Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Современные взгляды на особенности клинических проявлений преждевременной недостаточности яичников и ее генетическую гетерогенность, (обзор литературы) 14
1.1. . Клинико-патогенетические варианты ПИЯ 14
1.2. Генетическая гетерогенность ПНЯ 21
1.2.1 .Эмбриогенез яичников и задействованные в нем гены 24
1.2.2. Истощение яичников как результат «недостаточности генов» хромосомы X в гаплоидном наборе (Моносомия по хромосоме X) 26
1.2.3.Делеции короткого плеча хромосомы X и истощение яичников 28
1.2.4.Гены-кандидаты, располагающиеся на коротком плече хромосомы X при ПНЯ 30
1.2.5.Делеции длинного плеча хромосомы X 31
1.2.6.Гены-кандидаты на длинном плече хромосомы X при ПНЯ 33
І.З.Синдром ломкой хромосомы X и экспансия тринуклеотидного
CGG - повтора в гене FMR1 34
1 АНеслучайная инактивация хромосомы X (SXCI) 36
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования
2.1 Общая характеристика больных 41
2.2. Методы исследования 42
2.3 Оценка состояния систем и органов с помощью специальных лабораторных и инструментальных методов 43
2.4. Методика анкетирования 54
2.5. Характеристика используемого метода лечения 55
2.6. Статистическая обработка данных 56
ГЛАВА III. Клиническая характеристика больных
ГЛАВА IV. Состояние основных звеньев гипоталамо-гипофизарно-тиреоидно-яичниково-надночечниковой и иммунной систем до и после лечения у больных с ПНЯ. Генетические повреждения как маркеры развития ПНЯ 72
4.1 Гормональный статус пациенток с ПНЯ 72
4.1.1 Состояние гипоталамо- гипофизарно-яичниково-надпочечниковой системы 72
4.1.2 Уровень ингибина В 73
4.1.3 Состояние тиреоиднон системы у пациенток с ПНЯ 74
4.2.1 Яичниковые аутоантитела у пациенток с ПНЯ 75
4.2.2 Тиреоидные аутоантитела у пациенток с ПНЯ 77
4.3.1.Данные эхографического исследования гениталий у больных с ПНЯ 78
4.3.2.Данные эхографического исследования щитовидной железы 79
4.3.3. Состояние иммунной системы у пациенток с ПНЯ 80
4.3.4.Распределение антигенов главного комплекса
гистосовместимости (HLA) II класса у пациенток с ПНЯ 83
4.4. Результаты генетического обследования у пациенток с ПНЯ 86
4.4.1. Результаты цитогенетического обследования 86
4.4.2.Результаты выявления представленности неслучайной 88
инактивации хромосомы X (SXCI)
4.4.3.-^Результаты выявления премутации гена FMR1 (премутация FRAXA) 92
4.5.Клинико-лабораторные данные у больных с молекулярно-генетическими и хромосомными нарушениями (патология кариотипа) Q
при ПНЯ
4.6.0ценка качества жизни у пациенток с ПНЯ 97
4.7.0ценка состояния гипоталамо-гипофизарно-тиреоидно-яичниковой
систем, качества жизни у больных с ПНЯ через 12 месяцев после проведенной заместительной гормональной терапии 98
4.7.1.Оценка состояния гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы через 12 месяцев приёма 2мг эстрадиол валерата и 10 мг медроксипрогестерона ацетата в циклическом непрерывном режиме (Дивисек - Орион Фарма, Финляндия) 98
4.7.2.0ценка состояния тиреоидной системы у больных с ПНЯ через 12
месяцев приема Дивисека в сочетании с L-тироксином 100
4.7.3 Качество жизни у пациенток с ПНЯ на фоне 12 месяцев заместительной горманальной терапии 102
Глава V. Обсуждение полученных результатов 104
Выводы 137
139
Практические рекомендации 141
Список литературы
- Клинико-патогенетические варианты ПИЯ
- Истощение яичников как результат «недостаточности генов» хромосомы X в гаплоидном наборе (Моносомия по хромосоме X)
- Оценка состояния систем и органов с помощью специальных лабораторных и инструментальных методов
- Состояние гипоталамо- гипофизарно-яичниково-надпочечниковой системы
Введение к работе
Преждевременная недостаточность яичников (ПНЯ) - это симптомокомплекс, характеризующийся вторичной аменореей, симптомами гипоэстрогении и повышением уровня гонадотропинов (ФСГ, ЛГ) у женщин в возрасте до 40 лет [Lamp Т., 2000, Nippita Т.А., Baber R.J. 2007]. Проведенные эпидемиологические исследования указывают на тесную связь данного заболевания с возрастом. Так у женщин в возрасте до 20 лет ПНЯ встречается с частотой 1:10 000, а в возрасте от 30 до 40 -1:1000 [Beck-Peccoz P., Persani L. 2006; Goswami D., Conway G.S. 2007,]. ПНЯ встречается у 10-28% пациенток с первичной аменореей, у 4-18% женщин с вторичной аменореей [Lamp Т., 2000; Nobuhiro S., Stephanie А., Rajkovic А., 2007]. Частота ПНЯ в популяции составляет около 1% [Kathryn J.,Wendy W.J. 2006].
