Содержание к диссертации
С.
Список принятых сокращений 6
Введение 8
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
Введение 12
Комплексы цитозольных белков 13
1.2.1 Структурная организация SH2, SH3 и PDZ доменов 14
1.3 Комплексы мембранных белков 19
Комплексы, образуемые тетраспанинами 19
Комплексы молекулы CD4 23
1.3.2.1 Протоонкоген белковая тирозин киназаЬск 24
1.3.2.1.1 Ассоциация между CD4, Ьски цитоскелетом 25
Другие белки, взаимодействующие с цитоплазматической частью CD4 26
Латеральные ассоциации белка CD4 28
Тирозинфосфатаза CD45 и его ассоциация с CD4 рецепторным комплексом...28
Т-клеточный рецепторный комплекс (TCR) 29
1.3.2.4 Внеклеточные растворимые лиганды 31
1.3.2.4.1 Хемоаттрактантный фактор лимфоцитов IL-16 31
1.3.2.5 Белки, ассоциированные с CD4 в нелимфоидных клетках 32
1.4 Методы изучения белок белковых взаимодействий 32
Иммунопреципитация 33
Эпитопное маркирование (epitope tagging) 35
Метод вьшавливания глутатионтрансферазы (GST-pulldown) 36
Крупномасштабный подход: тандемная аффинная очистка 37
1.5 Флуоресцентные методы детекции белков 41
Постэлектрофоретическая окраска белков 42
Предэлектрофоретическая окраска белков 43
Дифференциальный гель электрофорез 44
1.6 Масс-спектрометрический анализ белков 46
1.6.1 Рїдентификация белков по масс-спектрометрическим данным 48
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 51
2.1. Материалы 51
Клетки и их источники 51
Антитела 51
Растворы, использованные в работе 52
Прочие реагенты и материалы, используемые в работе 53
2.2. Методы 55
Мечение флуоресцентными красителями 55
Электрофорез 56
Визуализация белков в геле с использованием Кумаси R-250 и SYPRO Red 56
Цитофлуориметрический тест 57
Проточная цитометрия 57
Конфокальная микроскопия 58
Выделение мембранных и цитозольных белков меченых клеток 58
Хлорофор-этанольная экстракция белков 58
Приготовление клеточного лизата 59
Приготовление преформированных комплексов антител 59
Иммунопреципитация 60
Иммуноблоттинг 61
Протеолиз белков в геле после электрофореза 62
Масс-спектрометрический анализ белков 62
Идентификация белков по танденмным масс-спектрам 63
Обработка результатов экспериментов 63
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 64
3.1. Разработка метода иммунопреципитации с использованием флуоресцентных
красителей 64
Определение чувствительности флуоресцентной детекции меченого белка 65
Мечение клеток аминореактивными флуоресцентными красителями 67
Флуоресцентное окрашивание клеточных поверхностных белков не влияло на их распознавание антителами 69
При мечении клеток флуоресцентными красителями, метка преимущественно связывается с белками 70
Иммунопреципитационный анализ клеточных поверхностных белков 71
3.2. Совместимость флуоресцентного иммунопреципитационного анализа с
последующими методами анализа 78
3.2.1. Масс-спектрометрическая идентификация иммуно-преципитированных белков. 78
3.3 Определение специфичности антител с помощью флуоресцентной
иммунопреципитации 82
3.4. Изучение надмолекулярных комплексов с помощью флуоресцентного
иммунопреципитационного анализа 88
3.4.1 Ко-преципитация белков ассоциированных с CD4 наблюдается при лизисе в
мягком не ионном детергенте Brij97 93
3.4.2. Масс-спектрометрическая идентификация белков, ассоциированных с CD4 96
3.4.3. Подтверждение существования СВ4-комплексов с помощью
иммуноблоттинга 100
3.4.4 Стехиометрия СТ)4-комплекса 102
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов 105
4.1 Разработка метода флуоресцентной иммунопреципитации 105
Использование флуоресцентного иммунопреципитационного анализа для идентификации специфичности антител к поверхностным антигенам клетки 111
Применимость флуоресцентного иммунопреципитационного анализа для изучения белковых комплексов 115
Выводы 122
Список цитируемой литературы 124
ПРИЛОЖЕНИЕ А 142
Список принятых сокращений
МкАт — моноклональное антитело
ПААГ — полиакриламидный гель
ФИПА — флуоресцентный иммунопреципитационный анализ
BCR - В-клеточный рецептор
BSA - бычий сывороточный альбумин
СВР - кальмодулин связывающий пептид
CD - кластер дифференцировки
Co-IP — коиммунопреципитация
DMSO — диметилсульфоксид
FITC - флуоресцеин-5-изотиоцианат
FRET — метод флуоресцентного резонансного переноса энергии
FSC - малое угловое светорассеяние
GST - глутатион-Б-трансфераза
Ig - иммуноглобулин
IP - иммунопреципитация
LC-ESI-MS/MS - тандемная масс-спектрометрия с электроспрей ионизацией с предварительным разделением пептидов методом жидкостной хроматографии
LP АР - лимфоцитарный-фосфатаза-ассоциированный фосфопротеин
МНС — главный комплекс гистосовместимости
MS - масс-спектрометрия
MS/MS - тандемная масс-спектрометрия
PBL - периферические лимфоциты крови
PBS - фосфатно-солевой буфер
PMSF - фенилметилсульфонилфторид
RAM — поликлональные кроличьи антитела против IgG мыши
RIP А — радио иммунопреципитационный анализ
slgM — поверхностный иммуноглобулин М
SDS - додецилсульфат натрия
SSC - боковое светорассеяние
ТАР — тандемная аффинная очистка
TEV — сайтспецифическая протеаза из вируса табачной мозаики
TCR/CD3 - Т- клеточный рецептор
32. ТХ-100 - неионный детергент тритон Х-100
3 3. WB - метод вестернблот анализа
Введение к работе
Актуальность темы диссертации
Хорошо известно, что во многих случаях белки выполняют свою функцию не самостоятельно, а при тесном взаимодействии с другими белками. Степень такого взаимодействия может быть различной. От кратковременной ассоциации до образования стабильных комплексов. Белковые комплексы контролируют многие клеточные процессы, начиная с транскрипции и заканчивая вирусной инфекцией.
