Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Материалы и методы 36
1.1 Использованные препараты 36
1.2 Лабораторные животные 37
1.3 Штаммы микроорганизмы 37
1.4 Определение противоопухолевой активности рБТШ+ЛПС 39
1.5 Метод оценки взаимодействия рБТШ+ЛПС с TLR2 и TLR4 41
1.6 Метод количественного определения содержания ЛПС в рекомбинантном белке теплового шока-70 (ЛАЛ-тест) 41
1.7 Методы определения действия рБТШ+ЛПС на элементы врожденного иммунитета 43
1.8 Метод проточной цитометрии 45
1.9 Метод иммуноферментного определения аутоантител 46
1.10 Методы статистической обработки результатов 46
ГЛАВА 2. Антиинфекционная активность рекомбинантного белка теплового шока на экспериментальных моделях бактериальной и вирусной инфекций 48
2.1 Влияние рБТШ+ЛПС на развитие у мышей бактериальной инфекции, вызванной представителями семейства Enterobacteriaceae и семейства Streptococcaceae 49
2.2 Изучение защитного действия рБТШ+ЛПС при заражении мышей вирусом гриппа птиц (H5N2) 52
2.3 Протективная активность рБТШ+ЛПС при разных схемах иммунизации 54
2.4 Влияние примеси ЛПС на протективную активность рекомбинантного белка теплового шока-70 57
ГЛАВА 3. Влияние РБТШ+ЛПС на функцию дендритных клеток, лимфоцитов и синтез цитокинов. доказательство взаимодействия с tlr2 и tlr4 61
3.1 Влияние рБТШ+ЛПС на активацию дендритных клеток 61
3. 2Взаимодействие рБТШ+ЛПС с человеческими Толл-подобными рецепторами (TLRs) 67
3.3 Влияние рБТШ+ЛПС на цитотоксическую активность и иммунофенотип мононуклеарных лейкоцитов периферической крови здоровых доноров — 68
3.4 Спектр цитокинов в сыворотке крови мышей, получавших рБТШ+ЛПС 72
ГЛАВА 4. Изучение противоопухолевой активности препарата рБТШ+ЛПС 81
ГЛАВА 5. Изучение безопасности рБТШ+ЛПС в доклинических исследованиях на мышах 86
5.1 Изучение синтеза аутоантител при иммунизации животных рБТШ+ЛПС 86
5.2 Исследование острой токсичности препарата рБТШ+ЛПС
6. Заключение 91
7. Выводы 100
8. Список литературы
- Определение противоопухолевой активности рБТШ+ЛПС
- Изучение защитного действия рБТШ+ЛПС при заражении мышей вирусом гриппа птиц (H5N2)
- 2Взаимодействие рБТШ+ЛПС с человеческими Толл-подобными рецепторами (TLRs)
- Исследование острой токсичности препарата рБТШ+ЛПС
Определение противоопухолевой активности рБТШ+ЛПС
Иммунологические функции БТШ, по мнению авторов их определивших, были обнаружены случайно, поскольку непосредственное изучение влияния на иммунную систему хорошо известных и охарактеризованных к тому времени белков-шаперонов не входило в задачи проводимых исследований [142].
Итак, при изучении иммуногенности перевиваемых опухолей было замечено, что инбредные мыши, предварительно иммунизированные облученными сингенными опухолевыми клетками, впоследствии становились устойчивыми к прививке жизнеспособных опухолевых клеток [137, 138]. Авторы пришли к выводу: (1) опухоли иммуногенны в сингенном хозяине, что продемонстрировано для широкого спектра новообразований, включая опухоли, вызванные облучением и канцерогенами, а также спонтанные; (2) противоопухолевый иммунитет специфичен для каждой индивидуальной опухоли, потому что мыши были невосприимчивы только к опухоли, клетки которой использовали для иммунизации. Перекрестная реактивность во многих случаях наблюдалась, но иммунитет был значительно слабее [54].
