Введение к работе
Актуальность. Открытия последних лет, полученные благодаря стремительному развитию молекулярной биологии, убедительно свидетельствуют о том, что злокачественная трансформация клеток нередко обусловлена активацией протоонкогенов, которая заключается в количественном или качественном изменении самих протоонкогенов и кодируемых ими белков. Наиболее частой причиной активации протоонкогенов при лейкозах являются хромосомные перестройки. В последние годы накапливается все больше и больше данных о том, что течение лейкозов и их прогноз во многих случаях довольно тесно коррелирует с типом хромосомных транслокаций (Cleary M.L. 1991; Rabbits Т.Н., 1991; Sawyers C.L. et al., 1991; Korsmeyer S.J. 1992; Nichols J. et al., 1992; Bartram C.R. 1993).
Известно, что более чем у 90% больных ХМЛ и 5-10% больных острыми лимфолейкозами при анализе кариотипа обнаруживается филадельфийская хромосома (Ph-хромосома), возникающая в результате хромосомной транслокации t (9; 22), которая приводит к образованию BCR-ABL химерного гена. В результате образования химерного BCR-ABL гена продуцируется белок p210BCR*ABLiura белок pl90DCR"ABL, которые играют важную роль в становлении последующей лейкозной трансформации (Konopka J.B. et al., 1984; Bartram C.R., 1985; Saglio G. et al., 1986).
Ph-хромосома с успехом выявляется при цитогенетическом исследовании в большинстве случаев, однако, в ряде случаев хромосомная транслокация t (9; 22) не приводит к образованию специфического цитогенетического маркера (Ph-хромосомы), а выявляется только на молекулярно-генетическом уровне. Подобная ситуация встречается в 5 % случаев больных ХМЛ и 10-15% больных острыми лимфолейкозами.
Клинический опыт последних лет свидетельствует о принципиальной возможности излечения ряда гемобластозов или, по крайней мере, значительного удлинения безрецидивного периода, что стало возможным благодаря новым подходам к их терапии. Успех терапии и последующая тактика ведения больных во многом зависят от полноты эрадикации лейкозного клона, оценка которой с помощью традиционных цитогенетических методов часто невозможна ввиду их относительно низкой чувствительности.
Это делает актуальной задачу по разработке и внедрению в практику высокочувствительных молекулярно-генетических методов идентификации остаточных лейкозных клеток в организме больного, то есть для диагностики минимальной остаточной болезни (МОБ). Использование этих методов для выявления хромосомной транслокации t (9; 22) у больных ХМЛ и ряда больных ОЛЛ неоценимо в ситуациях, когда хромосомная транслокация не сопровождается возникновением цитогенетического маркера (Ph-хромосомы), или доля клеток, несущих Ph-хромосому минимальна - после интенсивной
химиотерапии, трансплантации гемопоэтических клеток, курсо интерферонотерапии.
В настоящее время лучшими для детектирования хромосомно перестройки t (9; 22), приводящей к образованию BCR-ABL гена, считаютс методы, основанные на использовании полимеразной цепной реакци (WXKawasaki E.S et. al., 1988; Roth M.S. et al., 1989; Lee M.-Sh. et al., 1991 Fey M.F. et al., 1991; Negrin R.S. et al., 1991; Maurer J. et al., 1991). Он отличаются высокой чувствительностью (выявляют 1 лейкозную клетку сред 100000 нормальных) и специфичностью и весьма разнообразны. Одни требую дополнительной блот-гибридизации, в других оценка результатов производите непосредственно по анализу продуктов ПЦР в геле, но используются или одно или двухраундовая ПЦР. Однако, до настоящего времени остается открыты! вопрос о наиболее оптимальном варианте метода.
В связи с этим, актуальной представляется разработка оптимальноп метода, который бы с одной стороны обладал высокой точностью і специфичностью, а с другой - был бы относительно прост, недорог и мог бі быть использован в клинической практике.
Цель работы: Разработка и внедрение в клиническую практик усовершенствованного метода определения BCR-ABL химерного гена дл идентификации хромосомной транслокации t (9; 22) с помощью ПЦР при XMJ и некоторых других гемобластозах, а также для диагностики МОБ.