Велико значение белок-белковых взаимодействий в иммунной системе. Распознавание чужеродного антигена, а также восприятие сигналов многочисленных лимфокинов происходит при участии соответствующих поверхностных рецепторов, представляющих собой комплексные структуры. Передача сигнала в цитоплазму лимфоцита также происходит с образование комплексов сигнальных молекул. Характеристика и идентификация белковых комплексов лимфоцитов человека имеет большое значение для понимания иммунных процессов, а знание состава и структуры этих комплексов дает информацию для направленной разработки новых фармакологических препаратов, контролирующих иммунный ответ.
Существует целый ряд методов, используемых для изучения белковых комплексов. Однако наиболее надежным методом доказательства существования белковых ассоциаций продолжает оставаться метод коиммунопреципитации, когда взаимодействующие белки выделяют из клеточного лизата с помощью иммобилизованных антител, распознающих эпитоп на одном из известных компонентов комплекса. Известны две модификации иммунопреципитации: более старая, использующая радиоактивную метку, а также более современная, в которой применяется биотиновая метка. Несмотря на широкую распространенность последнего метода, он имеет ряд недостатков, главный из которых состоит в его принципиальной несовместимости с масс-спектрометрическим анализом.
Это является очень серьезным недостатком, поскольку в эпоху бурного развития протеомики именно масс-спектрометрия становится решающим методом при идентификации различных белков.
В связи с этим представляется актуальным поиск и разработка новых подходов для детекции белков в продуктах иммунопреципитации, а также систематическое изучение белковых комплексов, образуемых поверхностными антигенами лимфоцитов человека.
Цель работы
Целью данной работы являлось изучение структуры и состава надмолекулярных комплексов поверхностных рецепторов лимфоцитов человека.
Задачи исследования
1. Поиск новых подходов для детекции белков, выделяемых методом
иммунопреципитации. Разработка метода флуоресцентного иммунопреципитационного
анализа.
2. Изучение совместимости флуоресцентного иммунопреципитационного анализа с
последующей масс-спектрометрической идентификацией белков.
3. Оценка возможности использования метода флуоресцентного
иммунопреципитационного анализа для вьщеления и изучения белковых комплексов
поверхностных антигенов.
4. Выделение и масс-спектрометрическая идентификация белков, ассоциированных
с молекулой CD4.
Научная новизна
Впервые в качестве альтернативы радиоизотопам и биотиновой метке для регистрации белков в иммунопреципитатах нами было предложено использовать
ковалентные флуоресцентные красители. Показана совместимость предложенного метода с масс-спектрометрическим анализом.
Впервые проведено протеомное изучение комплекса мембранного белка CD4. Определены основные партнеры молекулы CD4 (CD45, CD71, Lck и LP АР). Впервые показана ассоциация CD4 с трансмембранным белком LP АР и белками цитоскелета. Сделана оценка количественного состава СЭ4-комплекса.
Теоретическая и практическая значимость работы
Настоящая работа выполнена в рамках программы фундаментальных исследований. Научная значимость настоящего исследования заключается в разработке метода флуоресцентного иммунопреципитационного анализа. Предложенный метод позволяет детектировать как мембранные, так и внутриклеточные белки и проводить их последующую масс-спектрометрическую идентификацию. Метод также позволяет изучать белок-белковые комплексы, образуемые поверхностными клеточными антигенами и делать количественные оценки их состава.
Основные положения, выносимые на защиту
Ковалентные флуоресцентные красители являются хорошей альтернативой использованию радиоизотопов и биотиновой метки при иммунопреципитации.
Иммунопреципитация с флуоресцентными красителями применима для изучения всех основных типов мембранных белков.
Иммунопреципитация с флуоресцентными красителями совместима с последующим масс-спектрометрическим анализом.
Флуоресцентный иммунопреципитационный анализ в совокупности с лизисом клеток в мягких неионных детергентах применим для изучения надмолекулярных комплексов поверхностных антигенов клетки.
Разработанный метод позволяет оценивать стехиометрию белковых комплексов.
Публикации
Результаты исследований были представлены на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, июнь 2005), на 31 -ом когрессе «FEBS» (Стамбул, Турция, июнь 2006), на VIII конгрессе РАКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, июнь 2007), на III российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, сентябрь 2007). Материалы диссертации изложены в 9 публикациях.