Все эти находки повлекли за собой поиск опухолеспецифических антигенов (ОСА), обуславливающих в этой модели иммуногенность и вызывающих иммунитет к перевиваемой опухоли. В рамках поиска на первом этапе проводилось сравнение опухолевого и выделенного из соответствующей здоровой ткани материала с помощью электрофореза с высоким разрешением, за которым следовало изучение полученных образцов с помощью поликлональных и моноклональных антител. Однако никаких ОСА найдено не было [38, 105].
Иной взгляд на проблему идентификации ОСА состоял в использовании для поиска их основного свойства, а именно способности вызывать резистентность к перевиваемой опухоли. В этих исследованиях опухолевый материал сначала фракционировался с помощью обыкновенной гель-хроматографии. Полученные таким образом фракции использовали для иммунизации животных. В случае подтверждения их способности создавать противоопухолевый иммунитет, фракции подвергались дальнейшему разделению до тех пор, пока не получался относительно чистый препарат. Использование такого подхода привело к идентификации ряда иммуногенных молекул, выделенных из различных гистологических источников опухолевого происхождения. Исследованные опухоли варьировали от практически неиммуногенных (опухоли яичка, саркома Льюиса) до высокоиммуногенных (меланома, карцинома почки). Довольно неожиданным для исследователей оказалось то, что все охарактеризованные молекулы относились к семействам БТШ70 и БТШ90, включая gp96 (семейство БТШ90) и кальретикулин [26].
Поскольку использованные для иммунизации препараты БТШ не отличались по своим характеристикам от аналогичных препаратов БТШ неопухолевого происхождения, объяснить механизм их иммуногенности было довольно затруднительно [135].
Между тем, оставалась возможность существования низкомолекулярных опухолевых антигенов, которые не могли быть определены электрофорезом, но вполне могли быть ассоциированы с БТШ, и, таким образом, придавать иммуногенность препаратам БТШ [139, 140]. Это предположение в дальнейшем было подкреплено данными о наличии в очищенном препарате gp96 широкого спектра ассоциированных с этим белком пептидов [93] и данными о потере препаратом БТШ70 исследуемой иммуногенности при отмывке от ассоциированных низкомолекулярных пептидов [157].
Проведенные исследования структуры БТШ обеспечили теоретическое обоснование их пептид-связывающей активности. Так, наличие пептид-связывающей активности было показано для Dnak (семейство БТШ70) и gp96 [127, 174]. Наряду с этим исследовали БТШ90 - цитозольный аналог gp96, в структуре которого выявлено наличие сразу двух субстрат-связывающих сайтов [165]. Стало очевидным, что наблюдаемая для препаратов БТШ иммуногенность обусловлена антигенными пептидами, связанными с БТШ [97]. Показано, что очищенные препараты БТШ70 и БТШ90 из цитозоля, а также gp96 и кальретикулин из эндоплазматического ретикулума (ЭПР), при иммунизации вызывают антиген-специфический клеточный иммунитет [25, 26]. Более того, было продемонстрировано, что иммунизация препаратами gp96, полученными из клеток, экспрессирующих минорный Н-антиген гистосовместимости, вызывает CTL-ответ на этот антиген [17, 18]. Выявлено, что в инфицированной вирусом культуре с молекулой gp96 может быть ассоциирован вирусный эпитоп, отсутствующий в препаратах gp96, выделенных из неинфицированной контрольной культуры [109]. Все эти данные свидетельствуют о важной роли БТШ в представлении антигенов различного происхождения.