Причины ПНЯ гетерогенны и могут быть представлены генетическими, ферментативными, аутоиммунными, инфекционно-токсическими, ятрогенными и психологическими факторами, дефектами в структурах гонадотропинов, а также их сочетанием [Santoro N., 2003; Bione S., 2000; Conway G.S., 2007].
Для нормального функционирования яичников необходимо отсутствие структурных нарушений в обеих хромосомах X. Основным участком, обеспечивающим нормальную деятельность яичников, является локус Xql3. Гены, ответственные за развитие ПНЯ, обозначают как POF1 и POF2. Они располагаются на участках хромосом Xq21.3-q27, Xq26.1-q27 и Xql3.3-q21.1 соответственно [Krauss С. М., 1987; Powel С. М., 1994]. Полная или частичная делеция в коротком или, чаще, в длинном плече хромосомы X приводит к развитию первичной или вторичной яичниковой аменореи. Несмотря на представленные в последние годы описания различных генов-кандидатов, лежащих в основе ПНЯ, до настоящего времени генетическая концепция формирования этой патологии не ясна. Во многом это обусловлено тем, что большинство авторов изучают отдельные гены, ответственные за развитие и функционирование яичников. Исследователи анализируют показатели у представительниц определенных национальностей, поэтому результаты нельзя экстраполировать на женщин русской популяции.
В последние годы выявлен определенный набор генов, который может отвечать за развитие ПНЯ. Формирование в них полной или частичной (пре) мутации, способствует развитию клинических симптомов недостаточности яичников, примером чего является обсуждаемая роль премутацни гена FMR1, расположенного в области Xq26-28, в генезе ускоренного апоптоза фолликулярного пула [Jacobs Р.А. et.al. 1991]. Клиническая значимость целесообразности проведения у этой категории больных генетических исследований подтверждается проведенными в 2005 и 2006 годах Национальным институтом детского здоровья и развития человека (NICHD) и Центром CDC ряда симпозиумов, на которых обсуждалась роль премутацни гена FMR1 в воспроизводстве и ее связь с репродукцией человека [Michael D., Wittenberger M.D. 2007]. У женщин со спорадическими формами ПНЯ частота премутацни гена FMR1 колеблется от 0,8 до 7,5%, в то время как при семейных формах заболевания до 13% [Conway G.S.1998, Bussani С. 2006]. Показано, что женщины-носительницы премутацни гена FMR1, намного чаще (38%) страдают олигоменореей, в сравнении с популяционными данными (6%) [Allingham-Hawkins D.J. 1999]. Несмотря на то, что сейчас общепризнанно, что ген FMR1 ассоциирован с истощением яичников, существует и противоположная точка зрения [Kenneson A., Cramer D.W., 1997]. В литературе описано более 128 пациенток с полной мутацией гена FMR1, однако, в сравнении со здоровыми женщинами, у них не наблюдалось увеличения частоты встречаемости преждевременного истощения яичников [Murray A, Ennis S. 2000].
Случайная инактивация хромосомы X (XCI) относится к общебиологическому процессу. Однако в ряде случаев происходит неслучайная (избирательная) инактивация хромосомы X (SXCI) одного из родителей, которая не связана с развитием какой-либо видимой патологии и ее частота в популяции оценивается 1,5-3,5% [Gale и соавт. 1997; Plenge и соавт. 1997; Lanasa и соавт. 1999]. В последние годы изучена связь неслучайной инактивации хромосомы X с преждевременным истощением яичников, при этом частота ее встречаемости составляет от 20 до 54,2% и зависит от национальной принадлежности изучаемой популяционной группы [Sato К., Uehara S. 2004]. Все выше изложенное указывает на необходимость проведения широкомасштабных молекулярно-генетических обследований россиянок для получения национальной базы данных. В настоящее время проведено крайне мало исследований, в которых с учетом выявленных хромосомных и генных нарушений в дальнейшем планируется стратегия ведения данного контингента больных. До настоящего времени не разработаны ранние прогностические критерии формирования ПНЯ, а также не изучены особенности клинического течения заболевания при семейных и спорадических формах. Все выше представленное позволило сформулировать цель и задачи исследования.
