Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 2
ОГЛАВЛЕНИЕ 3
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 11
1.1. МОЛЕКУЛЯРНАЯ СТРУКТУРА ИЛЕГО РЕЦЕПТОРА И ИЛ-18СБ 11
1.2. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ИЛ-18 15
1.3. РОЛЬ ИЛ-18 В ПАТОГЕНЕЗЕ ИММУНО-ОПОСРЕДОВАННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 34
1.4. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ИЛ-18СБ И ВОЗМОЖНОСТИ ЕГО ТЕРАПЕТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ 40
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 44
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 55
3.1. ХАРАКТЕРИСТИКА РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ИНТЕРЛЕЙКИНА 18
3.1.1. ИММУНОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛУЧЕННОГО ИЗ
ПРОДУЦЕНТА Е. COLI 55
3.1.2. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА рчИЛ-18ШУГП10 58
3.1.3. ВЛИЯНИЕ рчИЛ-18 НА ФОРМИРОВАНИЕ ИММУННОГО ОТВЕТА В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬ НЫХ МОДЕЛЯХ IN VIVO 60
3.1.4. ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ -18 63
3.2. ХАРАКТЕРИСТИКА РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ИЛ-18 СВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА.
3.2.1. ИММУНОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА рчИЛ-18СБ 64
3.2.2. ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ рчИЛ-18СБ IN VITRO 66
3.2.3. ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ рчИЛ-18СБ IN VIVO 67
3.2.4. ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ рчИЛ-18СБ 68
3.3. ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ СВОЙСТВА ТРАНСГЕННОГО РАСТЕНИЯ DAUCUS CAROTA L., НЕСУЩЕГО ГЕН ИЛ-18 ЧЕЛОВЕКА 3.3.1. ВЛИЯНИЕ ПЕРОРАЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ ТРАНСГЕННОЙ МОРКОВИ, НЕСУЩЕЙ ГЕН чИЛ-18, НА ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА СПЛЕНОЦИТОВ МЫШЕЙ 70
3.3.2. ВЛИЯНИЕ ПЕРОРАЛЬНОГО ПРИМЕНЕНИЯ ТРАНСГЕННОЙ МОРКОВИ НА ФОРМИРОВАНИЕ ИММУННОГО ОТВЕТА В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ
МОДЕЛЯХ НА МЫШАХ 72
3.3.3. ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ ПЕРОРАЛЬНОГО ПРИМЕНЕНИЯ ТРАНСГЕННОГО РАСТЕНИЯ, НЕСУЩЕГО ГЕН ИЛ-18 73
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 76
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 94
ВЫВОДЫ 94
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 96
Введение к работе
Одно из достижений современной медицины состоит в разработке новых лекарственных средств, полученных с помощью генной инженерии человеческих рекомбинантных цитокинов. Цитокины - это белковые или полипептидные продукты, которые являются медиаторами межклеточных коммуникаций и служат связующим звеном между иммунной и другими системами организма [5]. В настоящее время известно несколько сотен цитокинов, некоторые из них используются в клинической практике с диагностической целью, для профилактики и терапии различных заболеваний [152].
