Содержание к диссертации
Список используемых сокращений 3
Введение 6
Глава 1. Обзор литературы 10
Глава 2. Материалы и методы исследования 56
Характеристика больных 56
Программы химиотерапии, используемые у больных ММ 61
Методы исследования 62
Статистический анализ полученных данных 70
Основные понятия 71
Глава 3. Результаты и их обсуждение 72
Результаты клинического исследования 72
Результаты детекции реаранжировок генов IgH 89
Мониторинг минимальной резидуальной болезни 105
Результаты и обсуждение статистического анализа 122
Глава 4. Заключение 133
Выводы 144
Список использованной литературы 145
Список используемых сокращений:
ММ множественная миелома
ВХТ высокодозная химиотерапия
МП программа химиотерапии, включающая мелфалан и преднизолон
КМ костный мозг
ПР полная ремиссия
МРБ минимальная резидуальная болезнь
ПЦР полимеразная цепная реакция
МГНГ моноклональная гаммапатия неясного генеза
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК рибонуклеиновая кислота
lg иммуноглобулин
IgH тяжелая цепь иммуноглобулинов
V-регион вариабельный регион
VH-ген ген вариабельного региона тяжелых цепей иммуноглобулинов
СЦИ стандартное цитогенетическое исследование
FISH флюоресцентная гибридизация in situ
ОПлЛ острый плазмобластный лейкоз
t транслокация
ИЛ интерлейкин
ТС классификация ММ
FGFR3 рецептор 3 фактора роста фибробластов
MMSET Set домен множественной миеломы
c-MAF транскрипционный фактор
IRF регулятор транскрипции интерферона
ХЛЛ хронический лимфолейкоз
Rb ген ретинобластомы
GP гликопротеин
VEGF васкулярный эндотелиальный фактор роста
HGF фактор роста гепатоцитов
FGF фактор роста фибробластов
RANKL рецептор нуклеарного фактора каппа-В
IgL легкая цепь иммуноглобулинов
N-конец аминоконец протеина (NH2)
СН константный регион (сегмент) тяжелой цепи иммуноглобулинов
J (JH) соединительный регион (сегмент)
D регион, определяющий разнообразие
D-JH неполная перестройка генов тяжелых цепей иммуноглобулинов
VH-D-JH полная перестройка генов тяжелых цепей иммуноглобулинов
L лидерная последовательность
М-РНК матричная рибонуклеиновая кислота
CDR регион, определяющий комплементарность
FWR каркасные участки вариабельного региона иммуноглобулинов
р2-М р-2 микроглобулин
ОВ общая выживаемость
ИМ индекс метки
СРБ С-реактивный белок
БСВ бессобытийная выживаемость
Pig сывороточный парапротеин, моноклональный иммуноглобулин
г/л грамм в литре
ТСК трансплантация стволовых клеток
ЧР частичная ремиссия множественной миеломы
40 частичный ответ
МО минимальный ответ
00 отсутствие ответа
FLC метод анализа свободных легких цепей иммуноглобулинов
М-2 программа химиотерапии, включающая винкристин, мелфалан,
кармустин, циклофосфамид, преднизолон
VAD программа химиотерапии, включающая винкристин, адриамицин,
преднизолон
ИНФ интерферон
ТКМ трансплантация костного мозга
Гр грей
Ауто-ТСКК трансплантация аутологичных стволовых клеток крови
HDM мелфалан в высоких дозах
EDAP курс химиотерапии, включающий этопозид, дексаметазон, алексан,
цисплатин
HDCph курс циклофосфана в высоких дозах
Алло-ТКМ трансплантация аллогенного костного мозга
Алло-ТСК трансплантация аллогенных стволовых клеток
ФНО фактор некроза опухоли
VEGF эндотелиальный фактор роста сосудов
ОЛЛ острый лимфобластный лейкоз
ОТ-ПЦР обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция
MP молекулярная ремиссия
ГНЦ Гематологический научный центр
РАМН Российская академия медицинских наук
РАН Российская академия наук
мкмоль/л микромоль в литре
п число
НЬ гемоглобин
СОЭ скорость оседания эритроцитов
мм/ч миллиметров в час
ммоль/л миллимоль в литре
Са кальций
БВ болезнь Вальденстрема
СП солитарная плазмацитома
ЕД международные единицы
NH4CI раствор хлорида аммония
STE раствор NaCI - трис-этилендиаминтетраацетат
мкл микролитр
мл миллилитр
об/мин оборотов в минуту
пмоль пикомоль
dNTP дезоксинуклеотидтрифосфаты
мМ миллимоль
ПААГ полиакриламидный гель
М1-М46 обозначение больных
М маркер длины ПЦР-фрагментов pBR322/Hpall
п.н. пар нуклеотидов
ОД оптическая плотность
ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота
рН реакция среды
нм нанометр
Введение к работе
Актуальность проблемы.
В лечении множественной миеломы (ММ) выделяют два основных химиотерапевтических подхода. Принципом так называемой стандартной терапии миеломной болезни является длительное, практически непрерывное применение химиопрепаратов в небольших дозах (схемы «МП», «М2»). Программы высокодозной химиотерапии (ВХТ) основаны на принципе интенсификации дозы химиотерапевтического воздействия. Интенсивное лечение ММ рассчитано на максимальное уменьшение опухолевой массы на первых этапах ВХТ с последующей трансплантацией аутологичных или аллогенных стволовых клеток крови (СКК) или костного мозга (КМ) в качестве консолидации достигнутого эффекта и длительным поддерживающим лечением интерфероном-а (ИНФ-а). Применение интенсивных программ химиотерапии и трансплантации аутологичных или аллогенных стволовых клеток у больных ММ позволило существенно увеличить частоту достижения полных ремиссий (ПР) и продолжительность жизни больных. Чувствительность стандартных методов оценки эффективности лечения ММ (морфологическое исследование костного мозга и иммунохимическое исследование сыворотки крови и мочи) оказалась недостаточной в связи с существенной редукцией опухолевой массы. Появилась необходимость в дополнительном применении более чувствительных методов детекции минимальной резидуальной болезни (МРБ).