Цель исследования: Определить роль наследственной патологии в генезе ПНЯ и разработать ранние прогностические критерии формирования заболевания.
Задачи исследования:
1. Определить долю яичниковых аменорей в структуре обращаемости в гинекологические отделения НЦА ГиП за 10 лет и выявить среди них больных с идиопатической формой ПНЯ.
2. Изучить соотношение спорадических и семейных случаев ПНЯ и проанализировать особенности клинического течения заболевания у больных с хромосомными (патологией кариотипа) и молекулярно-генетическими формами заболевания.
3. Исследовать кариотип у больных с ПНЯ и определить долю структурных аберраций хромосомы X.
4. Определить частоту неслучайной инактивации хромосомы X (SXCI) у больных с ПНЯ.
5. Выявить представленность премутации гена FMR1 у больных с ПНЯ.
6. На основании полученных клинико-лабораторных данных разработать структуру причин, приводящих к ПНЯ, и выявить долю идиопатической формы заболевания.
7. Разработать прогностические критерии формирования преждевременной недостаточности яичников.
Научная новизна
Представлены основные причины истощения фолликулярного пула у больных с ПНЯ на основании комплексного системного подхода с использованием «больших» критериев диагностики аутоиммунной формы ПНЯ, современных методов оценки овариального резерва и расширенной панели генетических исследований (цитогенетическое исследование, SXCI и премутация гена FMR1).
Выделены наиболее прогностически значимые гормональные и генетические маркеры, характеризующие анатомо-функциональное состояние яичников, и установлена их роль в раннем прогнозировании формирования ПНЯ.
Изучено соотношение спорадических и семейных форм ПНЯ, уточнены особенности клинического течения заболевания у пациенток с молекулярно-генетическими причинами. Впервые представлены данные о преимущественном носительстве у этой группы больных HLA генотипа DRB1 11 в сочетании с аутоиммунным тиреоидитом.
У каждой четвертой больной выявлена SXCI. Премутация гена FMR1 обнаружена в 1,5% случаев при спорадической форме ПНЯ. Прослежена связь между увеличением числа CGG-повторов в гене FMR1 в пределах «серой зоны» от 40 до 50 копий и формированием ПНЯ.
Модифицирована формула Faddy для определения предполагаемого возраста воздействия повреждающего фактора на яичник.
Данными о выявленных структурных аберрациях хромосомы X и мутациях, сцепленных с хромосомой X, дополнены прогностические критерии формирования ПНЯ.
Практическая значимость
Расширен алгоритм обследования больных с ПНЯ: в традиционный гормональный мониторинг, HLA-генотипирование, ультразвуковую и гормональную диагностику овариалыюго резерва включены молекулярно-генетические маркеры, сцепленные с патологией хромосомы X — цитогенетическое исследование, выявление SXCI и премутации гена FMR1.
На основании анализа результатов обращаемости в гинекологические отделения НЦА ГиП изучена структура гипергонадотропных аменорей, показана высокая распространенность преждевременной недостаточности яичников среди больных с другими формами вторичных аменорей.
Установлено, что среди основных причин, способствующих формированию ПНЯ, хромосомные (патология кариотипа) и молекулярно-генетические нарушения составляют 32,1%. Низкий уровень мозаицизма и «недостаточность генов» хромосомы X в виде моносомии или полисомии у (5,6%) встречается с одинаковой частотой. Молекулярно-генетические причины, ассоциированные с преждевременным истощением фолликулярного пула яичников, у 25% больных представлены SXCI. Частота выявления SXCI не ассоциирована с возрастом пациенток и семейными формами заболевания. Премутация гена FMR1 выявляется крайне редко (1,5%).
Дополнены и уточнены ранние прогностические критерии формирования ПНЯ, к которым следует относить аномалии кариотипа, выявление SXCI, увеличение CGG- повтора в гене FMR1, включая «серую зону», носительство DRB1 01, DRB1 03, DQB 1 0501, DQB 1 0302 аллелей, преждевременную недостаточность яичников у матерей наших пациенток, аутоиммунный тиреоидит и олигоменорею с менархе, перенесенные эпидемический паротит и краснуху. Носительство у каждой второй пациентки HLA генотипа DRB1 11, указание на позднее менархе, наличие аутоиммунного тиреоидита, редкое до дебюта заболевания наступление спонтанных беременностей, являются преимущественными факторами риска формирования генетических форм ПНЯ.
Положения, выносимые на защиту
1. В структуре гипергонадотропных аменорей преждевременная недостаточность яичников встречается у каждой пятой больной. Для больных с преждевременной недостаточностью яичников характерна наследственная предрасположенность с более ранним (на 9 лет) дебютом заболевания у сибсов. При спорадической форме заболевания истощение фолликулярного аппарата развивается достоверно раньше, чем при семейной форме. Перенесенные в период пубертата вирусные инфекции оказывают отсроченное повреждающее воздействие на яичник.
