Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ
О ВИЧ И СПОСОБАХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ВИРУСА С ОРГАНИЗМОМ
ХОЗЯИНА. 9
МЕСТО ВИЧ В КЛАССИФИКАЦИИ СЕМЕЙСТВА Retroviridae 9
МОРФОЛОГИЯ И ЖИЗНЕННЫЙ ЦИКЛ ВИЧ Ю
Структура вирионов и особенности жизненного цикла 10'
Репликативный цикл ВИЧ 12
Строение генома и вирусных белков 16
1.3 ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ВИРУСА И КЛЕТКИ 21
Иммунопатогенез ВИЧ 21
Иммунный ответ на ВИЧ 24
ЭПИДЕМИОЛОГИЯ ВИЧ/СПИД 26
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ РАЗВИТИЯ ИНФЕКЦИИ И ИХ ВЛИЯНИЕ НА ДИНАМИКУ ЗАБОЛЕВАЕМОСТИ НА ИНДИВИДУАЛЬНОМ И ПОПУЛЯЦИОННОМ УРОВНЕ 30
1.5.1 Влияние генетических факторов на развитие инфекции 30
HLA и ВИЧ инфекция 30
Хемокиновые рецепторы 31
Другие генетические механизмы 32
1.5.2 Полиморфизм одиночных нуклеотидов и генетическая
предрасположенность к развитию заболеваний 32
Вариант CCR5delta32 33
Вариант CCR2-64I 35
Вариант SDFl-3'A 36
1.6 ПОПУЛЯЦИОННО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АСПЕКТ 39
1.6.1 Географическое распределение протективных аллелей 39
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 42
СВЕДЕНИЯ ОБ ИССЛЕДОВАННЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ 42
ОЧИСТКА ДНК ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ 45
ГЕНОТИПИРОВАНИЕ 45
СЕКВЕНИРОВАНИЕ ПРОДУКТОВ ПЦР 47
БУФЕРНЫЕ РАСТВОРЫ 48
СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ 49
ИСПОЛЬЗОВАННОЕ В РАБОТЕ ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ И БАЗЫ ДАННЫХ 50
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 51
РАЗРАБОТКА ЛАБОРАТОРНОГО ВАРИАНТА ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛЛЕЛЕЙ CCR5delta32, CCR2-64I, SDFl-3'A МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОИ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ» 51
ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ОБРАЗЦОВ 54.
ПРОВЕРКА СООТНОШЕНИЯ ХАРДИ-ВАЙНБЕРГА В ИССЛЕДОВАННЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ. 55
ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ЧАСТОТНОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ' АЛЛЕЛЕЙ ГЕНОВ CCR5, CCR2, SDF1 В ИССЛЕДОВАННЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ. 57
Распределение частот аллеля CCR5delta32 в исследованных популяциях 57
Распределение частот аллеля CCR2-64Ib исследованных популяциях 59
Распределение частот аллеля SDF1-3 'А в исследованных популяциях 60
Распределение протективных генотипов в исследованных популяциях 61
3.5 СВЯЗЬ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ФАКТОРА С ЭПИДЕМИОЛОГИЕЙ
ВИЧ/СПИД 62
Оценка доли предрасположенных индивидуумов 63
Оценка влияния генетического фактора на динамику основных эпидемиологических показателей в изученных популяциях 64
Определение относительной опасности развития СПИД и смерти
в результате СПИД в исследованных популяциях 65
4. ВЫВОДЫ 67
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 67
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 70
ПРИЛОЖЕНИЕ 1 92
ПРИЛОЖЕНИЕ 2 94
СПИСОК, ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В РАБОТЕ СОКРАЩЕНИЙ.
CCR2 - рецептор класса СС хемокиновых-2 CCR5 - рецептор класса СС хемокиновых-5
Ct - Cycle threshold (пороговый цикл). На графике накопления ДНК: место пересечения кривой накопления продукта реакции и пороговой линии (threshold) HLA - Human Leukocyte Antigens (антигены тканевой совместимости человека) LTR - Long Terminal Repeat (длинный концевой повтор)
NCBI - National Center for Biotechnology Information (Национальный центр информации по биотехнологии США) NMT - N-миристоил трансфераза
SDF1 - фактор клеток стромы-1, лиганд для рецептора класса СХС хемокинновых-4 (CXCR4)
UNAIDS - программа Организации объединенных наций по ВИЧ/СПИД ВИЧ - вирус иммунодефицита человека ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ИН - интеграза КА - белок капсида ВИЧ
МА - матричный белок, составляющий внутренний слой оболочки ВИЧ НК - нуклеопротеин ВИЧ
OOP - относительная опасность развития СПИД в случае инфицирования ВИЧ ООС - относительная опасность смерти в результате СПИД в случае инфицирования ВИЧ
ОТ - обратная транскриптаза ПИК - преинтеграционный комплекс ПР - протеаза
ПЦР - полимеразная цепная реакция РНК - рибонуклеиновая кислота
РР - коэффициент относительного риска развития СПИД у ВИЧ-инфицированных PC - коэффициент относительного риска смерти в результате СПИД у ВИЧ-инфицированных СПИД — синдром приобретенного иммунодефицита
Введение к работе
Актуальность работы.