Функции антигенпредставления посредством БТШ, по-видимому, универсальны для большинства организмов. Об этом свидетельствует возможность использования для иммунизации ксеногенных БТШ, и возможность воспроизведения комплексов с антигенными пептидами in vitro, а также высокая эффективность антигенпредставления с помощью БТШ [129]. Так, БТШ-пептидные комплексы (БТШ-ПК) могут быть воспроизведены in vitro соединением исследуемого пептида с БТШ70, gp96 или кальретикулином [26]. Такие комплексы в той же степени иммуногенны, что и комплексы, образующиеся in vivo. Например, в исследованиях Blachere с соавт. gp96- и БТШ70-пептидные комплексы были воспроизведены in vitro, а также продемонстрирован специфичный CD8+ CTL-ответ на эти ассоциированные с gp96 и БТШ70 пептиды [34]. В частности, в этих исследованиях установлено, что всего несколько нанограмм пептида в составе комплекса с БТШ обладают значительной иммуногенностью. Иммуногенная доза пептида, ассоциированного в комплексе с БТШ, составила в данных экспериментах 1-2 нанограмма. Связанные же в комплексы с другими белками, к примеру с альбумином, эти пептиды не вызывали иммунного ответа.
В последние годы показано, что комплексы, состоящие из БТШ и антигенных пептидов, активно поглощаются профессиональными АПК и презентируются молекулами главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) I класса [19, 23]. Чтобы надлежащим образом объяснить крайнюю эффективность процесса поглощения БТШ, было постулировано его действие через рецептор, идентифицированный позже как CD91 [19, 23, 25]. В частности, установлено, что комплексы пептидов с БТШ70, БТШ90 и кальретикулином поглощаются ДК и макрофагами, после чего антигены процессируются и представляются на поверхности молекулами ГКГС I класса. Предположительно, процессинг БТШ-связанных пептидов осуществляется через CD91 рецептор и требует участия протеосом и связанных с процессингом антигенов транспортных систем, использующихся в классическом пути представления эндогенных антигенов [23].
Рецепторы для белка теплового шока Иммунологические свойства БТШ были обнаружены в связи с их способностью вызывать противоопухолевый иммунитет [137, 138]. Это свойство, впервые описанное для белка-резидента ЭПР — gp96, впоследствии было обнаружено также для БТШ70, БТШ90 [157], кальретикулина [25], а также для БТШ110 и БТШ 170 [162]. Показано, что антигенная специфичность БТШ обусловлена не самой молекулой шаперона, а связанными с ней молекулами опухолеспецифических пептидов. Механизм, посредством которого БТШ-ПК вызывают противоопухолевый и противовирусный иммунитет, основывается на рецептор-опосредованном взаимодействии БТШ-ПК с АПК. Взаимодействие БТШ с рецепторами на АПК влечет за собой два основных последствия:
Изучение защитного действия рБТШ+ЛПС при заражении мышей вирусом гриппа птиц (H5N2)
Настоящий раздел работы был спланирован таким образом, чтобы исследовать противоинфекционную активность БТШ и проверить гипотезу, согласно которой активация TLR2 и 4 приведет к формированию невосприимчивости против широкого круга патогенов как бактериальной, так и вирусной природы [152]. Белок теплового шока был контаминирован ЛПС. Поскольку одной из задач исследования было оценить, как влияет примесь ЛПС на способность БТШ индуцировать протективный антиинфекционный иммунитет, то в дальнейшем мы будем называть препарат как сочетание рекомбинантного БТШ с ЛПС (рБТШ+ЛПС).
Ставилась также задача исследовать протективную активность рБТШ+ЛПС при разных схемах иммунизации.
В качестве референс-препарата использовали поликомпонентную бактериальную вакцину Иммуновак, содержащую лиганды для TLR1, 2, 4, 5, 6 и 9. Ранее было показано, что вакцина защищает от гетерологичных инфекций лабораторных животных и людей [5].
Для оценки протективного действия рБТШ+ЛПС использовали микроорганизмы разных таксономических групп - S. typhimurium, S. pneumoniae и адаптированный к мышам вирус гриппа птиц H5N2 (непатогенный для человека).