2. Преждевременная недостаточность яичников относится к мультифакториальной патологии, в генезе которой значительная роль принадлежит молекулярно-генетическим и/или аутоиммунным нарушениям. Генетические причины представлены в основном хромосомной патологией (патология кариотипа) и мутациями генов, локализованных на хромосоме X.
3. При выявлении факторов риска формирования преждевременной недостаточности яичников с целью своевременной реализации репродуктивной функции и повышения качества жизни еще на доклиническом этапе развития заболевания показано динамическое мониторирование овариального резерва с использованием гормональных (ФСГ, Е2, ингибин В) и инструментальных (эхография яичников) методов обследования. Наличие достоверных маркеров его снижения требует раннего назначения заместительной гормональной терапии.
Апробация работы
Основные положения диссертации и результаты работы доложены на конгрессе «Современные технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний» (Москва, 2007) и IX Российском научном форуме «Мать и дитя» (Москва, 2007). Работа обсуждена на клинической конференции сотрудников отделения гинекологической эндокринологии ФГУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова Росмедтехнологий» 06.03.08. и заседании апробационной комиссии ФГУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова Росмедтехнологий» 24.03.08.
Внедрение результатов исследования в практику
Комплексное обследование, включающее использование иммунологических и молекулярно-генетических методов исследования у пациенток с ПНЯ внедрены в клиническую практику работы отделения гинекологической эндокринологии и научно-поликлинического отделения ФГУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова Росмедтехнологий». Материалы диссертации используются при чтении лекций по гинекологической эндокринологии. По теме диссертации опубликовано 13 научных работ.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 164 страницах компьтерного текста; состоит из введения и 5 глав (обзор литературы, материал и методы исследования, клиническая характеристика больных, результаты собственных исследований, обсуждение полученных данных), а также выводов, рекомендаций для внедрения в практику здравоохранения и списка литературы. Работа иллюстрирована 23 таблицами и 12 рисунками. Использованная литература включает 20 источников на русском и 208 на английском языках.
Клинико-патогенетические варианты ПИЯ
Менопауза, датируемая по последнему маточному кровотечению, в среднем наступает в 50,7 лет [65]. Этот возраст остается неизменным в течение последних столетий в отличие от возраста менархе, который снизился в первой половине XX века. Возраст менопаузы у каждой конкретной женщины определяется генетическими [180, 65] факторами и факторами окружающей среды [139, 65].
С конца 60-х годов под термином преждевременная недостаточность яичников подразумевают нефизиологическое прекращение менструаций у женщин в возрасте до 40 лет [126]. Частота встречаемости данной патологии колеблется от 1 до 3% в женской популяции, составляя 4-18% в структуре вторичных аменорей. [126, 65, 32].
Представленность у женщин ПНЯ для каждой декады до возраста 40 лет снижается в среднем в 10 раз. Так у тридцатилетних с нормальным кариотипом ее частота составляет 1:1000, у 20-летних - 1:10 000 и у девочек с дисгенезией гонад и первичной аменореей 1:100 000. Однако формирование ПНЯ варьирует в зависимости от этнической принадлежности: у женщин азиатского происхождения риск ее развития ниже, у афроамериканок он выше в сравнении с женщинами белой расы [125], что требует проведения популяционных исследований в каждой отдельно взятой стране с целью уточнения вклада генетических причин в региональную структуру гипергонадотропных аменорей.
Согласно современным воззрениям преждевременная недостаточность яичников может развиваться вследствие снижения фолликулярного пула, нарушенного фолликулогенеза или ускорения процесса апоптоза и атрезии фолликулов. Точная природа преждевременной недостаточности яичников неясна. Это состояние описывается как «многофакторный синдром», в развитии которого могут принимать участие генетические, аутоиммунные, инфекционно-токсические, психогенные факторы внешней среды, а также дефекты в структурах гонадотропинов [64, 84].
Клинические проявления ПНЯ варьируют в широких пределах. У большинства пациенток заболевание начинается с нарушений менструального цикла, в основном по типу олиго-спаниоаменореи, которые достаточно быстро переходят в стойкую аменорею. В прошлом у этой категории больных на фоне нормально развитых вторичных половых признаков с менархе отмечался регулярный ритм менструаций и до дебюта заболевания у них была сохранена генеративная функция. Дефицит половых гормонов в возрасте до 40 лет способствует формированию не только целой гаммы вазомоторных и эмоционально-вегетативных проявлений, но также является ведущим фактором риска развития сердечно-сосудистой патологии и снижения минеральной плотности костной ткани. В связи с тем, что все представленные выше метаболические нарушения сохраняются, по крайней мере, на протяжении 7-10 лет, предшествующих возрасту физиологической менопаузы, пациенток с ПИЯ следует выделять в особую группу риска, требующую постоянного диспансерного наблюдения и обязательного назначения заместительной гормональной терапии (ЗГТ).