Задачи исследования:
1. Апробировать различные методы выделения тотальной клеточной РНЬ
из клеток периферической крови больных лейкозами и здоровых доноров I
провести сравнительный анализ пригодности полученных препаратов РНК дш
дальнейшего молекулярно-генетического исследования.
-
Сравнить чувствительность двух наиболее часто используемы: подходов постановки ПЦР для детекции химерного транскрипта BCR-ABL однораундовый и двухраундовый (с применением дополнительной парь «гнездовых» праймеров во втором раунде ПЦР).
-
Оценить возможность использования Tth-полимеразы в качеств! обратной транскрипгазы при постановке РТ-ПЦР для детекции BCR-ABI химерного гена.
-
Разработать и внедрить наиболее простой и доступный дл> клинического использования молекулярно-генетический метод идентификацш хромосомной транслокации t (9; 22).
Научная новизна. В ходе выполнения диссертационного исследованш впервые получены следующие данные:
1. Доказана возможность использования одного фермента - Ttl полимеразы при постановке РТ-ПЦР для детекции BCR-ABL химерного гена;
2. Предложен модифицированный, наиболее доступный и
информативный метод определения хромосомной транслокации t (9; 22);
продемонстрирована его высокая чувствительность и специфичность, показана
возможность его применения для диагностики и мониторинга МОБ;
3. Предложен мультипраймерный метод РТ-ПЦР с использованием
одного фермента, позволяющий в ходе одной реакции проанализировать
исследуемый образец РНК на наличие или отсутствие химерного транскрипта
BCR-ABL, а также оценить качество проведения РТ-ПЦР и качество
тестируемой РНК;
-
Установлено, что несмотря на некоторое снижение чувствительности мультипраймерного метода РТ-ПЦР по сравнению с модифицированным, он может быть использован для первичной диагностики t (9; 22) транслокации, так как позволяет регистрировать одну лейкозную клетку на 10000 нормальных;
-
Показано, что оба предложенных метода имеют ряд преимуществ по сравнению с опубликованными прототипами:
сокращается время проведения реакции
уменьшается риск контаминации
удешевляется стоимость анализа
Практическая значимость работы. Модифицированный и мультипраймерный методы РТ-ПЦР прошли апробацию и используются в клинической практике гематологических отделений РосНИИГТ и Клинического Центра передовых медицинских технологий г. С.-Петербурга (КЦГГМТ). С помощью разработанных методов были проведены молекулярно-генетические исследования для детекции хромосомной транслокации t (9; 22) у 80 больных ХМЛ и 40 больных ОЛ.
Применение в клинической практике модифицированного метода РТ-ПЦР (на примере 12 больных после алло- или ауто-ТКМ) показало, что РТ-ПЦР является наиболее приемлемым методом для диагностики и мониторинга МОБ при обследовании больных ХМЛ и ОЛЛ.
Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на Ш Всероссийском съезде гематологов и трансфузиологов (Санкт-Петербург, 1996), 4-ой международной конференции "Спид, рак и родственные проблемы." (Санкт-Петербург, 1996). По материалам диссертации составлены и утверждены МЗ РФ (11/11/96) методические рекомендации № 96/220 «Быстрый метод детекции BCR-ABL химерного гена для диагностики хромосомной транслокации t (9; 22)».
Публикации. По теме диссертации опубликованы 6 печатных работ, 2 работы приняты к печати.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 11' страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы описания материалов и методов, результатов собственных исследований обсуждения полученных данных, выводов и указателя литературы. Работ; иллюстрирована 14 рисунками и 7 таблицами. Список литературы включает 12І публикаций.
Положения, выносимые на зашиту.
-
Tth-полимераза может быть использована не только в качестве ДНК' полимеразы, но и обратной транскриптазы при постановке РТ-ПЦР дш детекции хромосомной транслокации t (9; 22).
-
Применение Tth-полимеразы не снижает чувствительности метода, у при проведении 40 циклов амплификации позволяет регистрировать одну клетку, несущую BCR-ABL ген среди 100000 нормальных.
-
Применение мультипраймерной технологии ПЦР позволяет упростил процедуру проведения анализа.
-
Разработанные методы РТ-ПЦР эффективны при использовании их і клинической практике для первичной диагностики хромосомной транслокации t (9; 22) и диагностики и мониторинга минимальной остаточной болезни.