Изучение протективной активности рБТШ+ЛПС начали с экспериментов, в которых исследовали резистентность иммунизированных мышей к заражению S. typhimurium и S. pneumoniae.
Беспородным белым мышам массой 14-16 г внутрибрюшинной вводили разные дозы рБТШ+ЛПС, и через 24 часа заражали S. typhimurium или S. pneumoniae. Гибель животных учитывали ежедневно. Наблюдение проводили в течение 21 дня (срок развития летальной инфекции). Эффект оценивали, сравнивая динамику выживания в опыте и контроле по Гланцу.
Полученные результаты представлены в таблицах 1 и 2, в которых приведены протоколы опытов по изучению способности рБТШ+ЛПС защищать мышей от S. typhimurium и S. pneumoniae. Нами было показано, что однократная иммунизация рБТШ+ЛПС в дозе 100 мкг/мышь формировала быструю защиту (дни) против S. typhimurium и S. pneumoniae.
Таким образом, однократное введение рБТШ+ЛПС создает быструю (через 48-72 ч) защиту против разных по своей антигенной структуре бактерий. Защитный эффект проявляется замедлением гибели иммунизированных животных и сохранением в живых части животных в те сроки, когда в контроле гибнут 90-100% особей.
Вакцина Иммуновак создавала защиту против S. typhimurium, но не предупреждала развитие инфекции, вызванной S. pneumoniae. Отсутствие протективного эффекта в последнем случае мы связываем с тем, что была испытана только одна доза препарата, которая не стимулировала врожденный иммунитет. Таблица 1 Выживаемость мышей, иммунизированных внутрибрюшинно однократно рБТШ+ЛПС, при заражении S. typhimurium
Специальные исследования были проведены, чтобы выяснить, можно ли использовать рБТШ+ЛПС в лечебных целях. С этой целью препарат вводили через 24 часа после заражения, т.е. врожденный иммунитет дополнительно активировали на фоне развивающейся инфекции. Мы использовали разные схемы и дозы препарата: 10 мкг/мышь однократно или трехкратно с интервалом 24 часа, 100 мкг/мышь однократно или трехкратно с интервалом 24 часа и 200 мкг/мышь однократно. Препарат вводился через 24 часа после заражения S. typhimurium. Установлено, что ни одна из выше приведенных схем иммунизации не защищала животных от смертельного исхода инфекции, вызванной S. typhimurium (табл.3). Таблица З
Индукция устойчивости мышей к заражению 79 LD5o S. typhimurium при внутрибрюшинном введении рБТШ+ЛПС через 24 часа после заражения В отдельном эксперименте изучали протективную активность рБТШ+ЛПС против непатогенного для человека вируса гриппа птиц H5N2, адаптированного к мышам. Животных однократно иммунизировали двумя дозами рБТШ+ЛПС: 100 мкг/мышь и 400 мкг/мышь и через 24 часа заражали 10 LD5o вируса гриппа птиц H5N2 (табл.4). Обе дозы препарата оказались эффективными и защищали 70% и 80% мышей при 100% гибели животных в контроле на 6 день опыта (р 0,05).
Таким образом, в предварительных экспериментах была выявлена способность рБТШ+ЛПС создавать быструю, но непродолжительную защиту у мышей против бактериальных патогенов S. typhimurium и S. pneumoniae типа 3 и вируса гриппа птиц H5N2. Следовательно, на примере рБТШ+ЛПС получено экспериментальное подтверждение гипотезы, согласно которой активация TLRs может создавать защиту против патогенов разных таксономических групп. В данном случае против вируса гриппа H5N2 и бактерий, принадлежащих к роду Salmonella и роду Streptococcus. 2.3 Протективная активность рБТШ+ЛПС при разных схемах иммунизации
Задачей исследования было определить наиболее эффективную схему и дозу иммунизации рБТШ+ЛПС, при которой формировалась как быстрая, так и длительная защита.