Оценка гормонального статуса пациенток с ПНЯ свидетельствует о достоверном повышении содержания ФСГ и ЛГ до уровня более 40 МЕ/л и снижении содержания эстродиола менее 80 пмоль/л, что значительно ниже показателей, характерных для ранней фолликулярной фазы у женщин с регулярными менструациями.
Согласно данным Г.В. Тагиевой [18] у больных с ПИЯ на фоне закономерных для данной патологии соотношений ФСГ, ЛГ и эстрадиола отмечено андрогендефицитное состояние (снижение уровня тестостерона до0,8±0,1 пмоль/л).
Несмотря на то что ПНЯ - это необратимое состояние, у некоторых женщин могут наблюдаться периоды рецидивов и ремиссии, обозначаемые как «флюктуация функций яичников», в связи с чем по данным Conway в его клинике частота наступления беременности при ПНЯ составляет 1-5% [65, 222].
Таким образом, под термином «преждевременная недостаточность яичников» (ПНЯ) или «преждевременное выключение функции яичников» (ПВФЯ) подразумевают симптомокомплекс, формирующийся у женщин в возрасте моложе 40 лет и включающий в себя вторичную аменорею, признаки выраженного эстрогендефицита и вторичного бесплодия на фоне в среднем десятикратного повышения уровней гонадотропинов (ФСГ, ЛГ) [64, 122, 164,200].
Чем раньше наступает преждевременная менопауза, тем более выраженный стресс она вызывает. У женщин, достигших менопаузы раньше своих матерей, нередко возникает чувство несправедливости. Исследования показывают, что стресс, обусловленный осознанием своего отличия от сверстниц, - важнейший психологический фактор, превалирующий над всеми остальными психологическими и социальными проблемами, связанными с менопаузой, которые не зависят от семейного положения, образования и количества детей [222].
Установлено , что с момента рождения и до 50 лет число примордиальных фолликулов у женщин постепенно снижается с 1-2 млн. до 10 тыс., за счет процесса атрезии на стадии малых аптральных фолликулов [91].
Истощение яичников как результат «недостаточности генов» хромосомы X в гаплоидном наборе (Моносомия по хромосоме X)
Примордиальные герменогенные клетки происходят из энтодермы желточного мешка и мигрируют к гениталыюму гребню для формирования недифференцированных гонад. Мужские и женские половые железы первоначально морфологически не различимы. Недифференцированные гонады развиваются в яички, если эмбрион или, точнее, строма гонады имеет хромосомный набор 46,XY.
В отсутствие хромосомы Y недифференцированные гонады развиваются в яичники. Трансформация их в фетальные яичники начинается на сроке 50-55 дней эмбрионального развития. По настоящее время существуют противоречивые мнения, согласно которым дифференцировка в яичники представляет собой конституциональный путь развития (путь «по умолчанию») или существует набор специфических генов, продукты которых обеспечивают первичную дифференцировку яичников. Долгое время версия пути «по умолчанию» казалась наиболее правдоподобной [172, 92]. Однако недавно была предложена гипотеза о первичной направляющей роли специфических генов в дифференцировке яичников. Среди этих генов выделяют: IVT1, SF1, DAX-1, SOX3, Wnt-4 [3].
В настоящее время особая роль придается гену WT1 (супрессор опухоли Вилмса). Известно, что под влиянием гена WT1, клетки мезодермы трансформируются в почечный и адреногенитальный примордиумы. Последний под влиянием двух генов SF1 и DAX1 в последующем развивается в первичную гонаду. Ген WT1 локализован на коротком плече хромосомы X (Хр11-р13). Экспрессия этого гена у эмбриона человека происходит в тканях, производных мезодермы: почки, гонады (клетки Сертоли), мезотелий, а также в спинном и головном мозге начиная с 28-го дня беременности [3].
Ген стероидного фактора 1(57 7) локализован на длинном плече хромосомы X (Xq9-q33) и содержит семь экзонов. Ген SF1, и его нормальная экспрессия необходима для развития и функционирования, как коры надпочечника, так и первичной гонады. Известно, что его воздействие заключается не в инициации, а в поддержании нормального развития и образования первичной гонады в раннюю фазу становления репродуктивного тракта [3].
