондриальный ген AtATM3 белка переносчика ATM, необходимого для синтеза глутатиона, оказались значительно более устойчивыми к наличию ионов кадмия (40 рМ) и свинца (0,5 рМ) (Kim et al., 2006). Известно, что присутствие ионов кадмия вызывает усиление перекисного окисления липидов и увеличение активности липооксигеназы (Pilon-Smits et al., 2000). Трансгенные растения горчицы Brassica juncea, экспрессирующие бактериальный ген глутатионредуктазы, были более устойчивы к оксидативному стрессу и к тяжелым металлам. Причем, при встраивании гена в пластидную ДНК активность фермента возрастает в 50 раз, в то время как в цитозоле лишь 1.5-2 раза.
Отмечена выраженная корреляция между концентрацией глутатиона, цистеина и 0-ацетил-/.-серина и способностью к накоплению никеля у различных видов ярутки (Freeman et al., 2004). Исследования показали, что увеличение концентрации серина, цистеина и глутатиона и накопление никеля совпадает с высокой активностью серинацетилтрансферазы (CAT) и глутатионредуктазы (ГР). CAT катализирует процесс превращения серина в 0-ацетил-/.-серин, необходимый для биосинтеза цистеина. При получении ГМ растений арабидопсиса, экспрессирующих митохондриальную изоформу гена CAT, были получены растения, у которых при выращивании на 100 рМ никеля не было обнаружено видимых признаков интоксикации, однако, при ингибировании биосинтеза глутатиона устойчивость растений полностью утрачивалась. У трансгенных растений арабидопсиса, экспрессирующих в цитозоле цистеинсинтазу, повышается устойчивость к воздействию кадмия (Domingez-Solis et al., 2001). Обнаружено, что цистеин также может приводить к повышению устойчивости к солям других тяжелых металлов. В одном из экспериментов были получены 3 типа трансгенных растений табака, экспрессирующих цистеинсинтазу в цитозоле, в хлоропластах, а также в цитозоле и хлоропластах одновременно. Растения, экспрессирующие оба гена, более устойчивы к воздействию кадмия, селена и никеля. При экспрессии одного гена признаки интоксикации выражены сильнее (Kawashima et al., 2004).
Анализ наследования маркерного гена nptll в поколениях растений табака
Регенерация трансформантов на селективной среде. Экспланты промокали на стерильной фильтровальной бумаге и переносили в чашки Петри с агаризованной средой Мурашиге и Скуга (MS) (Murasige, Skoog,1962) с добавлением 20 г/л сахарозы, 8 г/л агара, 1 мг/л БАП, 0.1 мг/л НУК, 500 мг/л клафорана или цефотаксима, 100 мг/л канамицина). По мере образования каллуса трансформанты переносили в пробирки со средой Т2 (среда MS с добавлением 20 г/л сахарозы, 8 г/л агара, 0.1 мг/л БАП, 500 мг/л клафорана или цефотаксима, 100 мг/л канамицина), которая стимулировала побегообразование. Зеленые побеги переносили для укоренения в пробирки со средой ТЗ (MS с добавлением 20 г/л сахарозы, 8 г/л агара, 500 мг/л клафорана или цефотаксима, 100 мг/л канамицина).
4. Укорененные растения трансформанты, характеризующиеся повышенным уровнем пролина, высаживали в грунт в теплице. Полученные трансформанты обозначили как поколение То, их потомки первого поколения от самоопыления назвали Ть второго - Тг и т.д.
5. В качестве контроля в эксперименты брали нетрансгенные растения табака сорта SR1, не характеризующиеся повышенным уровнем синтеза пролина.
6.В результате самоопыления были получены линии ГМ растений табака, характеризующиеся повышенным уровнем пролина и устойчивостью к канамицину.
2.3. Анализ наследования маркерного гена nptll в поколениях растений табака. Для оценки наследования встроенной конструкции использовали моно-дигенные схемы сегрегации инсерционных вставок у растений табака, полученных при самоопылении (по признаку устойчивости к канамицину). Если в геном встроена единичная инсерция, то при выращивании потомства на канамицине должна иметь место моногенная схема сегрегации исследуемого признака. Частоты инактивированных аллелей находили, пользуясь правилом Харди-Вайнберга (Sokal, Rohlf, 1995).
2.4. Оценка содержания свободного пролина в тканях растений.
Содержание свободного пролина определяли по методу Бейтса с соавт. (Bates et al., 1973) с использованием кислого нингидринового реактива (30 мл ледяной уксусной кислоты; 20 мл 6М Н3Р04; 1,25 г нингидрина).