Одним из методов, обладающих достаточно высокой чувствительностью для обнаружения опухолевого клона и отслеживания в динамике остаточных миеломных клеток, является полимеразная цепная реакция (ПЦР). В основе оценки клональности и мониторинга МРБ при ММ лежит биологическая особенность лимфоидной ткани, отличающая ее от любой другой наличием в геноме каждого лимфоцита уникально перестроенного гена тяжелых цепей иммуноглобулинов (IgH). ПЦР-анализ в подавляющем большинстве случаев дает возможность маркировать опухолевый клон по таким уникальным перестройкам. Метод ПЦР позволяет определить остаточные опухолевые клетки с высокой чувствительностью. Большим преимуществом данного подхода является также возможность не только качественной, но и полуколичественной или количественной оценки опухолевого клона.
Использование метода ПЦР для определения минимальной резидуальной болезни способствует более полной оценке результативности режимов химиотерапии. Клиническая значимость мониторинга МРБ в настоящее время достоверно показана для острых и хронических лейкозов. Так в частности, результаты молекулярных исследований при данных заболеваниях широко используют для прогнозирования клинико-гематологических рецидивов и определения показаний к возобновлению или смене специальной терапии. Роль мониторинга МРБ у больных ММ пока остается неопределенной. Кроме того, недостаточно изучены биологические особенности опухоли. Именно эти нерешенные вопросы послужили поводом для проведения нашего исследования.
Цель исследования:
Разработка методов оценки эффективности лечения множественной миеломы с использованием высокочувствительных индивидуальных ПЦР-систем для тестирования опухолевого клона.
Задачи исследования:
Разработать метод детекции клональных перестроек генов тяжелых цепей иммуноглобулинов у больных парапротеинемическими гемобластозами, основанный на обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции.
Определить нуклеотидную последовательность фрагментов, соответствующих клонально перестроенным вариабельным регионам генов иммуноглобулинов и проанализировать их на наличие мутаций.
Определить частоту обнаружения клональных перестроек генов тяжелых цепей иммуноглобулинов у больных парапротеинемическими гемобластозами и изучить характер использования семейств VH-генов.
Создать индивидуальные пациент-специфичные ПЦР-системы для тестирования опухолевого клона и провести с их использованием динамическое исследование резидуальной болезни в ходе лечения множественной миеломы.
Сравнить информативность исследований перестроек генов иммуноглобулинов в образцах костного мозга и периферической крови.
Оценить прогностическую значимость выявления остаточной популяции опухолевых клеток в образцах лейкоконцентратов.
7. Определить этапы селекции больных множественной миеломой в ходе проведения интенсивной химиотерапии и провести анализ эффективности лечения на различных этапах.
Научная новизна:
Установлено соответствие частоты встречаемости различных семейств VH-генов у больных множественной миеломой с частотой их использования в нормальном В-клеточном репертуаре.
Детально охарактеризованы и представлены в GenBank NCBI нуклеотидные последовательности клонально перестроенных VH-генов у 38 больных множественной миеломой.
Отмечено частое использование вариабельного сегмента VH1-69.
Показана высокая стабильность структуры перестроенных генов тяжелых цепей иммуноглобулинов при развитии рецидива множественной миеломы и на разных стадиях заболевания.
Установлено, что отсутствие сывороточного парапротеина у больных с миеломой Бенс-Джонса и несекретирующей формой миеломы обусловлено возникновением аномальных стоп-кодонов и frameshift-мутаций.
Практическая ценность:
Доказана целесообразность использования в качестве молекулярного маркера опухоли у больных парапротеинемическими гемобластозами клональных перестроек генов тяжелых цепей иммуноглобулинов.
Созданы высокочувствительные, индивидуальные пациент-специфичные ПЦР-системы для мониторинга минимальной резидуальной болезни у пациентов с множественной миеломой.
Определены этапы селекции больных в ходе проведения интенсивной химиотерапии и показаны основные причины снятия пациентов с высокодозных программ лечения множественной миеломы.
Продемонстрированы различные методические подходы, использованные для повышения чувствительности детекции минимальной резидуальной болезни.
Положения, выносимые на защиту:
Клональная реаранжировка генов тяжелых цепей иммуноглобулинов методом обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции выявлена у 90% первичных больных парапротеинемическими гемобластозами.
Характер использования генов вариабельного региона в исследуемой группе соответствует частоте использования VH-генов в нормальном репертуаре В-клеток.
Степень гомологии с терминальными VH-генами составляет 74,2%-96%, что свидетельствует о прохождении соматического гипермутирования.
Клонально перестроенный ген IgH в опухолевых клетках у больных ММ отличается высокой стабильностью на разных стадиях болезни и при развитии рецидива.
Созданы высокочувствительные, индивидуальные пациент-специфичные ПЦР-системы для мониторинга минимальной резидуальной болезни у пациентов с множественной миеломой
После курсов «VAD» и циклофосфана в высоких дозах у 100% больных в костном мозге обнаруживаются остаточные опухолевые клетки. После курса «EDAP» молекулярный маркер выявляется у 77,8%, после аутотрансплантации стволовых клеток крови - у 67% больных.
В лейкоконцентратах опухолевые клетки с клональными перестройками генов тяжелых цепей иммуноглобулинов обнаружены у 64% больных ММ.