Первоначально на роль гена-кандидата в этом процессе был предложен ген DAX-1, локализованный на коротком плече хромосомы X (Хр21). Ген DAX-1 был весьма подходящим геном-кандидатом, так как он при дупликации направляет дифференцировку 46,XY эмбрионов по женскому типу [39]. Однако проведенные работы на трансгенных XX мышах, лишенные гена Ahch, (который является аналогом DAX1) неожиданно продемонстрировали у них дифференцировку яичников, овуляцию и даже дали потомство [223].
Таким образом, Ahch не может считаться единственным геном ответственным за первичную дифференцировку яичников, как у мышей, так и у человека. Установлено, что белок гена DAX1 репрессирует экспрессию гена StaR и, таким образом, блокирует образование стероидов, снижая активность P450scc и 3(3-гидроксистероидной дегидрогеназы, т.е. он является антагонистом гена, определяющего развитие яичка (SRY).
В процессе дифференцировки первичной гонады участвуют также множество других генов SOX3, Wnt-4. Значимость этих генов еще не полностью осознанна, но считается, что белок гена SOX3 у плодов женского пола доминирует над SRY, таким образом, дифференцируя первичную гонаду в яичник.
Считается, что белок гена Wnt-4 угнетает развитие интерстициальных клеток в клетки Лейдига и способствует формированию линии женских герменогенных клеток [3].
К наиболее частым геномным мутациям относится мопосомия, при этом важно подчеркнуть, что только, мопосомия по хромосоме X совместима с жизнью эмбриона. Причиной, приводящей к анеуплоидии (изменению числа хромосом в диплоидном наборе, некратному гаплоидному), является нарушение процесса мейоза во время клеточного деления при образовании половых клеток. Хромосомы, которые в норме должны делиться во время мейоза, остаются соединенными вместе и в анафазе отходят к одному полюсу клетки. Таким образом, возникают две гаметы, одна из которых имеет добавочную хромосому, а другая не имеет этой хромосомы. При оплодотворении гаметы с нормальным набором хромосом гаметой без одной хромосомы в 50% случаев возникает зигота с моносомией [2].
Мопосомия по хромосоме X, возможно лежит в основе 50% случаев гипергонадотропного гипогонадизма, при этом в 80% 45,Х случаев хромосома X имеет материнское происхождение (Хш). В 20% случаях она имеет отцовское происхождение (Хр) [137, 59]. Выше изложенные молекулярно-генетические наблюдения подтверждаются клиническими результатами, на основе которых было показано, что у женщин при синдроме Шерешевского-Тернера (45,Х), первоначально в эмбриональном периоде в яичниках обнаруживаются герменогенные клетки. Подобные результаты были получены в результате гистологического изучения гонад абортусов первого триместра беременности с кариотипом 45,Х, которые составляют около 10% всех случаев спонтанного прерывания беременности на ранних сроках. Причину отсутствия герменогенных клеток в пубертатном возрасте у девочек с 45,Х кариотипом объясняют тем, что первая фаза мультипликации зародышевых ооцитов у них протекает нормально, а затем до 24 недели внутриутробного развития в яичнике плода происходит усиленная атрезия фолликулов, в результате которой к моменту рождения девочки яичники практически не содержат ни одного примордиалыюго фолликула. Согласно другой теории, яичники усиленно теряют герменогенные клетки в течение первой декады жизни девочки [44]. Факт присутствия тяжей вместо гонад у взрослых больных с синдромом Шерешевского-Тернера (45,Х), вступает в некий конфликт с общебиологическим законом, согласно которому у многих млекопитающих с моносомией по хромосоме X наблюдается нормальное развитие яичников. Гипотетическое объяснение этому явлению состоит в том, что ключевые гены на гетерохроматизированной (неактивной) хромосоме X не инактивированы. Предположительно, 5% из 2000 генов, локализованных на хромосоме X, избегают инактивации [214].
Оценка состояния систем и органов с помощью специальных лабораторных и инструментальных методов
В соответствии с поставленной целью и задачами исследования в ходе выполнения работы проанализированы 36 180 историй болезни пациенток, проходивших лечение в гинекологических отделениях НЦАГиП с 1994 по 2003г, а также обследовано 199 женщин: у 72 из которых в возрасте от 18 до 40 лет (средний возраст 34,2±1,3 года) диагностирована ПНЯ.
Группу контроля составили: - 97 женщин русской национальности - доноров крови, для исследования возможных ассоциаций болезней с системой HLA-II класса; - 15 здоровых фертильных женщин аналогичной возрастной группы; - 15 женщин в постменопаузе.
Критерии включения в исследование: возраст женщин от 18 до 40 лет, уровень ФСГ 40 МЕ/л в двух определениях, отсутствие самостоятельной менструации 6 и более месяцев.
Критерии исключения из исследования: женщины с первичной гипергонадотропной аменореей, с тяжелыми наследственными заболеваниями (галактоземия, блефарофимоз), ятрогенными причинами гипергонадотропной аменореи (операции на яичниках, химиотерапия, лучевая терапия).