Навеску свежей растительной ткани листьев (200 мг) помещали в пробирку, заливали 5 мл дистиллированной воды и на 10 минут помещали в кипящую водяную баню. В другую пробирку приливали 1мл растительного экстракта и добавляли к нему по 1 мл ледяной уксусной кислоты и нингидринового реактива. Пробы инкубировали в течение 1 часа в кипящей водяной бане, после чего их быстро охлаждали во льду. Интенсивность окраски определяли спектрофотометрически при длине волны 520 нм при помощи фотоэлектроколориметра. Значения содержания пролина рассчитывали с помощью калибровочной кривой, используя для ее построения пролин фирмы «Sen/a». Содержание пролина выражали в микромолях на 1 г свежей массы.
Измерения содержания пролина проводили на растениях в возрасте 4-5 недель, которые культивировали при температуре 23-25С и 16-часовом световом дне.
2.5. Анализ солеустойчивости ГМ растений. Согласно данным других экспериментаторов, наличие 200 мМ хлорида натрия является токсичной концентрацией для взрослых растений табака (Delauney and Verma, 1993). Был проведен ряд экспериментов по определению солеустойчивости растений, взятых на разных стадиях развития: семена высевали на стандартную среду MS и на среду MS с добавлением соли (150мМ NaCI). На этой среде в условиях климатокамеры (+24С, 16 ч световой день) растения выращивали в течение 2 месяцев. проростки на стадии двух пар настоящих листьев, выращенные на среде MS, пересаживали на среду, содержащую хлорид натрия в концентрации 200, 300,400 и 500 мМ NaCI.
2.6. Оценка уровня оводненности растений. В эксперимент брали растения, находящие на стадии двух пар настоящих листьев. Их пересаживали на среду MS (контроль) и на MS с добавлением 200 и 300 мМ NaCI. Через 4-5 недель культивирования проводили взвешивание надземной части растений. Затем для определения сухой массы проводили их высушивание при 70С в течение суток. Содержание воды определяли как: изначальны її вес растения (г)-сухой вес растения (г) і ЛЛ о/ изначальны йвес растения (г)
Также оценивали способность листовых дисков удерживать влагу. Для этого отрезанные листья взвешивали и высушивали при комнатной температуре. Взвешивание листьев производили через 2, 4, 6 и 24 часа с момента обрезки.
2.7. Анализ устойчивости ГМ растений к токсичным аналогам пролина. Проводили посев семян на среду MS с добавлением 0.1 мМ Azc (Azetidine-2-carboxylic acid). Оценивали рост и развитие проростков на данной среде, размер семенных коробочек и количество семян, сформированных после пересадки растений в теплицу. Также был использован такой аналог как тиапролин. В среды он добавлялся в концентрации 0.1, 0.3 и 0.5 мМ/л. После одного месяца культивирования оценивали стрессорное влияние на растения по их внешнему виду, размерам и по массе наземной части.
2.8. Оценка устойчивости ГМ растений к повышенному уровню солей тяжелых металлов. Семена растений опытных ГМ линий и контрольного сорта SR1 высевали на среду Мурашиге и Скуга (MS) и на среду MS с добавлением хлорида кадмия (0.1, 0.2 мМ), нитрата свинца (0.1, 0.3 мМ), сернокислого никеля (0.1, 0.2, 0.4 мМ) или хлорида ртути (0.05, 0.1 мМ НдСЬ). На этих средах в условиях климатокамеры (+21 С, 16 ч световой день) растения выращивали в течение 2 месяцев, после чего оценивали влияние стрессовых факторов по внешнему виду растений, их массе и содержанию хлорофиллов.
Получение генетически модифицированных растений табака
Ранее было показано, что подобные конструкции увеличивают содержание пролина в трансформантах арабидопсиса, хотя оценки устойчивости полученных трансформантов к солевому и осмотическому стрессу варьируют от повышенной (Nanjo et al., 1999) до неизменной (Mani et al., 2002). Используя эту конструкцию, мы планировали оценить физиологический статус и стрессоустойчивость растений табака. Кодирующая часть гена пролиндегидрогеназы консервативна, поэтому можно было ожидать, что экспрессия антисмысловой РНК пролиндегидрогеназы арабидопсиса будет супрессировать ген пролиндегидрогеназы табака, или непосредственно взаимодействуя с мРНК гена, или посредством механизма генетического замолкания (Кочетов и др., 2004).
Все полученные ГМ растения были отобраны на среде, содержащей канамицин. Известно, что в результате генетической трансформации происходит встраивание одной или нескольких копий генетической конструкций в геном растения. Полученные нами ГМ растения должны быть гемизиготами в случае одиночной встройки генетического материала, дигемизиготами, если встроек было две, и т.д. В случае встраивания двух инсерций в геном, они могут попасть
в одну хромосому или в разные хромосомы генома. В первом случае сегрегация инсерции будет связана с рекомбинационными событиями в отдельной хромосоме, во втором случае будет наблюдаться случайная сегрегация встроенных инсерции в двух хромосомах. Известно, что в среднем при анализе популяций независимо полученных трансформантов арабидопсиса и риса выявляется около 1,4 инсерции на растительный геном (Feldmann, 1991; Jeon et al., 2000). Следовательно, можно предположить, что полученные нами трансформанты табака с наибольшей вероятностью являлись гемизиготами (АО) или дигемизиготами (AiOA20): Д- встроенная в геном инсерция, 0 - отсутствие инсерции в геноме или замолкание гена.