Протективная активность рБТШ+ЛПС была изучена при заражении мышей 125 LD5o S. typhimurium. Использовали различные схемы иммунизации препарата (табл.5). Показано, что наиболее эффективной дозой рБТШ+ЛПС при 3-х кратном введении была 10 мкг/мышь. Она защищала 50% животных на протяжении всего опыта — 21 день наблюдения (р 0,05). При однократной инокуляции препарата эффективная доза составила 100 мкг/мышь. Она защищала 70% мышей на 5 день эксперимента при 90% гибели животных в контроле (р 0,05).
Таким образом, выявлено, что рБТШ+ЛПС при многократной иммунизации малыми дозами создает быструю (через 48-72 ч) и длительную (в течение 21 дня) защиту от S. typhimurium, в то время как при однократном введении формируется быстрая, но непродолжительная защита.
В следующем опыте использовали несколько схем для иммунизации белых беспородных мышей рБТШ+ЛПС: 10 мкг/мышь и 100 мкг/мышь трехкратно через 2 дня, 10 мкг/мышь и 100 мкг/мышь трехкратно через 1 день, 10 мкг/мышь и 100 мкг/мышь пятикратно ежедневно, 100 мкг/мышь однократно. Через 24 часа после последней иммунизации в каждой группе животных заражали 316 LD50 S. typhimurium. Как видно из таблицы 6, все выбранные схемы иммунизации и дозы рБТШ+ЛПС оказались эффективными в ранние сроки инфекции, в то время как на 21 день наблюдения защита не сохранялась.
2Взаимодействие рБТШ+ЛПС с человеческими Толл-подобными рецепторами (TLRs)
В настоящее время некоторыми исследователями показано, что БТШ, расположенные на поверхности опухолевых клеток, активируют эффекторные клетки врожденного иммунитета и в ряде случаев способствует лизису опухолевых клеток, маркерами которых они являются [62, 63, 106, 121, 128].
В нашем исследовании противоопухолевую активность препарата рБТШ+ЛПС изучали на мышах-самцах линии С57В1/6 и СВА массой 22-24 г. Мышам подкожно перевивали меланому В16 и карциному яичников. Эти опухоли характеризуются агрессивным ростом, а меланома В16 и высоким метастатическим потенциалом.
Опухоли перевивали подкожно в область подмышечной впадины (меланома В16) и в спину справа и слева (карцинома яичников) в объеме 0,2 мл суспензии с соотношением физиологический раствор/опухолевая ткань 10:1. Противоопухолевый эффект оценивали по объему и торможению роста опухоли (ТРО).
В таблице 17 представлены результаты первого опыта по изучению влияния препарата рБТШ+ЛПС на рост опухоли меланомы В16. Рекомбинантный БТШ+ЛПС вводили внутрибрюшинно за 24 часа до перевивки опухоли и через 24 и 72 часа после трансплантации опухоли. Выявлено, что препарат в дозе 100 мкг/мышь не ускорял появление опухоли, в то время как доза 400 мкг/мышь вызывала ускорение роста опухоли. В опытных группах и контрольной опухоль визуализировалась на 9 день после трансплантации. В последующие дни наблюдений (15 и 24 день измерения) средний объем опухоли в контрольной группе составлял 1023 и 3646 условных кубических единиц (усл.ед. ). Эти объемы достоверно не отличались от объемов опухоли в опытных группах: 738 (100 мкг/мышь) или 1095 (400 мкг/мышь) усл.ед.3 на 15 день и 2449 (100 мкг/мышь) или 4698 (400 мкг/мышь) усл.ед. на 24 день наблюдения. Таким образом, противоопухолевую активность рБТШ+ЛПС при использованной схеме иммунизации выявить не удалось.