Для выявления структуры гипергонадотропных аменорей за десятилетний период нами проводилось ретроспективное изучение архивного материала ПІД АГиП на основе просмотра 36 180 историй болезни пациенток, находившихся в гинекологических отделениях, с последующим отбором документов пациенток с яичниковой гипергонадотропной аменорей. 2.2. Методы обследования Клинические методы.
Находившиеся под наблюдением больные подвергались углубленному клиническому обследованию, которое проводилось по составленной карте и включало: сбор и анализ жалоб, детальное изучение анамнеза, объективное обследование. Были проанализированы особенности заболеваемости, наличие профвредности, стрессовые ситуации. Особое внимание уделяли наследственности, и в частности, эндокринной патологии у ближайших родственников по линии матери и отца, становлению менструального цикла и репродуктивной функции, причинам и характеру нарушений менструального цикла и репродуктивной функции, связи с предшествующей терапией.
При объективном обследовании учитывали особенности телосложения, определяли индекс массы тела (ИМТ) по формуле предложенной в 1978 G. Вгеу [54]: ИМТ= Масса тела, (кг) / рост, (см2).
Специальные методы исследования включали: ультразвуковые, эндоскопические методы, иммуноферментный и радиоиммунный анализ, метод проточной цитофлуометрии, полимеразной цепной реакции, цитогенетические методы исследования, рентгенологический метод, использование специальных анкет.
Гинекологическое обследование
Гинекологическое исследование включало осмотр шейки матки и влагалища в зеркалах. При осмотре с помощью зеркал обращали внимание на емкость влагалища, складчатость, окраску слизистой оболочки. Оценивали состояние шейки матки: цилиндрическая, коническая, субконическая. При бимануальном исследовании определяли положение матки, размеры матки и яичников.
Функциональное состояние гипоталамо-гипофизарно надпочечниково-яичнниковой и тиреоидной систем оценивали по результатам определения уровня гипофизарных и стероидных гормонов.
Гормональный статус пациенток оценивали по содержанию в сыворотке крови ЛГ, ФСГ, Е2, Т, ингибин В, ДГА-S, F, ТТГ, Тз, Т4(св.). Забор крови производили из локтевой вены. Концентрацию гормонов определяли методом иммуноферментного или радиоиммунного анализа с помощью соответствующих тест-систем. Уровни гормонов определяли в лаборатории ФГУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова Росмедтехнологий» /руководитель профессор, д.б.н. Н.Д.Фанченко/.
Цнтогснстичсскнс методы исследовании.
Карнотнп - исследовали по общепринятому методу Seabright (G-окраска). Препараты хромосом помещали в 0,25% раствор трипсина на 10 - 30 секунд при комнатной температуре, затем трижды промывали в этиловом спирте в концентрации-70ог96о7-100о"сэкспозицией не-менее 30 секунд в каждом растворе. Препараты высушивали на воздухе при комнатной температуре. Для окрашивания препаратов использовали 5% раствор красителя Гимза, приготовленного на фосфатном буфере (рН 6,8). Процедура окрашивания длилась 4- 5 минут. Затем препараты промывали дистиллированной водой и высушивали на воздухе при комнатной температуре. Кариотип исследовали в лаборатории генетики ФГУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова Росмедтехнологий» /руководитель отделения профессор, д.м.н. В.Д. Бахарев/.
Состояние гипоталамо- гипофизарно-яичниково-надпочечниковой системы
Концентрация окисленного ТМБ измеряется фотометрически, которая пропорциональна концентрации антиовариальных антител в образце. Результаты считались положительными при уровне аутоантител выше 11 Е/мл. Антитела к ТГ и ТПО определяли методом иммуноферментного анализа по стандартной методике. Выделение лейкоцитов из периферической крови методом градиентного центрифугирования.
5 мл гепаринизированной крови (20ЕД/мл) разводили 2 раза забуференпым фосфатами физиологическим раствором (PBS; РН =7,2-7,4) и наслаивали на 4 мл среды для выделения клеток «Ficoll-Pague» плотностью 1,077. Затем производили центрифугирование в течение 30 мин при 400g Клетки, отобранные из интерфазного кольца, собирали и двукратно отмывали PBS. Осадок ресуспендпровали в PBS, разводили до концентрации 0,5-1 106 кл/мл и использовали для мечения моноклональными антителами.
Определение иммуноглобулинов класса A. G. М.
Концентрацию иммуноглобулинов трех основных классов (A,G, М) определяли в сыворотке венозной крови женщин методом радиальной иммунодиффузии по Манчини.