Первый случай СПИД был зарегистрирован в США в 1981 году. Через два года исследователям из института Пастера (Франция) удалось выделить вирус, принадлежащий семейству Retroviridae, который, по их мнению, был связан с развитием СПИД [30]. Впоследствии он получил название вируса иммунодефицита> человека (ВИЧ). Пандемия ВИЧ остается одной из самых серьезных проблем для здравоохранения в области инфекционных заболеваний. В мире насчитывается около 33 миллионов человек, живущих с ВИЧ/СПИД, и в день происходит примерно 6800 новых заражений [23, 25]. Общая иммуносупрессия, вызываемая инфекцией, повышает риск развития инфекционных и онкологических заболеваний и, в подавляющем большинстве случаев, приводит к летальному исходу через 10-12 лет после заражения [10, 157]. Тем не менее, динамика развития заболевания может варьировать на индивидуальном уровне. На предрасположенность человека к ВИЧ-инфекции влияет аллельное состояние ряда генов. В частности, к ним относятся гены рецепторов хемокинов CCR2 и CCR5 и ген хемокина SDF1. Наиболее достоверная ассоциация показана для аллелей CCR5delta32 (номер полиморфизма в базе данных NCBI - rs333), CCR2-64I (Ы799864) и SDFl-3'A (rsl801157) [61, 66, 93, 141, 147-149, 168]. Распределение таких аллелей в популяциях или выборках является одним из важных параметров, характеризующих эпидемиологические особенности, специфичные для данного региона или этнической группы. Сравнительный популяционно-генетический анализ - наиболее адекватный способ оценки вклада наследственной информации в формирование устойчивости и восприимчивости к-инфекционному фактору.
Цель исследования:
Охарактеризовать 10 популяций Российской Федерации и сопредельных государств с точки зрения генетической устойчивости к заражению ВИЧ и развитию СПИД.
Задачи исследования.
Разработать комплекс ПЦР-тест-систем для определения аллельного состояния генов CCR5, CCR2, SDF, ассоциированного с повышенной устойчивостью или восприимчивостью к ВИЧ-инфекции.
С помощью разработанных тест-систем установить частоты исследуемых аллелей у здоровых (без известной истории ВИЧ/СПИД) представителей 10 популяций.
Охарактеризовать особенности распределения аллелей и гаплотипов исследуемых полиморфных локусов.
Оценить относительную опасность развития СПИД и смерти в результате СПИД в исследованных популяциях.
Оценить влияние генетического фактора (в пределах исследуемых полиморфизмов) на динамику основных эпидемиологических показателей в изученных регионах.
Научная новизна работы.
Впервые проведен комплексный анализ полиморфизма генов CCR5, CCR2, и SDF1 в 10 популяциях, проживающих на территории России и сопредельных государств, и дана характеристика их генетической структуры. Оценена доля предрасположенных (не несущих ни одного протективного генотипа) индивидуумов. Оценена относительная опасность развития СПИД и смерти в результате СПИД в исследованных популяциях.
Практическая значимость работы.
Разработаны и внедрены в лабораторную практику тест-системы для определения аллелей CCR5delta32, CCR2-64I и SDFl-3'A методом ПЦР в режиме «реального времени». Тест-системы просты в использовании, экономичны, обладают высокой пропускной способностью и полностью адаптированы к производимому в Российской Федерации оборудованию. Это создает потенциал для использования данных тест-систем в клинической практике, в качестве инструмента для оценки предрасположенности человека к ВИЧ-инфекции, и динамики развития СПИД у ВИЧ-инфицированных.
Разработанные подходы могут быть использованы в учебном процессе при подготовке специалистов медицинского и биологического профиля.
Полученные данные могут служить теоретической основой при рассмотрении особенностей распространения ВИЧ-инфекции в исследованных популяциях, а так же при прогнозировании дальнейшего развития эпидемии.
Характеристика геномного полиморфизма в исследованных популяциях имеет общее популяционно-генетическое значение и служит вкладом в развитие фундаментальной науки.
Основные положения, выносимые на защиту.
Аллели CCR5delta32 CCR2-64I и SDFl-3'A распределены в исследованных популяциях неравномерно.
Распределение аллелей CCR5delta32, CCR2-64I и SDF1-3 'А носит закономерный характер и совпадает с основными путями миграции человеческих сообществ на территории восточно-европейского и азиатского регионов.
С точки зрения генетической устойчивости к ВИЧ, наиболее защищенными являются представители популяции поморов, ареал обитания которых близок к предполагаемому месту происхождения делеционного варианта CCR5delta32.
Вследствие широкого распространения протективных аллелей, связанных с замедленной прогрессией СПИД, наиболее генетически устойчивы к развитию заболевания представители центрально-азиатских популяций.
Примененный в работе вариант метода генотипирования «в реальном времени» обладает рядом преимуществ преред другими распространенными подходами и может быть рекомендован для использования в лабораторной практике.
Личный вклад автора.
Автору принадлежит решающая роль в разработке дизайна экспериментов, отработке методик и обобщении полученных результатов. Личный вклад автора в данном исследовании составляет около 80%.
Публикации.
Материалы диссертации изложены в 9 публикациях, в том числе 4 журналах, рекомендованных ВАК для опубликования научных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата и доктора наук.
Апробация диссертации.
Диссертация апробирована на заседании секции № 2 Ученого совета ГНЦ «Института иммунологии ФМБА России» от 14 декабря 2007 г. и рекомендована к защите на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности «14.00.36 - аллергология и иммунология».
Структура и объем работы.
Работа изложена на 100 страницах, состоит из введения, обзора литературы, раздела «Материалы и методы», раздела «Результаты и обсуждение», выводов и списка литературы. Работа включает 22 рисунка и 15 таблиц.