В следующем опыте мы изменили схему иммунизации (табл.18), рБТШ+ЛПС вводили 5-кратно внутрибрюшинно в дозах 20 мкг/мышь или 100 мкг/мышь через 1 час после перевивки опухоли, а также через 24, 48 часов, 9 и 16 дней. Обе дозы вызывали торможение роста меланомы В16. В опытных группах и контроле опухоль определялась на 11 день после трансплантации. На 14 и 21 дни эксперимента средний объем опухоли в контрольной группе составлял 2205 и 9644 усл.ед.3 соответственно. У иммунизированных животных объем опухоли был достоверно меньше: на 14 день наблюдения — 907 (100 мкг/мышь) или 968 усл.ед. (20 мкг/мышь), а на 21 день - 3327 (100 мкг/мышь) или 6765 усл.ед. (20 мкг/мышь). Таким образом, при 5-кратной иммунизации рБТШ+ЛПС значимо замедлял развитие опухоли меланомы В16. Торможение роста опухоли на 14 день опыта составило 59% (ЮОмкг/мышь) и 56% (20 мкг/мышь), а на 21 день -65,5% (100 мкг/мышь) и 30% (20 мкг/мышь).
В следующей серии экспериментов изучали влияние рБТШ+ЛПС (группа 1), смесь рБТШ+ЛПС с АТФ (группа 2), конъюгат БТШ-СА125 (группа 3), СА125 (группа 4, маркер рака яи4ников) на рост карциномы ЯИ4НИК0В (таблЛ9). Известно, 4ТО АТФ обладает противоопухолевой активностью, а белок теплового шока способен расщеплять АТФ. Поэтому решено было проверить, могут ли два этих вещества усиливать действие друг друга.
Рекомбинантный БТШ+ЛПС и смесь рБТШ+ЛПС с АТФ вводили внутрибрюшинно, а конъюгат БТШ-СА125 и СА125 - подкожно трехкратно с интервалом 2 недели. Через 7 дней после последней иммунизации имплантировали подкожно опухоль в дозе 106 клеток. В контроле и опытных группах опухоль визуализировалась на 15 день наблюдения. На 20 и 27 дни измерений средний объем опухоли в контроле (группа №5) составлял 9425 и 16380 усл.ед. . В опытных группах средний объем опухоли достоверно не отличался от контроля. Однако следует заметить, что рБТШ+ЛПС вызывал ТРО в пределах 44%, в то время как смесь рБТШ+ЛПС с АТФ и СА125 стимулировали рост опухоли у животных. В таблице 20 приведены результаты по влиянию рБТШ+ЛПС на рост карциномы яичников при 3-х (внутрибрюшинно через 24, 48 и 72 часа после перевивки опухоли) и 4-х (внутрибрюшинно за 5 суток до имплантации опухоли и через 24, 48 и 72 часа после) кратной схеме иммунизации. Как следует из таблицы, препарат вызывал ТРО, однако достоверной разницы между опытом и контролем выявлено не было.
Исследование острой токсичности препарата рБТШ+ЛПС
Изучение иммунотропных свойств рБТШ+ЛПС начали с экспериментов по заражению мышей летальными дозами S. typhimurium, S. pneumoniae и авирулентного для человека вируса гриппа птиц H5N2. Белым беспородным мышам вводили внутрибрюшинно однократно рБТШ-ЛПС в широком диапазоне доз (от 1 до 400 мкг/мышь) и через 24 часа заражали летальными дозами S. typhimurium, S. pneumoniae и вирусом гриппа птиц H5N2.
Было выявлено, что формировалась быстрая (через 48-72 ч), но непродолжительная защита при иммунизации дозами 100 мкг/мышь (S. typhimurium, S. pneumoniae) и 100 или 400 мкг/мышь (вирус гриппа птиц H5N2). Защита сохранялась до 10 дня наблюдения (40-50% выживших мышей в опыте) при гибели 80-100% животных в контроле на 4-6 сутки.