Характеристика субпопуляционного состава лейкоцитов периферической крови методом проточной цитофлуориметрии.
Для фенотнпического анализа клеточных популяций лейкоцитов периферической крови были использованы моноклональные антитела к кластерам дифференцировки клеток (CD) , конъюгированные с FITC или РЕ ( Caltag»,CUJA).
Для изучения распределения антигенов главного комплекса гистосовместимости (HLA) II класса использовали метод полимеразной цепной реакции.
На первом этапе проводилось выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови. Выделение ДНК проводили по методу Higuchi некоторыми модификациями. 0,5 мл крови, взятой с EDTA в качестве антикоагулянта, смешивали в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках типа Эппендорф с 0,5мл лизирующего раствора, состоящего из 0,32М сахарозы, 10 мМ Трис - НС1 рН 7,5, 5мМ MgCl2, 1% Тритона Х-100, центрифугировали в течение 1 мин. при 10000 об/мин, супернатант удаляли, а осадки клеточных ядер два раза промывали указанным буфером. Последующий протеолиз проводили в 50 мкл буферного раствора, содержащего 50мМ КС1, ЮмМ Трис-HCl рН 8,3, 2,5мМ MgCl2, 0,45% NP-40, 0,45% Твина- 20 и 250мкг/мл протсиназы К при 37С в течение 20 мин. Инактивировали протеиназу К нагреванием в твердотельном термостате при 95С в течение 5 мин. Полученные образцы ДНК сразу использовали для типирования, либо хранили при -20С. Концентрация ДНК, определенная по флуоресценции с Hoechst 33258 на ДНК-флуориметре (Hoefer, США), составляла в среднем 50-100 мкг/мл. Общее время процедуры выделения ДНК составляло 30-40 мин. .
Полимеразная цепная реакция. Амплификация выделенной ДНК.
Полимеразную цепную реакцию проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 1мкл образца ДНК и следующие концентрации остальных компонентов: 0,2мМ каждого дІІТФ (дАТФ, дЦТФ, дТТФ и дГТФ), 67мМ Трис-HCl рН 8,8, 2,5мМ MgCl2, 50мМ NaCl, 0,1мг/мл желатина, 1мМ 2-меркаптоэтанол, а также 1 единицу термостабильной
ДНК-полимеразы. Для предотвращения изменения концентраций компонентов реакционной смеси из-за образования конденсата реакционную смесь покрывали 50 мкл минерального масла (Sigma, USA).
Концентрацию праймеров подбирали отдельно для каждой смеси. Амплификацию проводили на многоканальном термоциклере «МС2» (АО «ДНК-Технология», Москва).
Типирование локуса DRB1 проводили в два этапа. Во время первого раунда геномная ДНК амплифицировалась в двух различных пробирках. В первой пробирке использовалась пара праймеров, амплифицирующая все известные аллели гена DRB1 (праймеры DRB_sen и DRB_as-) а во второй -пара праймеров, амплифицирующая только аллели, входящие в группы DR3, DR5, DR6, DR8. В обоих случаях температурный режим амплификации (для термоциклера «МС2» с активным регулированием) был следующим: 1.94С- 1 мин. 2. 94С- 20 сек. 7 циклов 67С- 2 сек. 3. 92С- 1 сек. 28 циклов _____ 65С- 2 сек. Полученные продукты разводили в 10 раз и использовали на втором раунде. При амплификации на втором раунде использовали следующий температурный режим: 1. 92С- 1 сек. 15 циклов 64С- 1 сек. Типирование локуса DQB1 также проводилось в два этапа. На первом раунде был следующий температурный режим: 1.94 С-J мин. 2. 94 С-20 сек. 7 циклов 67 С - 5 сек. 3. 93 С- Ісек. 28 циклов 65 С - 2 сек. На втором раунде продукты второго раунда разводили в 10 раз и проводили амплификацию в следующем температурном режиме: 1. 93С - 1 сек. 12 циклов 67С - 2 сек.
Идентификацию продуктов амплификации и их распределение по длинам проводили в ультрафиолетовом свете (ЗЮ) после электрофореза в течение 15 мин либо в 10% ПААГ, 29:1 при напряжении 500В, либо в 3% агарозном геле при напряжении 300В (в обоих случаях пробег составлял 3-4 см) и окрашивании бромистым этидием. В качестве маркера длин использовали перевар плазмиды pUC19 рестриктазой Msp I. Статистическую значимость различий между частотой встречаемости антигена у больных и здоровых определяли по критерию % -квадрат с поправкой на общее число тестируемых антигенов (рс), различия в частоте гаплотипов - по угловому преобразованию Фишера. Для вычисления силы ассоциации с заболеванием использовали показатель относительного риска (RR), который вычисляется по формуле Woolf [188, 42].