Анализ числа встроенных инсерции по фенотипам проростков в поколении Tf.
Анализ сегрегации гемизиготных генотипов (ЛіО) в потомствах от самоопыления (поколение Ті) должен соответствовать нуль гипотезе о моногенной сегрегации признака - гипотезе «присутствия - отсутствия» Пеннета. «Гипотеза, объясняющая проявление соответственных пар признаков присутствием или отсутствием гена, обуславливающего этот признак. Реальный ген существует только для доминантного признака, проявление же рецессивного признака объясняется отсутствием этого же доминантного гена» (Ригер, Михаэлис, 1967). Нами проведен анализ наследования маркерного гена nptll, обусловливающего устойчивость к канамицину, у потомков трансформантов, полученных от самоопыления. Результаты сегрегации в потомствах семи растений трансформантов по фенотипам проростков, выращенных на канамицине, приведены в таблице 3. В качестве нуль гипотезы взято предположение, что в геном встроена единичная инсерция, и потому при выращивании потомства на канамицине должна иметь место моногенная схема сегрегации исследуемого признака. Зеленый проросток (присутствие инсерции) указывает, что у него есть фрагмент ДНК, несущий устойчивость к антибиотику канамицину, тогда как хлоротичный проросток (отсутствие инсерции или замолкание экспрессии маркерного гена) указывает на отсутствие устойчивости к канамицину. "- отличия достоверны с вероятностью Р 0.95 (G-критерий 3,84)
Если считать, что при трансформации имеет место единичная инсерция в геном табака с диплоидизированным типом сегрегации хромосом в мейозе, то следует ожидать моногенное расщепление (соотношение зеленых и хлоротичных проростков должно составлять 3:1). Как следует из данных, представленных в таблице 3, моногенный тип сегрегации фенотипов по устойчивости к канамицину отмечен в трех из семи исследованных потомств (линии 1, 6 и 8). Относительно этих потомств можно сделать вывод, что у родительских растений произошла единичная инсерция в одну из хромосом табака, и в потомстве наблюдается моногенная сегрегация фенотипов. В остальных четырех потомствах наблюдается либо достоверный недостаток хлоротичных проростков (линия 3), либо их достоверный избыток (линии 2, 5, 10). Наиболее вероятно, что причиной избытка таких проростков является замолкание маркерного гена. В этом случае эпигенетически измененные инсерции на фенотипическом уровне дадут избыток проростков белого цвета.
Как известно, моногенная сегрегация признаков описывается биномом второй степени (0,5 А3 + 0,5 Л0)2.= 0,25 АД, + 0,5 А3А0 + 025 AQA0. В случае инактивации (silencing) инсерционной последовательности меняется соотношение двух типов гамет у ГМ растений, так как на фенотипическом уровне инактивированная инсерция аналогична отсутствию инсерции в хромосоме. Это в свою очередь приводит к изменению фенотипических соотношений. Если обозначить частоту активной инсерции буквой р, а частоту неактивной инсерции и отсутствие инсерции буквой q, то в соответствии с правилом Харди-Вайнберга частоты гено- фенотипических классов запишутся как (рА+ q А0)2= р2 АА + 2р q А\Ао+ q2 Ао Ао. Предполагается, что у растения в поколении То соотношение двух аллелей А, и Ао равны между собой, т. е. р и q равны Я При замолкании аллеля А растения генотипа А\Ао переходят в эпигенотип АА и добавляются к доле растений с отсутствием инсерции (q2 Ао Ао).. Доля (/) инактивированного аллеля
А у гемизиготного растения находится по формуле /j = 2- - q; где q = 0.5 теоретически ожидаемая частота; /- номер линии; q, стоящая под знаком корня - фактическая частота.
Найдем частоту аллелей, дающих хлоротичные проростки по формуле х = д/ . Частота такого аллеля у линии № 2 равна 0,5813, у линии № 5 - 0,5953 и у линии № 10 - 0,7617. Отсюда h = 0,1626, f5 =0,1906 и f10 = 0,5234. Таким образом, у линии № 2 инсерция инактивирована в 16,26% случаев, у линии № 5 - у 19,06%, и у линии № 10 более половины (52,34%) случаев инактивации инсерции.
Составим вспомогательную таблицу 4 для описания соотношений двух фенотипов у гемизиготных ГМ растений при различном уровне инактивации встроенной инсерции (эпигенетический тип сегрегации признака).