Для дальнейших экспериментов был выбран штамм S. typhimurium 415 f, поскольку сальмонеллезная инфекция является модельной инфекцией для мышей. Мы изучили способность рБТШ+ЛПС создавать защиту у животных от S. typhimurium (I25LD50) после трехкратной и однократной внутрибрюшинной иммунизации в дозах 10 и 100 мкг/мышь соответственно. Выявлено, что эффективная доза препарата при трехкратном введении составила 10 мкг/мышь. Она защищала 50% животных на протяжении всего опыта - 21 день наблюдения (р 0,05). При однократной инокуляции препарата эффективной дозой оказалась 100 мкг/мышь. Она защищала 70% мышей на 5 день эксперимента при 90% гибели животных в контроле (р 0,05). Таким образом, установлено, что рБТШ+ЛПС создает не только быструю (через 48-72 ч), но и длительную (21 день) защиту от S. typhimurium.
На следующем этапе работы важно было оценить, как влияет примесь ЛПС в препарате на защитные эффекты, полученные in vivo. Для решения данной задачи мы остановились на двух схемах иммунизации рБТШ+ЛПС, а именно: 10 мкг/мышь трехкратно ежедневно и 100 мкг/мышь однократно. Чтобы определить или исключить роль примеси ЛПС в препарате, белок денатурировали методом кипячения [42] или связывали ЛПС с помощью добавления к рБТШ+ЛПС полимиксина В (РМВ) по методу Н. Tsuzuki. Инактивацию ЛПС определяли в ЛАЛ-тесте. Нами было установлено, что 1 мг/мл БТШ содержал 5320 ЕЭ/мл, а после добавления РМВ в дозах 0,266 мкг и 2,66 мкг — 273 и 34 ЕЭ/мл соответственно. В качестве референс-контроля использовали коммерческие препараты РМВ (Fluka BioChemika, Denmark) и ЛПС Е. coli (SIGMA, Germany).
Мышей иммунизировали (1) рБТШ+ЛПС; (2) рБТШ+ЛПС, в котором белок теплового шока был денатурирован методом кипячения [рБТШ+ЛПС(К)]; (3) рБТШ+ЛПС, в котором ЛПС был связан РМВ [рБТШ+ЛПС(РМВ)]; коммерческими препаратами (4) РМВ и (5) ЛПС Е. coli и через 24 часа заражали 63 LD50 S. typhimurium.
Показано, что рБТШ+ЛПС защищал мышей при однократной и трехкратной аппликации в дозах 100 мкг/мышь и 10 мкг/мышь соответственно (р 0,05). Однако степень защиты оказалась в 2 раза выше при трехкратном введении, чем при однократном введении препарата (80% выживших животных против 40% на 21 день наблюдения). Рекомбинантный БТШ+ЛПС, подвергавшийся кипячению, не защищал опытных животных также, как и коммерческие препараты: полимиксин В и ЛПС Е. coli. Рекомбинантный БТШ+ЛПС, в котором ЛПС инактивировали с помощью РМВ, защищал мышей только при трехкратной инокуляции в дозе 10 мкг/мышь (40% выживших животных, р 0,05), в то время как при однократном введении защита не формировалась.
По-видимому, формирование более выраженной защиты при иммунизации животных рБТШ+ЛПС можно связать с тем, что и БТШ и ЛПС являются лигандами для TLRs. Взаимодействуя одновременно с разными TLRs, эти вещества усиливают активацию врожденного иммунитета. На 21 день наблюдения у животных изучали сыворотку крови с целью определения титров антител к ЛПС S. typhimurium. Выявлено, что у всех выживших опытных мышей титр антител к ЛПС S. typhimurium был выше по сравнению с интактными животными (титр 1:200) и отмечался на уровне оставшейся живой контрольной мыши (титр 1:3200).
Появление в сыворотке высоких титров антител к ЛПС S. typhimurium свидетельствует о формировании адаптивного иммунного ответа на фоне активации врожденного иммунитета рБТШ+ЛПС.