Перспективным препаратом для создания на его основе лекарственного средства является-интерлейкин-18. ИЛ-18-это цитокин, участвующий в функционировании иммунокомпетентных клеток, в том числе и в регуляции экспрессии и продукции многих других цитокинов. ИЛ-18 стимулирует пролифе-ративную активность Т-лимфоцитов, повышает литическую активность НК-клеток, увеличивает продукцию ИФНу, ГМ-КСФ [41, 223], ФНО-а [49, 125], ИЛ-2 [97, 121], ИЛ-5, ИЛ-6 [78, 144, 176], ИЛ-8 и ИЛ-ip [170, 228], PGE2 [54, 86] активированными Т-, В-, НК-клетками. ИЛ-18 проявляет противоопухолевую активность через стимуляцию продукции ИФНу, оксида азота N0 [94, 79, 224], снижение ангиогенеза [33, 205], повышение активности НК-клеток и ци-тотоксических Т-лимфоцитов [122], повышение экспрессии апоптогенного фактора Fas -ligand [59, 64]. В экспериментах in vitro также показано, что ИЛ-18 способен стимулировать экспрессию молекул адгезии (ICAM-1 и VCAM) [120, 129]. Еще одной из особенностей ИЛ-18 является конститутивная экспрессия многими типами клеток различных систем организма. Это отличает его от многих других иммуномодулирующих цитокинов, которым свойственна индуцибельная экспрессия. Обладая обширным спектром биологических эффектов, ИЛ-18 участвует в патогенезе некоторых заболеваний, сопровождающихся хроническим воспалением и деструкцией тканей, например, при ревматоидном артрите [109, 150], диабете [179,180] и болезни Крона [127,166]. В связи с этим, блокатор ИЛ-18, представляющий собой физиологическую ловушку-рецептор, может являться перспективным фактором для отмены побочных действий ИЛ-18. ИЛ-18 связывающий белок (ИЛ-18СБ), являющийся циркулирующим антагонистом ИЛ-18, конститутивно экспрессируется спленоцитами и относится к суперсемейству иммуноглобулинов. ИЛ-18СБ связывает ИЛ-18 путем формирования высоко аффинного комплекса (Kd=400pM) и тем самым нейтрализует эффекторные функции цитокина ИЛ-18 [141].
Данные о значительной роли ИЛ-18 в регуляции большого числа иммунных реакций позволяют предположить, что в ближайшем будущем ИЛ-18 и ИЛ-18СБ займут свое достойное место в арсенале препаратов для борьбы с множеством патологических состояний человека.
В качестве продуцентов для получения белков-цитокинов медицинского назначения, в настоящее время широко используются клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих. Однако такие системы имеют определенные недостатки. В клетках прокариот не происходят посттрансляционная модификация и фолдинг многих эукариотических белков. Использование клеток дрожжей и млекопитающих ограничено высокой себестоимостью выхода рекомбинантных белков [181]. По сравнению с вышеупомянутыми системами экспрессии, растения, как продуценты иммунорегуляторных белков, имеют ряд особенностей и преимуществ. Прежде всего, необходимо отметить, что в клетках высших растений происходят гликозилирование и фолдинг белков, сходные с таковыми в клетках млекопитающих. Культивирование растений не требует дорогостоящего оборудования, а сельскохозяйственные масштабы продукции гарантируют доступность рекомбинантного препарата. Исследования в этой области идут в направлении создания трансгенных растений несущих опухолевые, инфекционные антигены или иммунорегуляторные цитокины, с целью моделирования специфических иммунных реакций. В ряде случаев, например, при использовании трансгенных растений в качестве "съедобных вакцин" выделение белка в чистом виде не требуется. [36]. В настоящее время с различной эффективностью трансфекции подвергнуты: картофель, кукуруза, салат, люцерна, морковь, томаты, огурцы, табак и некоторые другие [58,174,196, 203, 222, 232]. Данная технология относится к социально значимым для России и найдет широкое применение для лечения вторичных иммунодефицитов, воспалительных и аутоиммунных заболеваний.
Таким образом, принимая во внимание уникальность любых рекомби-нантных продуктов, основанную на особенностях продуцентов, методов выделения, очистки и хранения полученных препаратов, мы решили изучить биологические специфические свойства рчИЛ-18 и рчИЛ-18СБ, полученных по оригинальной методике из продуцента Е.соїі, в различных экспериментальных моделях. Поскольку существуют данные по эффективности перорального введения антигенов и цитокинов, а также есть полученные в последние годы результаты по использованию трансгенных растений, нам представлялось актуальным в данной работе оценить эффекты перорального введения трансгенного растения Daucus carota L., несущего ген ИЛ-18 человека.
Цель работы: Охарактеризовать биологическую активность рекомбинантных белков ИЛ-18 и ИЛ-18СБ, полученных по оригинальной методике из клеток-продуцентов Escherichia СОІІ, а также иммуномодулирующие эффекты трансгенного растения Daucus carota L, несущего ген ИЛ-18 человека, при пероральном применении. В соответствие с целью были поставлены следующие задачи.
Задачи исследования: 1. Изучить рчИЛ-18 и рчИЛ-18СБ, полученные из продуцентов Е.соїі по оригинальной методике, в реакции иммуноанализа по связыванию со специфическими антителами.