Исследована способность рБТШ+ЛПС стимулировать эффекторные функции врожденного иммунитета. Для этого изучили, как влияет препарат на созревание ДК и цитотоксическую активность мононуклеарных лейкоцитов (МНЛ) периферической крови человека in vitro.
Однократная и трехкратная аппликация рБТШ+ЛПС приводила к активации врожденного иммунитета. Это подтверждалось следующими фактами. Исследование иммунофенотипа ДК выявило существенное увеличение экспрессии молекул CD80, CD86, CD83 и уменьшение маркера макрофагов F4/80, что свидетельствовало о созревании ДК под влиянием рБТШ+ЛПС.
Учитывая данные литературы о том, что БТШ связывается с TLRs, необходимо было определить, взаимодействует ли использовавшийся в нашей работе рБТШ+ЛПС с TLRs. Для определения специфичного связывания человеческих TLRs с исследуемым препаратом в работе использовали линии клеток эмбриональной почки человека 293, стабильно экспрессирующие hTLR4/MD2-CD14 и hTLR2/CD14 [14]. В качестве контроля служили клетки 293-null, не экспрессирующие TLRs. Нами показано, что рБТШ+ЛПС в широком диапазоне доз (от 0,1 до 10 мкг/мл) взаимодействовал с TLR2 и TLR4, экспрессированными на клеточных линиях 293 эмбриональной почки человека. Доказательством такого взаимодействия являлось изменение окраски среды, свидетельствовавшей об активации внутриклеточного ядерного фактора NF-kB. В контроле после добавления рБТШ+ЛПС к клеткам линии 293-null активации NF-kB не происходило.
На основании полученных результатов мы предположили, что рБТШ+ЛПС может индуцировать одновременно TLR2 и TLR4, что приводит к усилению эффекторных функций врожденного иммунитета. Механизм такой индукции свидетельствует о способности рБТШ+ЛПС опосредованно активировать внутриклеточный ядерный фактор NF-kB через взаимодействие с TLR2 и TLR4.
Изучение цитокинового профиля у мышей, иммунизированных рБТШ+ЛПС, выявило в ранние сроки увеличение синтеза IL-6, IFN-y, TNF-a. На фоне бактериальной инфекции, вызванной S. typhimurium, было отмечено повышение уровня IL-6, IL-12p70, IFN-y, TNF-a, однако пик этих цитокинов смещался во времени по сравнению с животными, получавшими только препарат. В то же время у мышей, иммунизированных рБТШ+ЛПС и зараженных S. typhimurium, отмечался менее выраженный пик провоспалительных (IL-6, TNF-a) и более выраженный пик регуляторных (IFN-y) цитокинов по сравнению с животными, зараженными только S. typhimurium.
Повышение регуляторных цитокинов IL-12p70 и IFN-y в сыворотках иммунизированных и/или зараженных мышей с учетом отсутствия динамики IL-4 может свидетельствовать об активации механизмов, поляризующих иммунный ответ по Th-І типу. Таким образом, мы полагаем, что с одной стороны рБТШ+ЛПС, вызывая повышение уровня провоспалительных и регуляторных цитокинов, балансирует иммунный ответ. С другой стороны, рБТШ+ЛПС на фоне бактериальной инфекции, вызванной S. typhimurium, снижает выброс IL-6 и TNF-a, предохраняя тем самым организм от «цитокиновой бури». Повышение регуляторного цитокина IFN-y на поздних сроках инфекции, вероятно, способствует защите организма хозяина посредством активации Т-клеточного звена иммунитета.
![Адреналинзависимая регуляция экспрессии белков теплового шока 70 кДа в лимфоидных клетках [Электронный ресурс]](/i/i/4357/199767.png "Адреналинзависимая регуляция экспрессии белков теплового шока 70 кДа в лимфоидных клетках [Электронный ресурс] Мурашко Дмитрий Александрович")
